免疫系统疾病的治疗和诊断的制作方法

专利名称：免疫系统疾病的治疗和诊断的制作方法
免疫系统疾病的治疗和诊断相关申请案本申请要求于2009年7月15日提交的美国临时申请号61/225，852的优先权。在先申请作为參考文献全文引入。
背景技术：
免疫系统保护人体不受病原体感染，细胞转化，以及物理/化学损伤。它的功能异常，无论是过度活化还是活化不足，都会导致不同的疾病。免疫系统功能异常可能由年龄老化、发育缺陷，疾病和医学治疗(例如化疗或免疫抑制)所导致。这需要治疗和诊断免疫系统疾病的药物和试剂。

发明内容
和方法。
mrlssspprgpqqlssfgsvdwlsqsscsgpthtprpadfslgslpgpgq tsgareppqa
vsikeaaassnlpapertmaalskepntlraprvrtaftm_eqvrtleavf_qhhaylsple
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lstgprglca mpqtgdaf (下划线aa.91-151/同源异型域)Hom-I 核酸序列(SEQ ID NO 9)
acctggccgccatgcqcctctcctcctccccacctcgtggcccgcagcagctctccagctttagctccgtggactggctctcccagagcagctgctcagggccgacccacacccccaggcctgccgacttctccctqaqgagcctccctggcccaggccagacatccggcgcccgggagccccctcaaqccgtcagcatcaaggaggccgccgggtcctcaaatctgcctgcgccggagaggaccatggccagattgaqtaaggagccaaataccttgcgggccccccgtgtccgcacagccttcaccatgaaacaqatccgcaccttggagggcgtcttccagcaccaccagtacctgagccctctggagcggaagaggctggccagggagatgcagctctcagaggtccagataaaaacctggtttcagaatcgccgcatgaaacacaaacggcaaatgcaggacccccagctgcacagccccttctcggggtctctccatgcgcccccagctttctactcaacgtcttctggccttgccaatggcctgcagctgctgtgcccttgggcacccctgtccgggccccaggctctgatgctgccccctggctccttctggggtctctgccaagtggcacaagaggccctggcatctgcgggagcttcctgctgcgggcagcctctggcgtcccacccccctaccccaggccggccttcgctgaqaccagccctgtccacgqqqccccqqqgcctgtgtgctatgccacagacgggggatg
本发明涉及利用Hom-I或其抑制剂或其激活剂治疗和诊断免疫系统疾病的材料下面所示的是Hom-I的多肽和核酸序列 Hom-I 多肽(SEQ ID NO 1)cattttgagg tacctggagg caaaqgttct aatacacata tttttttttt aataacacaa tcagcctccc atttttagta gtgatccgcc gaccctaaaa ttaggaagga tagagctttc gttttccagt tacaggtgtq aagcagaaaq taggctgtgc agggaaagca cccaccctcc tgactcaagg agcccctccc catacatgaa cagacaatac aaacccaccc aatttcactt ttttaaacat gacagaagcc cctagacaac
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caaaaaaaaa aaaaaaaa
(下划线编码区(ntl2 to 788，SEQ ID NO: 2)相应地，在ー个方面，本发明的特征在于ー种RNAi制剂，所述RNAi制剂含有第一链，所述第一链具有与编码Hom-I蛋白的基因ー个区域同源的第一核酸序列。RNAi制剂靶向所述基因或其5’ -非翻译区转录得到的mRNA。在一个实施方案中，第一序列包括UUCAG AAUCGCCGCAUGMACACAAACGG (SEQ ID NO :6) ,UCUACUCMC ⑶ CUUCUGGCCUUGCCAAU(SEQ ID NO: 7)，以及相应的 DNA 形式TTCAGAATCGCCGCATGAAAC ACAAACGG (SEQ ID NO :4)，TCTACTCAACG TCTTCTGGCCTTGCCAAT (SEQ ID NO :8)，RNAi制剂还可以包括第二链，所述第二链具有与第一序列互补的第二核酸序列。本发明的特征还在于ー种药物组合物，所述组合物包括刚刚提及的RNAi制剂。该組合物可以是ー种鼻腔喷雾剂或吸入組合物。上述制剂和组合物能够用于治疗患有免疫系统疾病或者处于免疫系统疾病风险中的患者的用途，例如炎症疾病，包括由病毒感染或化学试剂引起的急性呼吸窘迫综合征 (ARDS)。特別地，可以向所需要的个体施用有效量的RAM制剂或组合物。在一个实施方案中，RNAi制剂具有SEQ ID NO :6或7的核酸序列。所述个体可以是患有或疑似患有流行性感冒的个体，例如，SARS。在第二个方面，本发明的特征在于具有上述SEQ ID N0:4，6，7，或8的分离的核酸序列或其互补序列。本发明的特征还在于具有下面列出的分离的核酸序列(SEQ ID NO 3) 或其互补序列。5 ‘ cgaatgcagaggctcctgcgatggccccggagtgagtcccccagaggagccggattagggctgga ggcggccgagtcccccgagaggcccctcccgacattcccgcccccgcgcgccgctccccgggtcctccgcgtctctt tcccgggaaagcctccctcggttcctgcgcggccgcacagcctggacgcagcgcacgcgggcaccggcctgactctc ccaccccgaagcctgctcccaacctaagtccgccctgactctcccagcctgaagcctgctcgccctcgggtgtccgg gctgggcacaggcgccagcgtccccctggagaggagaggtcgcccggcacctcccaggacaggcccaagtgggagtgggaccctccxaccttcctgcagcctcggcccgcggggxggggggxtgggagagatgaaaggaggtgaccgatcccga accatcgcctctccattaaccagggcccgcagccccgcccctcccccagacatcgaggagccggggaggtgtgaacg gcctcctttgtgcctctgaatcgaaggcaattaggcgctgcttatctgggcattagccgtgtatgcaaaccgggctc ccgccccctcctcctgggcttataaacgccgccgcctggcgaggcccgaggtggatcctgcgcctggccagccccgc ctggccttccctccggcccacctggccgccじ‘在第三个方面，本发明的特征在于ー种降低个体炎症細胞(如巨噬細胞)水平或活性的方法。所述方法包括向需要的个体施用有效量的多肽的抑制剂，所述多肽包含序列 SEQ ID NO :1。在第四个方面，本发明的特征在于ー种通过向需要的个体施用有效量的多肽的抑制剂来降低个体体内前炎性細胞因子水平的方法，所述多肽包含序列SEQ ID NO :1。細胞因子的例子包括TNF-α，IL-I β，和IL6。在第五个方面，本发明的特征在于ー种治疗患有免疫系统疾病或者处于免疫系统疾病风险中的患者的方法。所述方法包括向需要的个体施用有效量的多肽的抑制剂，所述多肽包含序列SEQ ID NO :1。免疫系统疾病可以是炎症或自身免疫性疾病，例如ARDS。在一个实施方案中，个体患有或者疑似患有流行性感冒。在上述的方法中，抑制剂的例子包括抗体(如导致细胞生长的抗体，包括 anti-CD3)，反义核酸，RNAi制剂，以及其他的大分子或小分子化合物和自然发生的化合物， 它们都靶向于Hom-1。RNAi制剂可以具有核酸序列SEQ ID N0:4，6，7，或8。小分子化合物的例子包括泼尼松，依木兰，甲氨喋呤，骁悉，和离子霉素。大分子的例子包括PHA。在一个实施方式中，每种方法进ー步包括在施用之前或之后，确定从该个体获得的样品中Hom-I 的表达水平或活性，以确认Hom-I被抑制。在第六个方面，本发明的特征在于ー种提高个体体内炎症細胞(例如巨噬細胞) 水平或活性的方法。该方法包括向需要的个体施用有效量的包含序列SEQ ID N0:1或5的多肽，或其功能等同物，或编码多肽的核酸，或Hom-I的激活剂。激活剂的例子包括5-FU， D0X，放射，视黄酸，GM-CSF-IL4，白藜芦醇，鞣花酸，阿司匹林，水杨酸，大黄素和黄酮类化合物以及能够诱导Hom-I表达的这些物质的衍生物。在一个实施方案中，该方法进ー步包括在施用之前或之后，确定从该个体获得的样品中Hom-I的表达水平或活性，以确认Hom-I被催生。功能等同物是指与ー个常见多肽相似或者就是常见多肽衍生物的多肽，例如，具有ー个或多个点突变，插入，缺失，切断，融合蛋白或其組合的蛋白，大体上保留了常见多肽的能力，例如与LEF1/TCF的结合。在一个实施方式中，该多肽缺失ー个LEF1/TCF反式激活结构域。细胞增生症可以是ー个以LEF1/TCF介导的转录的异常激活为特征的病症。LEFl/ TCF介导的转录的异常激活是指这样ー种细胞状态，即以下面的实施例描述的方法或其它类似的方法检测吋，LEF1/TCF介导的转录异常地高。SEQ ID NO :5的功能等同物的例子包括非洲爪蟾(如Xom)、黒猩猩和猕猴的同源异型域。这些同源异型域序列列举在图1中。一般地，它们与 SEQ ID NO :5 至少有 30% (例如 40，50，60，65，70，75，80，85，90，or 95% )的同一性。例如，Hom-I的同源异型域与Xom的氨基酸序列有68%的同一性和85%阳性(类似)。在第七个方面，上述的核酸可以用于诊断免疫系统疾病的方法中，包括(1)細胞増殖性病症/癌症和( 炎症或自身免疫疾病。細胞増殖性病症的例子包括急性淋巴細胞性白血病(ALL)，慢性淋巴細胞白血病(CLL)，和急性粒細胞白血病(AML)。炎性或自身免疫疾病的例子包括骨髄增生异常综合征(MDS)，系统性红斑狼疮(SLE)，炎症性肠病(IBD)，类风湿性关节炎(RA)，和移植排斥反应。该方法包括从个体中获得生物样本；确定样本中編码含有SEQ ID NO :1的多肽的基因表达水平。如果表达水平低于第一个预定的水平，或没有表达，则可确定个体患有或者易于患上細胞増殖性病症/癌症(ALL，CLL，和AML)。如果表达水平高于第二个预定的水平，则可确定个体患有或者易于患上炎症或自身免疫疾病。 这样的预定水平能够从正常对照个体中获得。在第八个方面，本发明的特征在于控制患者治疗的方法。该方法包括确认患者处于或者需要ー个病症治疗，从该患者获取生物样本，确定样本中编码含有SEQ ID N0:1的多肽的基因表达水平。如果表达水平达到或超过预定值，则可确定患者适合于治疗。相反，如果表达水平低于预定值，该患者则不应接受治疗。该方法可以进一歩包括将表达水平与患者或医生或患者的照看者进行沟通。在一个实施方式中，该病症是细胞増殖性病症，或免疫系统疾病，例如上面提到的ALL，CLL, AML,和MDS。对于ALL，CLL, AML, MDS,它们中Hom-I的表达水平是低于预定值的，Hom-I可以作为指导选择有效治疗策略的标志；对于移植患者，Hom-I可以用于确保免疫抑制剂的足量使用；对于自身免疫疾病，例如SLE，Hom-I可以用于监测免疫抑制剂的使用。举个例子，如果使用免疫抑制剂使Hom-I的表达水平降低到了所述的值，则表明需要停止使用免疫抑制剂以避免淋巴组织增生性疾病，如淋巴瘤。在第九个方面，本发明的特征在于用于诊断上面所述的病症或控制患者的治疗的试剂盒。该试剂盒包括ー个或多个选自于以下组的试剂，所述组包括具有序列SEQ ID NO 1的多肽的特异性抗体，具有序列SEQ ID NO 1的多肽，扩增SEQ ID NO :2或3片段的PCR 引物对，以及在在严格的条件能与參考核酸的互补链杂交的核酸，所述參考核酸包含SEQ ID NO :2，3，或 5。严格杂交条件可由本领域技术人员适当地选择，例如，低严格条件可以被给定。低严格条件是，例如，42°C，2x SSC，和0. SDS，优选地，50°C，2x SSC，和0. 1 % SDS。高严格条件更优选和包括，例如，65°C，2x SSC，和0. 1% SDS0然而，除了温度外，其它的多个因素， 例如盐浓度也会影响杂交的严格性，本领域技术人员能够合适地选择这些因素来达到类似的严格性。本发明的ー个或多个具体实施方式
的详情列在附图和下面的描述中。根据描述、 图片和权利要求，本发明的其它的特征，目的和优点将是显而易见的。


图IA和图IB是Xom与Hom-I同源异型区域的氨基酸序列比对(图1A)和Hom-I， 预测的黒猩猩和猴的Hom-I的同源物的氨基酸序列比对，这表明Hom-I序列在灵长目动物中是保守的(图1B)。图2A和2B是Hom-I和它的缺失突变以及它们在体内与TCF4的相互作用的示意图，该相互作用通过免疫共沉淀western印记分析(图2A)利显示Hom-I与TCF4在HCTl 16 細胞中共定位的照片(图2B)确定。
图3A-3D是显示下述结果的示意图㈧由台盼蓝染色(图3A，左栏)，MTS分析 (图3A，中间栏)，和3H-胸腺嘧啶掺入法(图3A，右栏)确定的細胞活力；(B)用Hom-I shRNA使Hom-I的表达下调(图3B) ； (C) Hom-I的下调对于Nalml6增殖的影响，通过MTT分折(图3C，上栏)和細胞活力计数(图3C，下栏)进行測定；(D) Hom-I的下调导致cyclin Dl表达的升高，用tubulin的表达水平作为内參(图3D)。图4A-4D是照片或图表(图4C，右栏)，显示了下述结果㈧成体组织中的Hom-I 组织表达图谱，使用RT-PCR，GAPDH作为内參；(B)线性分析显示Hom-I主要在骨髄和淋巴系来源的細胞中表达，包括单核細胞，T細胞，B細胞和中性粒細胞；(C)B细胞发育中Hom-I 的表达增高；(D)Hom-I表达研究显示，除了 Nalml6，Hom-I在大多数来源于B細胞恶性肿瘤的肿瘤細胞中并不表达。图5A和5B是㈧照片显示了在新诊断的十个CLL患者中获得的外周血样本中， Hom-I的表达显著降低(图5A)和(B)图表显示在淋巴細胞白血病中，Hom-I的下调与相应的cyclin Dl的表达上升相关，使用GAPDH作为内參(图5A)。图6A-6B的图表(图6A和6C)以及照片(图6B和6D)显示(A)用编码GFP或 GFP-Hom-I的构建体转染野生型和p53敲除型HCTl 16細胞的转染率(图6A) ； (B)Hom-I对于荷瘤裸鼠(图6B)和肿瘤体积(图6C)的影响，其中在Hom-I转染的p53野生型和KO型細胞系中，肿瘤的生长被显著抑制。(数值是均值士SD，每组中η = 5,*P < 0.01，v. s载体转染細胞；(C)使用TUNEL染色来測定异种移植物肿瘤组织中的細胞凋亡(图6D)。
具体实施例方式本发明基干，至少部分基干，一个预料之外的发现，即Hom-I或它的抑制剂能够用于治疗或诊断各种各样的免疫系统疾病。如这里所描述的，Hom-I是ー个LET/TCF相关的因子，其通过破坏beta-连环蛋白 /LEF/TCF复合物的形成来抑制典型Wnt/beta-连环蛋白信号。功能获得和功能丧失的方法将Hom-I定义为ー种细胞生长负调节因子。Hom-I在正常造血細胞中是高表达的(并且在造血細胞成熟的过程中Hom-I的表达是被上调的)，但是在人类淋巴細胞白血病和在被 EBV感染的外周B淋巴細胞的永生化中，它的表达量显著降低。Hom-I表达的改变与相应的 Wnt/beta-连环蛋白/LEF/TCF靶向癌基因的改变有关，例如cyclin D1，这表明Hom-I在各种免疫疾病和血液系统恶性肿瘤的发病机制中起作用。相应地，本发明的特征在于治疗或诊断这些疾病的材料和方法。举个例子，包含编码Hom-I抑制剂的核酸序列的多聚核酸能够用于治疗炎症相关的疾病，例如ARDS。该抑制剂可以用作免疫抑制剂。核酸序列可以编码一个靶向Hom-I并抑制其表达或活性的小干扰RNA (例如RNAi制剂)。核酸是指DNA分子(例如cDNA或基因组DNA)，RNA分子(例如mRNA)，或DNA或 RNA类似物。DNA或RNA类似物可以由核苷酸类似物合成得到。核酸分子可以是单链或双链，但优选双链DNA。“分离的核酸”是指结构与天然发生的核酸或天然发生的基因组核酸片段不同的这样ー种核酸。因此，该术语涵盖了，例如，(a)具有天然发生的基因组DNA分子的部分序列，但是其两侧并不是编码序列，而该编码序列在天然发生的有机体的基因组中是位于所述分子部分的两侧的；(b)整合进载体或原核或真核細胞基因组中的核酸，以至于得到的分子与天然发生的载体或基因组DNA不同；(c) 一个单独的分子，如cDNA，基因组片段，由聚合酶链式反应(PCR)产生的片段，或限制性片段；以及(d) —个重组核苷酸序列，该序列是混合基因的一部分，例如，编码融合蛋白的基因。术语“RNAi制剂”是指ー个具有与靶标RNA有足够互补序列或能够引导RNA干扰的RNA (或其类似物)。例子包括能够用于制备RNA的DNA。RNA干扰(RNAi)是指下调靶标分子(例如目的基因，蛋白或RNA)的序列特异性或选择性过程。通常，干扰RNA( “iRNA”) 是ー个双链短干扰RNA(siRNA)，短发夹RNA(shRNA)，或单链小RNA(miRNA)，它们能够导致特异mRNA催化降解，也能用于降低或抑制基因表达。因此，使用RNAi降解RNA分子(例如在細胞内)同样也落入本发明的范围之内。 降解过程由具有酶活的RNA-诱导的沉默复合物(RISC)进行催化。具有“与靶标RNA有足够互补序列，例如Hom-I，来诱导RNAi”的RNA制剂的意思是RNA制剂具有能够足够诱发靶 RNA损坏的序列，该破坏是通过RNAi机制(例如RISC复合物)或过程实现。具有“与靶标 RNA有足够互补序列来诱导RNAi ”的RNA制剂的意思还有RNA制剂具有能够足够诱发靶RNA 翻译抑制的序列，该抑制是通过RNAi机制或过程实现。RNA制剂还具有与靶DNA序列编码的RNA充分互补的序列，以致靶DNA序列在染色体上被沉默。換言之，RNA制剂具有能够足够诱导转录基因沉默的序列，例如，下调靶DNA序列或其附近的基因表达，例如，通过诱导靶DNA序列或其附近的染色质结构发生改变。术语“RNA”或“RNA分子”或“核糖核酸分子” 是指核糖核苷酸的聚合物。术语“DNA”或“DNA分子”或“脱氧核糖核酸分子”是指脱氧核糖核苷酸聚合物。DNA和RNA可以通过天然合成(例如，分别通过DNA复制或DNA转录)。 RNA可以进行转录后修饰。DNA和RNA也可以通过化学合成。DNA和RNA可以是单链(例如，分别是ssRNA和ssDNA)或多链(例如，双链，比如说分别是dsRNA和dsDNA)。上面所提及的多聚核苷酸可以通过本领域已知的聚合物，生物可降解的微粒或微囊递送系统进行递送。另外的可以实施吸收多聚核苷酸的方法是使用脂质体，该脂质体可由常规方法制备。多聚核苷酸可以单独整合进这些递送载体中或者与组织特异性抗体一起整合。此外，可以制备由质粒或其它载体組成的分子偶联物，所述质粒或载体通过静电或共价カ与多聚L-赖氨酸相连。多聚L-赖氨酸与能够结合靶细胞受体的配体相结合 (Cristiano，et al.，1995，J. Mol. Med. 73 :479)。另外，组织特异性靶向可以通过使用本领域已知的组织特异性转录调节元件来实现。向肌肉，皮内，或皮下部位递送裸DNA(就是，没有递送载体)是来实现体内表达所使用的其它方法。在上面所提及的多聚核苷酸中，例如，表达载体，编码Hom-I抑制剂的核酸序列可操作地和一个启动子或增强子-启动子組合相连接。合适的表达载体包括质粒和病毒载体例如疱疹病毒，逆转录病毒，牛痘病毒，减毒痘苗病毒，金丝雀痘病毒，腺病毒和腺相关病 SiRNA,miRNA和asRNA(反义RNA)分子可以通过本领域已知的方法进行设计。具有足够同源性，以便于为特异性降解任何RNA提供序列特异性的SiRNA，miRNA和asRNA分子可以通过本领域中已知的程序进行设计，包括保留在Ambion，Inc.和Dharmacon，Inc网站上的那些程序。为优化siRNA，miRNA和asRNA序列的一些设计物种的系统测试可由本领域技术人员通过常规手段进行。当设计短干扰核酸分子吋，所需要考虑的因素包括生物物理，热力学，和结构因素，正义链中特定位置的碱基偏好以及同源性。这些考虑因素是本领域中众所周知的，能为设计本申请所描述的，例如用于鼻腔内递送至肺部的上述RNA分子提供指导。在ー个方面，上述的制剂或包含该制剂的組合物能够用于治疗个体的炎症-相关的疾病。炎性或炎症相关疾病以局部或全身性，急性或慢性炎症为特征。例子包括炎症性皮肤病(例如，皮炎，湿疹，过敏性皮炎，过敏性接触性皮炎，荨麻疹，皮肤坏死性血管炎，血管炎，过敏性血管炎，嗜酸性肌炎，皮肌炎，多发性肌炎，和嗜酸性筋膜炎)，炎症性肠病(例如，克罗恩病和溃疡性结肠炎)，急性呼吸窘迫综合征，重型肝炎，胰腺炎，过敏肺疾病(例如，过敏性肺炎，嗜酸性粒細胞性肺炎，迟发型超敏反应，间质性肺疾病或ILD，特发性肺纤维化，和ILD相关的类风湿关节炎)，哮喘，过敏性鼻炎。例子还包括自身免疫性疾病(例如，银屑病性关节炎，牛皮癣关节炎，系统性红斑狼疮，重症肌无力，幼年型糖尿病，肾小球肾炎，自身免疫甲状腺炎，強直性脊柱炎，系统性硬化症，多发性硬化症)，急性和慢性炎症性疾病(例如，全身过敏或超敏反应，药物过敏，昆虫叮咬过敏，移植排斥反应，移植物抗宿主疾病)，干燥综合征，人类免疫缺陷和痫毒感染。在另ー个方面，Hom-I的超表达和它的激活剂能够用于增强免疫力，以治疗细胞增殖类疾病，例如癌症(如脑，乳腺，前列腺，结肠，肾，卵巣，甲状腺，肺，和造血細胞癌症)，和肿瘤转移。“个体”指的是人类或非人类的动物。非人类动物的例子包括所有的脊椎动物，例如，哺乳动物，如非人灵长类(特別是高等灵长类)，狗，老鼠(例如，小鼠或大鼠)，豚鼠， 猫，和非哺乳动物，如鸟类，两栖动物，爬行动物等。在一个优选具体实施例中，个体是人类。 在另外ー个具体实施方式
中，个体是实验动物或适合作疾病模型的动物。“治疗”或“治愈” 是指向一个患有疾病的个体(例如ARDS或类似的呼吸道和肺部疾病)施用化合物或制剂， 旨在治愈，缓解，缓和，治疗，推迟，或减轻疾病，疾病症状，疾病继发病症，或对疾病的易感性。“治疗有效量”是指能够在治疗的个体中，例如前面所描述的，可以产生想要的医疗效果的化合物的量。该治疗方法可以在体内或体外实施，単独或者与其它的药物或治疗方法联合使用。本发明的組合物可以通过肠胃外，口腔，鼻腔，直肠给药，局部，或向颊进行施用。 这里所使用的术语“肠胃外”指的是皮下，皮内，静脉，肌肉，关节，动脉，滑膜，胸骨内，鞘内， 损伤区，或颅内注射，以及任何合适的输液技木。在ー个具体实施方式
中，上述的組合物可以用于治疗ARDS，以及类似或相关的呼吸道/肺部疾病。例子包括呼吸道或肺部感染，所述感染指的是任何細菌，病毒，真菌或寄生虫感染呼吸系统的任何部位。核酸分子可以以任何的水性载体、颗粒或溶液进行制备，以便于提供药学上适合于体内施用的組合物。制备液体溶液的方法对于本领域常规技术人员来说是已知的。优选地，液体溶液是水，生理学可接受液体溶液包含盐和/或缓冲液，例如磷酸盐缓冲液(PBS)， 或其它任何可接受的施用于动物或人类的液体溶液/表面活性剤。此类溶液对于本领域技术人员来说是已知的，包括，但不限于蒸馏水，去离子水，纯水或超纯水，盐水，PBS,以及包含常用缓冲液的溶液，该缓冲液与核酸是相容的。该组合物还可以包含氯化钠和葡萄糖或甘露醇，以使溶液等渗化。该组合物可以包含合适的辅助组分例如PH，滲透压和张カ调节剂。
对于通过上呼吸道的施用来说，该組合物被制备成ー种溶液，例如，水或等渗盐水，缓冲或无缓冲，或作为悬浮液，在鼻腔施用时以合适的浓度作为滴液或作为喷雾。优选地，该溶液或悬浮液相对于鼻腔分泌物是等渗的，具有差不多相同的PH，其范围，例如从 pH4. 0至7. 4，或者从pH6. 0至7. 0。缓冲液应该是生理学上相容的，包括，简单举例，磷酸缓冲液。例如，ー个代表性的鼻解充血剂被描述为缓冲到PH值约为6. 2 (Remington' s Pharmaceutical Sciences 16th edition,Ed. Arthur 0sol,page 1445 (1980))。本领域技术人员能够很容易为用于鼻腔和/或上呼吸施用的无害水溶液确定ー个合适的盐含量和 PH值。其它的合适的水性载体包括，但不限于Ringer' s溶液和等渗氯化钠。水性悬浮液可以包括悬浮剂例如纤维素衍生物，海藻酸钠，聚乙烯吡咯烷酮和黄蓍胶，和润湿剂，如卵磷脂。合适的防腐剂包括乙基和N-羟基苯水悬浮液。该组合物可以包括微量的本领域已知的聚合物，表面活性剤，或其它辅料。在该内容中，“微量”指的是没有可能影响或调节肺部細胞吸收核酸的辅助制剂或物质存在。可以为ー个特定的治疗应用选择气雾剂剂量，配方和运载系统，如例如在Gonda， 治疗药物运载系统中的关键评论，6 :273-313,1990中的描述。这里所使用的术语气雾剂是指任何ー种细水雾粒子的制备，可以以溶液或悬浮液形式，无论它是否使用推进剂来产生。 气雾剂可以用常规技术来生产，例如超声或高压处理。该剂型可以以水性溶液进行施用，所述水性溶液用于呼吸系统施用在药学上是可接受的。体积大于5μπι的颗粒在鼻腔内沉积。2至10 μ m的颗粒保留在肺里面，而小于 1 μ m的颗粒则被呼出。在优选实施方式中，化合物是通过吸入诸如液体颗粒和/或固体颗粒的形式来施用。合适的例子包括，但不限于，气雾剂，喷雾剂，雾，雾化样本和液滴。能够用于向人体施用的典型设备包括计量剂量吸入器(MDI)，雾化器，和滴注技木。该剂型根据一个或多个肺部疾病的症状或表现，以治疗，预防或诊断有效量施用。据信，核酸分子也可以作为干粉末，通过使用干粉吸入器进行施用，其中颗粒会溶解在肺的分泌物中。能够向患者的呼吸道施用颗粒的各种合适的装置和吸入方法在本领域中是已知的。雾化器能够从溶液或悬浮液中产生可被病人吸入的细雾。例如，见美国专利号5709202。組合物优选以一种能够递送有效剂量核酸的药代动力学类型进行递送。正如常规使用，本发明的核酸的“有效量”是这样的量，与对应的没有接受化合物或治疗制剂的个体相比，在施用过化合物或治疗剂的个体中，它能够治疗肺部疾病ー个或多个症状，扭转肺部疾病ー个或多个症状的发展，终止肺部疾病的ー个或多个症状的发展，预防肺部疾病ー个或多个症状发生，降低疾病的表现或诊断肺部疾病的ー个或多个症状。根据使用的具体药物或其組合，特定組合物剂型，施用的方式，年齢，体重，患者的情况，以及所治疗的症状的严重程度，药物实际有效量可以不同。ー个特定患者的剂量可以由本领域普通技术人员根据常规方法来确定，(例如，通过合适的、常规的药理操作指南)。在ー个具体实施例中，组合物以每20g体重3至400 μ g的剂量进行递送，上限剂量是每20g体重lg。在ー个优选实施例中，組合物以每20g体重50至100 μ g的剂量进行递送。在另ー个优选实施方式中，组合物以每公斤体重150nM的剂量进行递送。上述制剂中的一种或多种可以向动物(例如，人类)进行施用来调节Hom-I或其同源物的表达或活性。例如，医生可能在刚开始会规定ー个相对低的剂量，随后增加剂量直至获得ー个合适的响应。此外，据了解，对于任何ー个特定个体，其特别剂量水平取决于许多因素，包括所使用的特定化合物的活性，年齢，体重，总的健康状況，性別，个体的饮食，施用的时间，施用的方式，排泄率，任何药物的組合，以及将要调节的表达或活性的程度。治疗的效果可以通过测量靶基因mRNA的量(例如，用实时PCR)或由靶基因mRNA 编码的多肽的量(Western印记分析)来进行监測。正如本领域所公知的，患者的剂量取决于如上所述的许多因素。虽然剂量是不同的，但施用多聚核苷酸的优选剂量是约IO6至IO12 个拷贝属的多聚核苷酸分子。如果需要，该剂量可被重复施用。施用的方式可以是上面所列举的任何ー种。本发明的特征还是ー种诊断方法。基于来自于个体的检测样本中的Hom多肽(例如，抗体)或编码该多肽的核酸(例如，基因组DNA或mRNA)的缺失，可以检测该个体中的肿瘤细胞或倾向于肿瘤化的細胞。換言之，该多肽和核酸可以作为指示肿瘤細胞存在与否的标记。本发明的诊断和预后分析包括评估Hom多肽或核酸的表达水平的方法，以及确定 Hom多肽或核酸序列中的变异和突变的方法。Hom多肽或核酸在检测样本中的存在与否，其水平，可以通过从待测个体中获得检测样本，并将该检测样本与能够检测Hon多肽或核酸(例如mRNA或基因组DNA探针)的化合物或制剂相接触来进行评估。“检测样本”包括从个体中分离出来的组织，細胞和生物学液体，以及存在于个体体内的组织，細胞和液体。Hom基因的表达水平可以通过许多方法进行測定，包括測量由Hom基因编码的mRNA ；测量由Hom基因编码的多肽的量；或者測量由 Hom基因编码的多肽的活性。細胞中相对于Hom基因的mRNA的水平可以通过原位或体外形式进行确定。从检测样本中分离的信使RNA能够用于杂交或扩增分析，包括Southern或Northern分析，PCR 分析和探针阵列。一个优选的检测mRNA水平的诊断方法涉及将分离的mRNA与核酸探针接触，该探针能够与Hom基因编码的mRNA杂交。探针可以是全长的Hom核酸，例如SEQ ID NO :2或3或部分的核酸，例如至少10个核苷酸长，并且足够在严格条件下与Hom mRNA或基因组DNA特异性杂交的寡聚核苷酸。在ー个形式中，mRNA(或由其制备的cDNA)被固定在ー个表面上，与探针进行接触，例如，通过使分离的mRNA在琼脂糖凝胶上跑胶，并将mRNA从凝胶中转移到膜上，例如硝化纤维膜。在另外ー个形式中，探针被固定在表面上，mRNA(或cDNA)与探针进行接触，例如，在基因芯片阵列中。本领域技术人员能够适用已知的mRNA检测方法去检测Hom mRNA 的水平。由Hom基因编码的mRNA(或由其制备的cDNA)在样本中的水平可以利用核酸扩增来进行评估，例如通过标准PCR(美国专利号4，683，202)，RT-PCR (Bustin S. J Mol Endocrinol. 25 169-93，2000)，定量PCR(Ong Y. et al. ,Hematology. 7 :59_67，2002)，实时 PCR (Ginzinger D.Exp Hematol. 30 :503_12，2002)，以及原位 PCR(Thaker V. Methods Mol Biol. 115 :379-402,1999)，或其它任何的核酸扩增方法，之后利用本领域中已知的技术检测扩增后的分子。正如在这里使用的，扩增引物被定义为能够与基因的5’或3’区域(分别是正链和负链，或反过来)退火，并且它们之间包含一小段区域的核酸分子对。在合适的条件下，和合适的制剂一起，该引物允许扩增具有核酸序列的核酸分子，该核酸序列的两端是引物序列。对于原位技木，細胞或组织样本将被制备和固定在ー个支持物上，例如玻璃片，然后与能够与染色体上的基因组DNA或编码Hom多肽的mRNA杂交的探针进行接触。在另ー个实施例中，本发明的方法进ー步包括将ー个对照样本与能够检测 HommRNA,或基因组DNA的化合物或制剂进行接触，然后将检测样本中的HommRNA或基因组 DNA的存在与对照样本中的进行对比。上述的基于核酸的诊断方法可以提供定性和定量的信息来确定ー个个体患有或倾向患有与Hom基因异常表达相关的疾病，例如，癌症。有许多方法可以用于确定Hom多肽的水平。一般说来，这些方法包括接触ー种选择性结合该多肽的制剂，例如抗体，来评估样本中的多肽的水平。抗体可以是多克隆抗体， 或者更优选的，单克隆抗体。一个完整的抗体，或者其片段(例如，Fab or F(ab' )2)也可以使用。在ー个优选实施方式中，该抗体具有ー个可检测的标记。术语“标记的”，对于探针或抗体来说，是希望包括通过将可检测的物质与探针或抗体物理连接来完成的探针或抗体的直接标记，以及通过与可检测物质反应的探针或抗体的间接标记。例如，具有兔Fc区域的抗体可以使用针对兔Fc区域结合的ニ抗来进行间接标记，其中的ニ抗与可检测物质相偶联。这里提供一些可检测物质的例子。合适的可检测物质或标记包括放射性同位素(例如，125I，131I，35S，3H，or 32P)，酶(例如，碱性磷酸酶，辣根过氧化物酶，荧光素酶，或β-半乳糖苷酶)，荧光基团或蛋白质(例如，荧光素，罗丹明，藻红蛋白，GFP或BFP)，或发光基团 (例如，Quantum Dot Corporation, Palo Alto, CA 提供的 Qdot 纳米粒子)。检测方法可以用来检测体外和体内生物样本中的Hom多肽。体外检测Hom多肽的技术包括ELISAs，免疫沉淀，免疫荧光，EIA，RIA，以及Wfestern印记分析。体内检测Hom多肽的技术包括向个体引入ー个标记的抗-Hom抗体。例如，抗体能够用如上所述的可检测物质进行标记。个体中可检测物质的存在和位置可使用标准成像技术来进行检测。这里描述的诊断方法能够鉴定患有或者有风险发生与异常Hom表达或活性相关的疾病或病症的个体。正如这里所描述的，此类疾病或病症的例子包括ALL，CLL，AML，和 MDS。这里描述的预后方法可以用于确定某个个体是否适合于施用某个制剂(例如激动剂，拮抗剂，多肽模拟物，蛋白质，肽，核酸，小分子，或其它候选药物)来治疗疾病，例如癌症(如ALL，CLL，_AML)。举个例子，该分析可以用于确定某个个体能否施用細胞毒性药物来治疗细胞増殖性病症，或能否施用免疫抑制剂来治疗免疫系统病症，包括那些涉及器官/组织移植的病症。因此，本发明的特征还在于ー种控制个体癌症或免疫系统疾病治疗的方法。为了这个目的，在治疗之前，治疗中和治疗后，可以确定一个个体的检测样本中的Hom基因表达水平。治疗后Hom表达水平的升高指示该个体可以用同样的方法进行进一歩治疗。举个例子，接受了器官或组织移植的患者通常要面对器官或组织排斥的问题。也就是说，身体对于器官或组织的免疫响应，会导致移植的失败。为了解决这个问题，器官或组织移植通常伴随着非特异性免疫抑制治疗以防止T細胞介导的排斥反应。尽管如此，这些免疫抑制剂会导致感染，高血压，癌症，和其他不良副作用。因此，需要对抑制进行监測。在这方面，Hom-I的表达水平可以作为合适的免疫抑制水平或程度的标记。本领域技术人员可以基于治疗过程中Hom-I表达的水平来调整免疫抑制剂的量和治疗的长短。从上述分析的实践中获得的信息对于预測，确定疾病和其它影响个人健康状况有害条件的进展和临床管理是有用的。在优选实施方式中，上述诊断分析为预测，确定恶性肿瘤(癌症)的进展和管理提供了有用的信息，所述恶性肿瘤以的缺失或异常低水平的Hom 表达为特征。该信息可以更具体地协助临床医生设计化疗或其它治疗方案来从受折磨的哺乳动物体内，例如人类，根除恶性肿瘤。下面的具体例子只是被视作说明，而不以任何方式作为其余的披露的限制。尽管没有进ー步阐述，相信本领域技术人员根据这里的描述可以将本发明最大限度地利用。这里所引用的所有公开物的全部内容被作为參考文献引入。此外，以下提出的任何机制不以任何方式限制发明的范围。^MM 1 Hom-I,—种LET/TCF相关的转录抑制子，是ー种肿瘤抑制物LEF/TCFs转录因子是经典Wnt/beta-连环蛋白信号通路的核转录调节子，该信号通路对于早期胚胎发育中的細胞命运决定是很关键的，并且其被暗示在各种癌症中是ー个主要的致癌途径。LEF/TCFs不具备内源转录活性，但是却被相关因子密切控制。在Wnt信号的存在下，LEF/TCFs与beta-连环蛋白组成复合物，驱动LEF/TCF下游的基因表达，包括得到确认的癌基因，如cyclin Dl和C_myc。Xom(同样被称为Vent-2,Xbr-1,^P Vox)是果蝇homeobox基因OmlD的脊椎动物同源基因。Xom被确认为是BMP4的主要下游调节子，也是腹信号中心的必要组分。与beta-连环蛋白相似，Xom也是ー个不稳定蛋白。我们检测了 Xom对LEF/TCF介导的转录的影响，确定Xom是ー个新的LEF/TCF相关的转录因子。在此实施例中，通过序列同源捜索，分布数据和功能分析，我们确定了ー个新的转录子Hom-I作为人类Xom同源物的候选者。据发现，Hom-I与之前已知的VentX2共享ー个相同的0RF，但是在VentX2的已知序列之外它还包含ー个71 Ibp的5，UTR0下面描述了对 Hom-I实施进一歩的分析。材料和方法启动子-荧光素酶分析为进行ー个典型的启动子-荧光素酶分析实验，在转染前M小时，将れ10セ93丁细胞接种于12孔培养板中。将1微克编码目的基因的质粒与0. 3 μ g荧光素酶-报告构建体用3μ 1脂质体转染试剂(TRANSIT，Mirus)进行混合，根据产商操作指示转染进培养的細胞中。转染48小时后，用PBS洗涤細胞，用IX細胞裂解缓冲液(PR0MEGA)裂解細胞，刮下细胞，冰上收集。在桌上离心机上进行简短的旋转，将20 μ 1上清液与100 μ 1荧光素酶分析试剂(PR0MEGA)进行混合，用TR717微板光度计(APPLIED BI0SYSTEM)测量荧光素酶的活性。RNA 分离，RT-PCR 和实时 PCR用TRIzol方法提取总RNA0在Iml Trizol中勻浆细胞(IxlO6)，然后加入200ml 氯仿。漩涡混勻之后，12000rpm下离心样本，将上清液收集到新的管子中。向每个样本中加入异丙醇(500ml)，混勻，室温放置30分钟。在4°C下，12000rpm离心样本30分钟。收集沉淀，用70% ETOH洗涤，风干，重悬于20 μ IDEPC-处理的H2O中。通过测量OD26tl来确定 RNA的终浓度。根据产商操作指南，用SuperSript第一链合成系统(INVITR0GEN)来合成第一链cDNA。简言之，每个样本中的3 μ g总RNA被用于RT反应，1 μ g RT产物用于PCR反应。GAPDH用作内參。通过测序确定PCR产物的身份。使用LightCycler系统(ROCHE)和 LightCycler快速启动DNA Master SYBR Green I，根据产商操作指南的指示来进行实时PCR0基因表达的相对水平用该公式进行计算相对基因表达=2_ACd(ACd=特异基因的循环数-参考GAPDH基因的循环数)。Hom-I的剪接克隆和5，cDNA步行从包含Hom-I基因组序列的BAC RP13克隆中，用引物Fl 5， AATTGAATTCAATGCGCCTCTCCTCCTCC 3，，Rl :5，TTAATCTAGATCATCAAAATGCATCCCCCGTCTG 3，通过 PCR 反应扩增 2. 4kb 的 Hom-I基因组DNA。 用EcoRI和^CbaI消化PCR产物，并克隆进CS2载体中。用该质粒转染細胞。用 TriZol方法提取转染后的細胞的总RNA，使用Superscript第一链合成系统(INVITR0GEN) 进行RT反应。使用引物Fl和Rl扩增RT产物，用EcoRI和)(baI进行消化，然后克隆进CS2 载体中。为进行5’cDNA歩行，使用从健康志愿者的外周白細胞中提取出来的总RNA来扩增第一链cDNA。用正向引物扩增5，非翻译区，这些引物的起始位点位于-100，-161，-四1，-3 57，-471，-711，-843(起始密码子ATG中的核苷酸“A”被定义为位点0)。免疫荧光和免疫共沉淀为进行免疫荧光实验，用TransIT(MIRUS)将GFP-Hom-I和Myc_TCF4共转染进 HCT116細胞。用抗myc抗体对TCF4进行染色，之后加入Alexa 568标记的羊抗鼠ニ抗 (INVITR0GEN)。通过DAPI看见細胞核，影像用波士顿儿童医院的核心设施的共聚焦显微镜拍照。为进行免疫共沉淀，将20 μ 1蛋白A/G琼脂糖珠子(SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY)与 lug目的抗体混合以制备亲和蛋白A/G珠子。为了制备细胞裂解液，用包含IX蛋白酶抑制剂(ROCHE)的IX細胞裂解缓冲液(PR0MEGA)裂解2xl06細胞。細胞裂解液在冰上孵育 30分钟，简短超声波冲击后，在4°C下12000xg离心5分钟。加入20 μ 1蛋白A/G珠子和 1 μ g免疫前血清，4°C下2小时，对上清液进行进一歩清理。简短的旋转之后，将上清液与 20 μ 1抗体标记的蛋白A/G珠子混合，4°C下过夜。用PBS 0. 2% NP40洗涤珠子4次。加入 2x样本缓冲液，95°C煮沸5分钟以释放结合蛋白，简短离心，使用如文中的特异性抗体进行 western印记分析。小鼠抗myc抗体和羊抗TCF4抗体购自Santa Cruz。細胞培养，細胞分离和cDNA阵列本实施例中使用的细胞包括Nalm6細胞，Nalml6細胞，Reh細胞，RSll細胞，H苏丹細胞，ALL样本細胞，CLL样本細胞，293T細胞，Jurkat細胞，Tail細胞，EBV转换B细胞和来自于健康个体的配对B細胞，PC3細胞，LnCap細胞，MCF7細胞，MDA細胞，SK-N-AS细胞，H1299細胞，H460細胞和116細胞。所有这些細胞系被保存在额外加有10% FBS和
青霉素和链霉素的RPMI1640或DMEM中。健康个体来源的白細胞是从波士顿儿童医院的健康的匿名捐血者所丢弃的白細胞中分离得到的。人体材料的实验是根据布里格姆妇女医院的机构审查委员会所批准的准则进行实施的。T細胞，B細胞，粒细胞和单核细胞都利用⑶3，⑶19，⑶15和⑶14抗体特异性标记(MILTENYI BI0TEC)的MCAS微珠，根据产商操作指南来进行分离。I^rimeExpress II人类正常组织cDNA板(#10020)购自PRIMGEN。暂时转染和Hom-I shRNA稳定细胞系的建立对于HCTl 16和細胞，所有的暂时转染都用脂质体TransIT试剂(Mirus)根据产商操作指南来实施。对于Reh和Nalml6細胞，使用细胞系Nucleofector试剂盒V (細胞)， 根据产商操作指南，用电穿孔实施暂时转染。Hom-IshRNA质粒获自Origene Technologies ； 构建体 1 :5’ CAAATCTGCCT GCGCCG GAGAGGACCATG 3’ ；构建体 3 :5’ TTCAGAATCGCCGCATGAA ACACAAACGG 3，(SEQ ID NO :4)。为了建立Hom-I降低表达的细胞系，用Hom-IshRNA转染細胞。转染后48小吋，利用500ng/ml嘌呤霉素处理4周以选择Hom-I降低表达的細胞系。細胞活力分析，MTS増殖分析，以及咕胸腺嘧啶脱氧核苷掺入分析为进行Hom-I超表达实验，用编码GFP-Homl或GFP的质粒转染細胞。转染后M 小吋，利用FAC G4分选细胞计数器(BD BIOSCIENCE)将GFP阳性细胞分选出来，接种于培养板中。为进行細胞活力分析实验，将切105细胞以三个重复接种于12孔板中。在每个指示的时间点通过锥虫蓝染色来对活細胞进行计数4次。細胞活力用百分比来表示。为进行 MTS増殖分析，将IxlO5细胞以三个重复接种于96孔板中。接种后48小吋，使用細胞滴度96 水性非放射性細胞増殖分析试剂盒(PR0MEGA)，根据厂商操作指南来测量细胞增殖速度。为进行3H胸腺嘧啶脱氧核苷掺入分析，IxlO5分选的细胞以三个重复接种于96孔板中。接种后 48小吋，每个孔中加入咕胸腺嘧啶脱氧核苷(1. OUei/孔)，再培养18小吋。在-70°C冷冻过夜以裂解細胞，转移到膜上，用PBS洗涤三次，使用TopCoimt NXT进行闪烁计数(PACKARD BIOSCIENCE)。CHIP 分析Hela细胞于6cm培养皿中培养M小时，然后用编码myc-Hom-l或myc-tag的构建体进行转染。转染后M小吋，使用分析试剂盒(Upstate Cell Signaling)，按照厂商操作指南实施染色质免疫沉淀(Chip)。Cyclin Dl启动子序列用特异性引物进行扩增F5' -CGGACTACAGGGGAGTTTTGTTG-3 ‘和 R5 ‘ -TCCAGCATCCAGGTGGCGACGAT-3 ‘，免疫球蛋白重链启动子启动子用特异性引物进行扩增F5 ‘ -AACCCTTTTCCCCCTCGTCT-3 ‘和 R5 ‘ -AGCACTGTGAGGTGGCTGC-3 ‘。使用1 %琼脂糖凝胶电泳来分析PCR产物。统计分析用t检验分析数据。ρ值< 0. 05的差异被认为是从统计意义上显著的。结果Hom-I是Xom的同源物为了确定Xom的人类同源物，我们利用Xom同源结构域(HD)的序列作为模板在 NCBI蛋白质数据库中进行捜索。捜索所掲示的候选基因被认定为是Hom-l(之前被称为 Ventx2)。Hom-I的开放阅读框编码258个氨基酸，而Xom则有327个氨基酸。如图IA中所示，Hom-I的同源结构域与Xom具有68 %的氨基酸序列同一性和85%阳性(相似性)。 Hom-I包含ー个N端丝氨酸/苏氨酸丰富区域(aa 4_89)，ー个同源结构域(aa 91-151)，以及ー个C端富含脯氨酸区域(aa 151-258)。这与Xom类似，其也包括ー个N端丝氨酸/苏氨酸丰富区域(aa 31-1M)，ー个同源结构域(aa 172-233)，以及ー个C端富含脯氨酸区域 (aa 233-326) 利用Vector NTI蛋白质对比程序，我们发现，除了同源结构域，Hom-I与Xom在碳末端区域和在氨基末端的起始部位约10个氨基酸区域具有很高的相似性。两个分子也具有一个与功能相关的不相対的N末端区域。比较基因组分析表明，Hom-I在灵长类中是保守的(图1B)，但是在其他物种中序列同源性已丢失。除了结构的相似性，CGAP(癌症基因组解析计划)的EST数据显示，Hom-I的表达谱与Xom的分布类似，它们在成体组织中都表现非常有限的表达但却在胚胎组织中表达。为了进一步评估Hom-I的功能，使用BAC RP13作为模板，通过剪切克降获得它的cDNA。除了已知的序列，位于Hom-I第一个外显子上711bp的一个新的5，非翻译区通过5，-cDNA步行被确定出来。Xom是背部特异性基因Goosecoid的转录抑制子。为了确定Hom-1与Xom之间任何潜在的功能类似性，将编码Hom-I或Xom的mRNA与编码激活素和(isc-荧光素酶报告构建体的mRNA —起，注射进两细胞阶段的非洲爪蟾的两个分裂球的一个之中。在阶段10的时候收集5个胚胎，用PR0MEGA荧光素酶分析系统测量荧光素酶活性。发现Hom-I的表达抑制了激活素诱导的(isc-启动子的表达，这与Xom对(isc-启动子的抑制类似。这些结果与之前的发现是一致的，即Hom-l/Ventx2的表达抑制斑马鱼中的背部化。然而，如下图所示，Xom通过其N末端区域使LEF/TCF介导的转录转活，这是Xom不同于Hom-I的地方。因此，可以下结论Hom-I是Xom的同源物但不是Xom的直系同源物。Hom-I与Lef/Tcf转录因子组或复合物检测了 Hom-I与LEFl/TCFs是否有相互作用。Myc-标记的Hom-I在HCT116细胞中短期表达，Hom-I和TCF4之间潜在的相互作用通过免疫共沉淀而被确定。当抗TCF4-包裹的珠子应用于HCT116细胞提取物时，myc-Hom-1很容易地与TCF4免疫共沉淀。还发现Hom-I与TCF-4以一种点状的方式共定位于转染细胞的细胞核中(图2B)。为了确定Hom-I中的参与与Lef/Tcf因子相互作用的关键结构域，制备了 Hom-I的一系列缺失突变体，检测它们与TCF4的亲和性(图2A)。发现如果同源结构域和它周围的50个氨基酸区域从Hom-I中缺失，由此产生的突变体并不能与抗-TCF4-包裹珠子免疫共沉淀，这表明Hom-I的同源结构域和它周围的区域在Hom-I与LEF1/TCF因子的相互作用中起着关键的作用。考虑到homeobox区域是Hom-I的DNA结合域，用20 μ g/ml溴化乙锭 tB)来排除在Hom-I与TCF4之间的相互作用中可能的核酸干扰。发现EtB并不会破坏TCF4和Hom-I的相互作用，这暗示着Hom-I与TCF4之前的相互作用并不依赖于它们与DNA的结合。Hom-I抑制beta-连环蛋白转活Lef/Tcf介导的转录使用LET/TCF报告TOPflash分析来确定Hom-I对于LEF/TCF4的beta-连环蛋白转活的影响。发现Hom-I单独并不能在细胞中激活LEF1/TCF4介导的转录。相反，Hom-I以一种浓度依赖性的方式阻碍了 beta-连环蛋白转活Lef/Tcf介导的转录。为了进一步确认Hom-I对于beta-连环蛋白信号通路的抑制效果，实施分析来检测Hom-I在HCTl 16细胞中对于LEF/TCF介导的转录的影响，该细胞组成型地表达高水平内源性beta-连环蛋白活性。这些结果显示，Hom-I在HCTl 16细胞中是以一种浓度依赖性的方式抑制LEF1/TCF介导的转录，但是对于beta-连环蛋白的mRNA或蛋白的表达却没有施加显著的影响。为了探讨隐藏在Hom-I活性之下的不同的机制，检测了 Hom-I是否破坏了beta-连环蛋白和TCF4复合体的形成，该复合体是beta-连环蛋白转活LEF/TCF靶基因所必需的。用Myc-Hom-I短期转染HCTl 16细胞以增加浓度。转染后48小时，收集HCT116细胞的裂解液，用特异性抗体免疫沉淀TCF4。特异性的抗体被用于检测免疫复合物中的任何Hom-I和beta-连环蛋白。据发现，随着免疫复合物中Myc-Hom-I水平的增高，免疫复合物中的beta-连环蛋白表现出相应的下降，这表明，Hom-I的表达破坏了 beta-连环蛋白/TCF4复合物的形成。因此，与那些beta-连环蛋白/LEF/TCF信号中的诸如Chibby的beta-连环蛋白相关抑制子的功能类似，阻止beta-连环蛋白和LEF/TCF因子复合物的形成可以解释Hom-I对于beta-连环蛋白转活LEF/TCF的抑制作用。Hom-I调节beta-连环蛋白/LEF1/TCF下游基因的表达在该部分，实施分析来检测Hom-I对于内源性LEF/TCF靶基因表达的影响，例如cyclin Dl0首先，使用CHIP分析来检测Hom-I与cyclin Dl启动子之间的相互作用。用编码myc-Hom-1和对照myc-标签的质粒暂时转染Hela细胞，随后该细胞被用于myc-标签抗体的免疫共沉淀。用特异性引物扩增Cyclin Dl启动子或作为阴性对照的IgG重链启动子Cmy。发现Hom-I与Cyclin Dl启动子特异性结合，但是不与对照Cmμ启动子结合。利用cyclin Dl启动子-荧光素酶分析进一步检测Hom-I对于Cyclin Dl的表达的影响。与Hom-1对LEF/TCF介导的转录一致，发现Horn-1在HCT116细胞中阻碍了Cyclin Dl启动子-荧光素酶构建体的转活，这与其对于TOPflash报告构建体的效果类似。与Hom-I对于cyclin Dl表达的抑制效果一致，western印记分析显示Hom-I导致细胞内cyclin Dl的水平发生浓度依赖型的降低。Hom-I是细胞增殖的负调控因子经典Wnt/beta-连环蛋白/LEF/TCF通路被显示与恶性转化和细胞增殖有关系。在该部分，实施分析来评价Hom-I在细胞增殖中的作用。用RT-PCR检查Hom-I在衍生自单个的和造血系统恶性肿瘤的癌症细胞中的表达。确定了 Hom-I只在Nalml6淋巴细胞性白血病细胞中，而不在其它癌症细胞中表达(见下文和图4D)。为了确定Hom-I对于细胞增殖的影响，GFP-Hom-I被暂时转染进Reh淋巴细胞白血病细胞中，该细胞并不表达内源性Hom-1。阳性转染的细胞用FACS进行分选，通过细胞计数，MTT代谢分析和DNA合成咕胸腺嘧啶核苷掺入分析(图3A)来确定Hom-I对于细胞增殖的影响。这些结果显示Hom-I表达强烈地抑制Reh细胞的增殖。Hom-I对于其它癌症细胞的增殖也获得了类似的结果。为了进一步评估Hom-I对于细胞增殖的影响，用shRNA技术下调Nalml6细胞中的Hom-I表达。将四个Hom-IshRNA构建体转染进Nalml6细胞中。这些构建体对于下调Hom-I表达的有效性由RT-PCR确定，并使用实验室制备的特异性Hom-I抗体，由western印记分析进一步证实。发现构建体3对于Hom-I表达具有高特异性的活性，而构建体1却几乎不引起效果(图3B)。随后，这些构建体被用来转染Nalmie细胞，通过嘌呤霉素抗性来选择阳性转染的细胞。这些Hom-IshRNA对内源性Hom-I表达的影响利用RT-PCR进行确认(图3B，上栏)。Hom-I在对照和Hom-IshRNA转染的细胞中的表达通过使用Hom-I特异性抗体进行免疫印记(图3B，中栏)，并通过密度测定法来定量测定(图3B，下栏)。这些结果表明构建体-3，而非构建体-1，有效地降低了 Hom-I在Nalml6细胞中的表达。利用细胞增殖分析和MTT分析进一步确定Hom-I对细胞增殖的影响。如图3C中所示，构建体3对于Hom-I的下调与Nalmie的超增殖有关，但对照构建体或构建体1对于Nalmie的增殖不产生任何影响。上述结果显示，Hom-I是细胞增殖的一个负调节因子。为了确定Hom-I对于细胞增殖的影响是否与LEF/TCF靶基因的表达有关，检测了Hom-I的下调对于cyclin Dl表达的影响。与超表达的效果相反，Hom-I的下调与cyclinDl在细胞中的水平增高有关(图3D)。上述结果显示，Hom-I至少部分通过抑制beta-连环蛋白/LEF/TCF信号和如cyclin Dl的下游细胞周期调控子的表达来下调细胞增殖。Hom-I的表达在造血细胞中是被高度调控的，并且显示其与淋巴细胞白血病的癌变发生有关为了探讨Hom-I的生理作用，利用组织cDNA阵列和RT-PCR来显示其在成体组织的表达。发现全长Hom-I的表达被高度限制在外周血白细胞中(图4A)。外周血白细胞谱系分析显示Hom-I在髓系和淋巴系中表达，包括单核细胞，B细胞，T细胞和中性白细胞(图4B)。随着B细胞的成熟，它的表达随之增加(图4C)。与Hom-I在外周B淋巴细胞中的生理表达相反，除了 Nalmie细胞之外，Hom-I在衍生自B细胞恶性肿瘤的癌症细胞中基本不表达(图4D)。此外，对衍生于单个癌症的癌症细胞系的筛查揭示，Hom-I并不在癌症细胞系中表达，包括 HCT116，SW480, HT29, H印G2，PC3, LnCap, Hela, H460, H1299, MCF7, MDA 禾口SK-N-AS0 LEF/TCF因子已经被表明在B淋巴细胞发育和白血病发生中起着重要的作用。与Hom-I对B细胞恶性肿瘤发生的作用相一致，在EBV感染外周B细胞的永生化中，全长Hom-I的表达水平被显著降低。为了进一步探讨Hom-I在B细胞恶性肿瘤发生中的作用，检测外周血样本中的全长Hom-I的表达，这些样本来自于新的诊断和未治疗过的急性淋巴细胞白血病(ALL)和慢性淋巴细胞白血病(CLL)的患者。所有ALL样本包含最少95%的⑶19+白细胞。这些血样中的总RNA水平的RT-PCR显示，在所有7个ALL和10个CLL样本中，Hom-I的表达显著降低(图5A)。还发现，在急性和慢性淋巴细胞白血病患者中的外周血中，Hom-I表达下调与cyclin Dl的表达升高有关(图5B)。一些机制能够解释Hom-I的表达被高度调控。除了转录调控，Hom-I的转录本包含一条长的具有711个碱基对的富含GC的5’非翻译区(5’ UTR)。一个非典型的长5’ UTR出现在大约10%的mRNA中，通常在能调控细胞生长和增殖的基因之前，例如C-myc，HIF，和LEF/TCF。这条长的5，UTR能够形成一个二级结构，调控Hom-I的翻译启动。因此，Hom-I的5’ UTR很可能在Hom-I表达的翻译水平调控中起着关键的作用。上述结果显示，Hom-I是一个肿瘤抑制子，作为，至少部分作为LEF/TCF-下游癌基因，如cyclin D1，表达的抑制子而起功能。这些结果还显示了 Hom-I能够用于预测淋巴细胞白血病的临床行为，并且可作为鉴定能治疗各种病症，如癌症，的药物的靶标。实施例2 Hom-I在p53充分型和缺陷型癌症细胞中诱导细胞凋亡材料和方法细胞培养，转染，化疗人类大肠癌细胞系HCT116，SW480，人类肺癌细胞系H460和H1299获自于美国典型培养中心(Manassas，VA)。HCT116(p53+)细胞系是赠品。所有细胞系在37°C和5% (X)2下培养。HCT116，HCT116(p53+)和 SW480 的细胞培养基包含 McCoy，s 5A(INVITROGEN,Carlsbad, CA)，而 H460 和 HU99 的则包含 RPMI-1640 (INVITROGEN)。细胞培养基中均加Λ 10%的胎牛血清(HYCLONE, Logan, UT)，100单位/ml青霉素，100 μ克/ml链霉素，和250ng/ml 的两性霉素 B(MEDIATECH，Hemdon, VA)。根据厂商操作说明，用 Lipofectamine2000 (INVITR0GEN)转染。本研究中使用的抗癌症药物，包括5-氟尿嘧啶(5_FU，50ug/ml)和盐酸阿霉素(D0X，0. 4ug/ml)从SIGMA (ST. Louis, MO)购得。所有药物都溶解于DMSO中，并用细胞培养基稀释至合适的浓度。质粒及其构建用基于PCR的技术将编码Hom的核酸亚克隆进pCS2+载体，GFP-标签。通过体外翻译和测序来证实构建体。共聚焦显微镜HCT116细胞接种于玻璃载玻片上，用Hom-GFP表达构建体转染。M小时后，在PBS中用仲甲醛固定细胞，碘化丙啶(PI，SIGMA)复染色。在PBS中洗涤4次，每次5分钟后，装上玻片，用共聚焦显微镜进行分析。细胞凋亡和生长分析收集包括附着的和漂浮在培养基中的细胞，在含有终浓度为3. 7%甲醛，0.5%Nonidet P40，和lOyg/ml的4'，6-二脒基-2-苯基吲哚的PBS溶液中进行固定。通过在显微镜下观察到凝聚染色质和微核化来评估细胞凋亡。每个条件至少实施3个独立实验，每次至少测量400个细胞。用3- (4，5- 二甲基噻唑-2) _5_ (3-羧基甲基苯基)-2- (4-磺苯基)_2H_四唑分析(MTT)在96孔板(8，000细胞/每孔)中测定细胞生长，根据厂商操作说明，使用CellTiter96 AQueous One Solution (PR0MEGA, Madison, WI)来进行测量。使用 VERSAmax 可调酶标仪(Sunnyvale，CA)测量A49tlnm值。载体处理的细胞被设定为1 (100 。每次实验设定3个重复，并至少重复两次。群落形成分析根据厂商操作说明，用Lipofectamine 2000 (INVITR0GEN)在IOOmm细胞培养皿中转染细胞M小时。然后收集细胞，用FAC G4分选流式细胞仪(BD Biosciences)分选GFP-载体或GFP-Homl阳性细胞。这些GFP阳性细胞以每孔1 X IO5细胞置于6孔板中。让细胞生长5-10天，之后用结晶紫(SIGMA)进行染色。所有实验重复至少两次，在每次测试中均获得了相似的结果。 异种移植肿瘤和组织染色 所有的动物实验是经过哈佛医学院学校动物保护和利用委员会的批准的。在IOOmm细胞培养皿中，用Lipofectamine 2000 (INVITR0GEN)转染细胞M小时。然后收集细胞，用FAC G4分选流式细胞仪(BD Biosciences)分选载体-GFP或Homl-GFP阳性细胞。通过将 IxlO5 载体-GFP 或 Hom-GFP 阳性 HCTl 16 (p53+/+)或 HCTl 16 (p53+)细胞 s. c 注射进5至6周龄的雌性无胸腺裸鼠(SIM0NSEN LABORATORIES,Gilroy,CA)的侧腹中来建立移植肿瘤。同时，将Ix IO6包括GFP-阳性和阴性的未分选的细胞s.c注射到其他裸鼠中，建立未分选移植肿瘤模型。每周用卡尺测量3次，根据公式(长度χ宽度2)/2计算肿瘤体积，以监测肿瘤的生长。立即用10%中性缓冲福尔马林固定移植肿瘤组织。然后将该组织进行石蜡包埋和切片。用苏木精和伊红(H組)对切片进行染色，然后用于组织学分析。用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(TUNEL)，根据厂商操作说明利用重组末端转移酶(ROCHE，Indianapolis, IN)和 dUTP-Alexa 594(MOLECULAR PROBES)进行染色，再用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚进行复染色。所有的图像都使用SPOT照相图形软件，通过Nikon TS800荧光显微镜获得。细胞分级从2个60-cm2皿中离心收集漂浮的和附着的细胞，重悬于均质缓冲液中(0. 25mol/L蔗糖，10mmol/L HEPES (pH 7. 4)，和 lmmol/L EGTA)，在冰上用 2_ml 的 Dounce 勻浆器勻浆40次。勻浆物在1000xg，4°C下离心10分钟以沉淀细胞核。上清液继续在14，OOOxg，4°C下离心30分钟，获得胞浆(上清)组分。Western 印记对总细胞裂解液，线粒体和胞浆组分进行纯化，并用4-20% Tris-甘氨酸凝胶(INVITR0GEN, Carlsbad, CA)电泳进行分离。对于活性的caspase_3，PARP和Hom的分析，提取总细胞，并用4-20% Tris-甘氨酸凝胶(INVITR0GEN)电泳进行分离。所使用的抗体包括GFP (Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA), Histone-I (Ab-1, NE0MARKERS, Fremont, CA),和 β-肌动蛋白(SIGMA)，活性 caspase-3 (BD BIOSCIENCES)，以及 PARP (CELL SIGNALINGTECHNOLOGY, Boston, MA)。合适的辣根过氧化物酶结合的二抗被用于检测一抗和抗原复合物的结合，之后用Western Lightning Western印记化学发光试剂Plus (PERKINELMER，Boston, ΜΑ)检测。逆转录-PCR根据厂商操作说明，用TRIzol 试剂(INVITR0GEN)分离总RNA。用SuperscriptII逆转录酶(INVITR0GEN)合成第一链cDNA。接着，将每个RT反应的混合物用PCR扩增，扩增循环数从20 (GAPDH)至35(Hom)不等。每个循环包括一个热变性阶段(94 °C，60秒)，一个退火阶段(57°C，30秒)，一个延伸阶段(72°C，30秒)。PCR产物根据大小在2%的琼脂糖凝胶中被分级，并能在紫外灯下看到。用于扩增Hom的引物包括5，-AAGGCAATTAGGCGCTGCTT-3，和 5’ -ACAGAACAACTGAGTCCTCCA-3，。统计分析结果以均值士SD来表示。用ANOVA分析来评估统计分析，在该分析中，使用最小显著差异法来实施多重比较。如果差异偶然发生的概率<5/100，则认为差异是显著的(P< 0. 05)。结果Hom-I编码一个核蛋白Hom-I是非洲爪蟾Xom蛋白的人类同源物，它们具有相似的结构同源性。为了确定Hom-I的细胞内定位，构建了编码具有氨基末端GFP标签的全长Hom-I的表达载体。将构建体转染进HCT116结肠癌细胞中，用共聚焦显微镜观察嵌合蛋白的细胞内分布。HCT116细胞的细胞核用PI染色以进行标记。发现Hom-I靶向转染细胞的细胞核中，与PI同位。为了进一步确定Hom-I的核定位，用蔗糖梯度来对亚细胞组分进行分级，随后用western印记分析确定Hom-I在各个组分中的分布。发现Hom-I富集于转染细胞的核组分中，而GFP富集于转染细胞的细胞质组分中。Hom通过诱导细胞凋亡来抑制人类肿瘤细胞的生长如上面所讨论的，Hom-I是致癌Wnt信号的拮抗剂。为了确定Hom-I对实体肿瘤生长的影响，实施分析来检测Hom-I对于人类癌症细胞生长的影响。发现用编码GFP-Hom-I或GFP的表达载体转染HCTl 16结肠癌细胞，H460肺癌细胞和人胚肾细胞(用腺病毒Ela转化，带有一个与新霉素共选择的温度敏感性T抗原)。对于所有的这三个细胞系，通过GFP信号的指示，大约有35-50 %的细胞被转染。转染后48小时，根据厂商操作说明用MTS分析细胞生长。发现GFP对于待测细胞的生长不产生任何影响。然而，GFP-Hom-I对待测癌症细胞的生长表现出很强的抑制。有趣的是，GFP-Hom-I在非癌症细胞中具有很低的生长抑制效果。这些发现与之前的观察即肿瘤依赖(对致癌通路)相一致。此外，实施群落形成分析来探讨Hom-I对于细胞长期生存的影响。用编码GFP-Hom-I或GFP的质粒暂时转染HCTl 16细胞。转染后48小时，收集细胞，通过GFP信号分选细胞，然后以每孔IX IO5个细胞的稀释度置于6孔板中。定植于板中之后M小时，用荧光显微镜和相差显微镜可见HCTl 16结肠细胞(90%附着在板上)。定植后96小时，再一次用相差显微镜和荧光显微镜对转染细胞进行检测。发现在定植后96小时的时候，在转染GFP-Hom-I的孔中很少有GFP阳性的细胞，这表明GFP-Hom-I抑制了转染细胞的生长。在其它的人类癌症细胞系中也观察到了类似的结果，包括Sw480，H460和HU99。与暂时转染研究的结果一致，293T细胞的生长只会被GFP-Hom-I轻微抑制。分选的转染细胞的长期生长显示GFP转染细胞中形成多个群落，但是在用GFP-Hom-I转染的细胞中很少有群落产生。在GFP-Hom-I转染的细胞中，群落数量只是降低了 20%。为了确定GFP-Hom-I转染的细胞中这种生长抑制是否是细胞凋亡的结果，通过显微观察转染细胞以确定凋亡特征的存在，来对细胞凋亡进行评定，这些特征诸如凝集的染色质和如之前所描述的用Hoechst 33258染色后的微核化(Waldman T，et al. Nature1996,381 :713)。发现GFP并不会诱导细胞凋亡，但是GFP-Hom-I在人类癌症细胞系中诱导了大量的细胞凋亡。此外，GFP-Hom-I并不能诱导细胞的凋亡，这是一个非癌症细胞系。这些结果表明Hom-I是人类癌症细胞有力的生长抑制诱导剂，其是部分通过诱导凋亡起作用。Hom-I的生长抑制效果在非癌症人类四31~细胞中显著减少，这可能反映出之前注意到的现象即癌症依赖于致癌通路。Hom-I在ρ53缺陷型细胞中诱导程序性细胞死亡Ρ53是一个重要的肿瘤抑制基因。超过百分之五十的癌症由于Ρ53基因的直接突变而具有失活的Ρ53。为了确定Hom-I的肿瘤抑制效果是否依赖于功能性的ρ53，实施分析来研究Hom-I对于3个癌症细胞系的效果，这三个细胞系是HCTl 16ρ5!3ΚΟ，ρ53缺陷性HU99以及Ρ53突变型SW480，其中由于突变或人工敲除而使ρ53丧失其功能。分析Hom-I对这些癌症细胞生长的效果的方法从本质上来说和上述的方法是一样的。实施MTS分析，体外细胞生长分析，以及群落形成分析。这些结果显示Hom-I强烈地抑制了这些缺乏功能性Ρ53的待测癌症细胞的生长(分别地，P <0.01)。在ρ53缺陷型细胞中，凋亡图像显示Hom-I同样诱导了细胞凋亡。Hom-I 诱导 Caspase-3 的激活Caspase-3是细胞凋亡的关键执行者。它部分或者全部负责许多重要蛋白质的蛋白裂解，例如核酶聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)。Caspase-3被确定为是哺乳动物细胞中一个关键性的细胞凋亡调控因子。凋亡的诱导导致前caspase-3被切割以及产生活性的17kDa caspase-3和12kDa caspase-3片段。激活的caspase-3靴向包括PARP和其它caspases在内的凋亡通路关键调节子。为了研究caspaes-3的激活是否参与Horn-介导的细胞凋亡，提取总蛋白，利用活性caspase-3抗体通过western印记来分析caspase-3的活性。发现在p53充分型和缺陷癌症细胞中，是GFP-Hom-I而不是GFP的表达激活了 caspase-3。这些结果表明Hom-I以P53非依赖性的方式诱导caspase-3的激活。Hom-I在体内通过诱导程序性细胞死亡来抑制肿瘤生长为了确定Hom-I在体内是否具有抗肿瘤活性，用编码GFP或GFP-Hom-I的表达载体转染HCTl 16p53野生型(WT)细胞系和HCT116 p53敲除型(KO)细胞系。转染效率大约为35-40% (图6A)。这些转染细胞的生长率通过向裸鼠的背部皮下注射细胞来确定。表达GFP的细胞被注射进背部的左边，而表达GFP-Hom-I的细胞则被注射进背部的右边。肿瘤的生长通过原位检测和剪除来测定(图6B)。发现在p53充分型和p53缺陷性HCTl 16细胞中，是GFP-Hom-I而不是GFP在体内抑制了肿瘤的生长。H&E染色以及TUNEL染色的原位凋亡分析显示表达Hom-I的肿瘤表现出大量的片段化DNA，这表明Hom-I在体内通过诱导程序性细胞死亡来抑制肿瘤生长。实施例3 =Hom-I抑制子诱导细胞因子的表汰实施分析来确定Hom-I是否可以调节淋巴细胞中的前炎性细胞因了的表达，例如白细胞介素-1 (IL-I)，白细胞介素-6 (IL-6)，白细胞介素-8 (IL-8)，肿瘤坏死因子-α (TNF- α )，和巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)。特别地，确定从细胞中抑制Hom-I，通过RNAi制剂，是否会降低细胞因子的表达。未分化的单核U937细胞在包含M-CSF的培养基中培养四天，该培养基可诱导单核细胞分化。将这些细胞用直接作用于Hom-l(构建体3)或GFP的RNAi制剂进行电穿孔，然后再继续培养3天。据评估，只有一半的电穿孔细胞成功吸收了 RNAi制剂。脂多糖(LPS，1 μ g/ml)随后加入到培养基中以诱发细胞因子的表达；24小时后收集细胞。用如实施例1中描述的方法，提取细胞的总RNA，对提取的RNA进行RT-PCR，用实时PCR来定量细胞中IL-1, IL-6, IL-8，或 TNF-alpha mRNA。据发现在用靶向Hom-I的RNAi制剂电穿孔的细胞中，细胞因子的mRNA水平被极大地降低。相对于对照细胞(也就是，用靶向GFP的RNAi制剂电穿孔的细胞)，每种细胞因子的mRNA水平都降低了 40%至60%。因为只有一半的细胞吸收了 RNAi制剂，真实的抑制程度比40-60%更高，可能会达到100%或接近于100%。该结果表明，Hom-I抑制剂，例如RNAi制剂，可以用于降低前炎性细胞因子的表达，因此能够治疗ARDS和其它的由这些细胞因子介导的类似的呼吸道/肺部病症。实施例4 Hom-I促进淋巴细胞发育Hom-I在正常髓系和淋巴系细胞中是高度表达的。在造血干细胞的成熟过程中，其表达被上调。未分化的包含GFPTet或GFPHom-lTet的单核细胞U937细胞被用于该实验中。GFPTet或GFPHom-lTrt是转基因，当暴露在四环素(Tet)下就能够被激活，从而能分别过量表达GFP和GFP与Hom-I融合蛋白。细胞在含有Tet的培养基中培养48小时。随后如上述加入LPS，M小时后收获细胞。用如上述同样的方式确定IL-1，IL-6，IL-8，TNF-alpha，或M-CSF的mRNA水平。据发现细胞因子的mRNA水平在超表达Hom-I的细胞中显著增高。比只表达GFP的对照细胞中的水平高约10至超过300倍。该结果表明Hom-I促进淋巴细胞的成熟和分化。进一步实施分析来检测Hom-I在单核细胞和巨噬细胞中的作用，上述两种细胞是天然和获得性免疫系统的关键性因子。结果发现Hom-I对单核细胞发育为巨噬细胞起着关键的作用。更为具体地，在初级单核细胞中抑制Hom-I的表达对终端巨噬细胞的分化带来了极度的损害。使用上述的siRNA将单核细胞中的Hom-I表达降低，这使得成纤维细胞样形状的形态发生终止，大大减少了细胞表面⑶71标志，FcyRI⑶64，⑶40，⑶86，整联蛋白CDllb和CDllc，TLR4(Toll样受体4)，MR(甘露糖受体)和CD14的表达。有趣的是，通过台盼蓝排除法确定该蛋白的低表达并没有降低初级单核细胞的活力。其它一些细胞表面分子的表达，例如HLA-DR，并没有受到Hom-I低表达的影响，这排除了单核细胞向巨噬细胞分化的降低由Hom-I抑制的细胞毒性导致的可能性。另外，与对照细胞相比，用siRNA转染的单核细胞表现出降低的吞噬活性，这表明Hom-I是单核细胞分化为巨噬细胞的功能性发育所必需的。相反，Hom-I在单核细胞中的超表达加速了单核细胞向巨噬细胞的分化，如转染细胞表面CD71表达升高所显示。类似的，Hom-I在髓系U937细胞中的异常表达也诱发了它们的分化，表现出突出的巨噬细胞特征，包括上面提及的标志物的表达，明显的形态学变化(细胞变得有附着性，产生大量的伪足)，增强的吞噬活性，以及前炎性细胞因子分泌的增高。这些结果进一步显示了 M-CSF受体是Hom-I的直接的转录靶标。在临床患者中，Hom-I的表达与一些前炎性细胞因子表达正相关的事实表明，Hom-I在炎症性疾病的发病机理和治疗中起着重要的作用。其它
具体实施例方式本说明书中所公开的所有特征可以进行任意的组合。本发明所公开的每个特征都可以被另外一个具有相同，等同或类似目的的特征所代替。因此，除非有特别陈述，每一个公开的特征只是一类等同或类似特征的例子。本发明已经描述了许多实施例。然而，这将被理解为可以有多种改进而不背离本发明的精神和范围。相应地，其它实施例落入下述权利要求的范围之内。
权利要求
1.ー种RNAi制剂，其包含第一链，该第一链包含与编码Hom-I蛋白的基因区域具有同源性的第一核苷酸序列，其中所述RNAi制剂靶向编码Hom-I蛋白的基因转录得到的mRNA。
2.如权利要求1的RNAi制剂，其中RNAi制剂进一歩包含第二链，该第二链具有与第一序列互补的第二核苷酸序列。
3.如权利要求1的RNAi制剂，其中所述第一序列包括4，6，7，或8。
4.ー种含有如权利要求1的RNAi的药物组合物。
5.如权利要求3的药物组合物，其中该药物組合物是ー种鼻腔气雾剂或吸入气雾剂组合物。
6.一个分离的核酸，其包含序列SEQ ID NO :3，4，6，7，或8，或其互补序列。
7.ー种降低个体中前炎性細胞因子水平或炎性細胞水平或活性的方法，包括向所需要的个体施用有效量的含有序列SEQ ID NO 1的多肽的抑制剂。
8.如权利要求7的方法，其中所述的細胞因子是TNF-α，IL-Ιβ，或IL6。
9.如权利要求7的方法，其中所述抑制剂是ー种抗体，一条反义核酸或ー个RNAi制剂。
10.如权利要求9的方法，其中RNAi制剂包含序列SEQID Ν0:4，6，7，或8。
11.如权利要求7的方法，其中抑制剂是泼尼松，依木兰，甲氨喋呤或骁悉。
12.—种治疗患有免疫系统疾病或处于免疫系统疾病风险中的人类个体的方法，包括向所需要的个体施用有效量的含有序列SEQ ID NO 1的多肽的抑制剂。
13.如权利要求12的方法，其中抑制剂是ー种抗体，一条反义核酸或ー个RNAi制剂。
14.如权利要求13的方法，其中RNAi制剂包含序列SEQID NO :4，6，7，或8。
15.如权利要求12的方法，其中免疫系统疾病是ー种炎症疾病。
16.如权利要求12的方法，其中免疫系统疾病是急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。
17.如权利要求12的方法，其中个体患有或疑似患有流行性感冒。
18.ー种提高个体中炎性細胞的水平或活性的方法，包括向所需要的个体施用有效量的含有序列SEQ ID NO :1或5的多肽，或其功能等同物，或编码该多肽的核酸。
19.如权利要求18的方法，其中細胞是巨噬細胞。
20.一种控制患者治疗的方法，包括确认处于或者需要治疗ー种症状的患者， 从患者中获取生物样本，确定样本中基因的表达水平，该基因编码包含SEQ ID NO 1的多肽， 其中如果该水平处于或高于预定值，则该患者被确定为适合进行治疗。
21.如权利要求20的方法，其中该方法进ー步包括将表达水平与患者或医生或患者的看护者进行交流。
22.如权利要求20的方法，其中的症状是细胞増殖性疾病。
23.如权利要求20的方法，其中的症状是炎性或自身免疫性疾病。
24.ー种用于诊断免疫系统疾病或控制患者治疗的试剂盒，包括ー种或多种选自于包含以下的組具有SEQ ID NO :1序列的蛋白的特异性抗体， 具有SEQ ID NO 1序列的多肽， 扩增SEQ ID NO :2，3，或5的片段的PCR引物对，以及在严格条件下与參考核酸的互补链杂交的核酸，其中的參考核酸由SEQ ID N0:2，3，或 5组成。
25.如权利要求M的试剂盒，其中的疾病是ALL，CLL，AML，MDS，SLE，IBD，RA或移植排斥。
26.—种诊断个体中免疫系统疾病的方法，该方法包括从该个体中获得生物样本；确定样本中基因的表达水平，该基因编码含有SEQ ID NO 1的多肽。
27.如权利要求20的方法，其中的疾病是细胞増殖性疾病，如果该表达水平低于第一预定水平或没有表达，则个体被确定为患有或倾向于发生细胞增殖性疾病。
28.如权利要求20的方法，其中的疾病是炎性或自身免疫性疾病，如果该表达水平高于第二预定水平，则该个体被确定为患有或倾向于发生该疾病。
全文摘要
本发明揭露治疗免疫系统疾病的组合物和方法。还揭露了诊断方法和预后方法。
文档编号C12Q1/68GK102575250SQ201080032111
公开日2012年7月11日 申请日期2010年7月15日 优先权日2009年7月15日
发明者朱正仑, 高红 申请人:朱正仑, 高红