使用弧菌属细菌产生l-赖氨酸的方法

专利名称：使用弧菌属细菌产生l-赖氨酸的方法
技术领域：
本发明涉及使用弧菌属细菌产生L-赖氨酸的方法。L-赖氨酸作为动物饲料的添加剂、健康食品的成分以及氨基酸输液等是产业上有用的L-氨基酸。
背景技术：
L-赖氨酸是使用属于短杆菌属(Brevibacterium)、棒状杆菌属 (Corynebacterium)等的棒状杆菌型细菌，属于芽孢杆菌属(Bacillus)、埃希氏菌属 (Escherichia)、链霉菌属(Str印tomyces)、甲基杆菌属(Methylobacillus)等的细菌，或属于青霉属(Penicillium)等的丝状真菌通过发酵生产的。作为使用微生物通过发酵产生L-赖氨酸的方法，有使用源自野生型株的营养缺陷型的方法，使用源自野生型株的代谢调节突变株作为对多种药物中任一种有抗性的株的方法，和使用具有营养缺陷型和代谢调节突变体两者特性的株的方法等。此外，通过使用重组DNA技术，可培育能够高效率地产生L-赖氨酸的微生物(专利文献1至4)。虽然通过这样的微生物培育和如上所述的产生方法的改进已极大地提高L-氨基酸的生产力(productivity)，但为了响应将来需要的进一步增加，需要开发更加廉价且高效的L-赖氨酸生产方法。基于直接发酵的L-氨基酸生产方法具有如下问题由于培养基中L-氨基酸的蓄积导致的渗透压上升，降低了微生物的活性(action)，由此无法长时间保持生产力。作为解决此问题的方法，已公开了使用弧菌属细菌通过直接发酵产生L-氨基酸如L-赖氨酸的方法(专利文献5)。作为可减少培养基中蓄积的L-赖氨酸的分解的L-赖氨酸的生产方法，已知使用 L-赖氨酸分解能力降低的微生物，特别是属于埃希氏菌属的、其中缺失cadA基因或IdcC基因或其产物的表达量或酶活性降低的微生物的方法(非专利文献1，专利文献4)。已知在弧菌属细菌当中的霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)及创伤弧菌(Vibrio vuiniticus)中存在cadA同源基因(非专利文献 2至4)。然而，并不知道在这些弧菌属细菌中是否可通过破坏这样的cadA同源基因来减弱或缺失L-赖氨酸分解能力。而且，并不知道在弧菌属细菌中是否存在除与cadA同源基因产物相关的L-赖氨酸分解途径之外的L-赖氨酸分解途径。现有技术文献专利文献专利文献1欧州专利申请公开0857784号说明书专利文献2特开平11-192088号公报专利文献3国际公开第W000/537^号小册子专利文献4国际公开第W096/17930号小册子专利文献5国际公开第W02008/093829号小册子非专利文献
非专利文献1S. Meng 禾口 G.N.Bennett，J. Bacteriol.，174 ；2659-2669 (1992)非专利文献2]D. S. Merrell 和 A. Camilli, Mol. Microbiol. ,34 ；836-849 (1999)非专利文献3Y. Tanaka 等，J. Appl. Microbiol.，104 ； 1283-1293 (2007)非专利文献4J. E. Rhee 等，FEMS Microbiol. Lett.，208 ；245-251 (2002)

发明内容
发明要解决的问题本发明的目标为提供使用弧菌属细菌高效地产生L-赖氨酸的方法。特别地，在弧菌属细菌情况中，本发明人已经发现了在培养基中蓄积的L-赖氨酸随着培养进行而减少的现象，而且本发明的一个目标为降低该L-赖氨酸的减少。解决问题的手段本发明人为了解决上述问题而进行了勤勉的研究。结果，他们详明了在弧菌属细菌中编码与L-赖氨酸分解相关的因子的基因。而且他们发现通过破坏该基因，能够抑制蓄积的L-赖氨酸的分解，并能够高效地产生L-赖氨酸，从而完成了本发明。因而，本发明涉及如下(1) 一种产生L-赖氨酸的方法，其包括在培养基中培养具有L-赖氨酸生产能力的弧菌属细菌，以在该培养基中或细菌细胞内产生并蓄积L-赖氨酸，并从该培养基或细胞收集L-赖氨酸，其中所述弧菌属细菌经修饰使得由fucO基因编码的蛋白的活性减少。(2)如上所述的方法，其中所述蛋白的活性是通过将突变导入fucO基因的编码区和/或该基因的表达调节区而减少的。(3)如上所述的方法，其中破坏了染色体上的fucO基因。(4)如上所述的方法，其中所述蛋白是下述㈧或(B)限定的蛋白(A)具有SEQ ID NO 2中所示氨基酸序列的蛋白，(B)具有在SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列中包含一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加的蛋白，其中在所述细菌中其活性的减少改善了产生L-赖氨酸的能力。(5)如上所述的方法，其中所述fucO基因是下述(a)或(b)限定的DNA (a)包含SEQ ID NO 1的核苷酸序列的DNA，(b)与SEQ ID NO=I的核苷酸序列或可从该核苷酸序列制备的探针在严格条件下杂交，并编码蛋白的DNA，其中在所述细菌中其活性的减少改善了产生L-赖氨酸的能力。(6)如上所述的方法，其中增强了一种或多种选自下组的酶的活性二氢吡啶二羧酸合酶、天冬氨酸激酶、二氢吡啶二羧酸还原酶和二氨基庚二酸脱氢酶。(7)如上所述的方法，其中所述弧菌属细菌是需钠弧菌(Vibrio natriegens)。(8)如上所述的方法，其中所述培养基含有甘油作为碳源。(9) 一种弧菌属细菌，其具有产生L-赖氨酸的能力，并经修饰使得由fucO基因编码的蛋白的活性减少。(10)如上所述的弧菌属细菌，其为需钠弧菌。附图简述

图1 显示通过fucO基因缺陷抑制L-赖氨酸分解。(a)经51倍稀释的培养基的
40D660随时间的变化。(b)培养基中葡萄糖浓度随时间的变化。(c)培养基中L-赖氨酸浓度随时间的变化。每幅图包括以3个样品的结果的平均值绘制的曲线，并示出标准偏差。图2 显示通过需钠弧菌28-15 Δ fuc0/pCABD2从葡萄糖产生L-赖氨酸。(a)经 51倍稀释的培养基的0D660。(b)培养基中的葡萄糖浓度、(c)培养基中的L-赖氨酸浓度。 (d)培养开始后40小时基于消耗的糖的L-赖氨酸得率。在图中，0至8% NaCl的指示意指所述图显示通过在含0至8% (w/v)NaCl的MS培养基中培养获得的结果的平均值和标准偏差。图3 显示使用需钠弧菌28-15 Δ fuc0/pCABD2从甘油产生L-赖氨酸。(a)经51 倍稀释的培养基的0D660随时间的变化。(b)培养基中甘油浓度随时间的变化。(c)培养基中L-赖氨酸浓度随时间的变化。(d)培养开始后40小时基于消耗的甘油的L-赖氨酸得率。在图中0% NaCl,2% NaCl和4% NaCl的指示意指所述图显示通过在含甘油作为碳源和0至4% (w/v)NaCl的MS培养基中培养获得的结果的平均值和标准偏差。图4 显示通过需钠弧菌28-15 Δ fuc0/pCABD2以及需钠弧菌VLD01/pCABD2从甘油产生L-赖氨酸。(a) 50倍稀释的培养基的0D660随时间的变化。(b)培养基中甘油浓度随时间的变化。(c)培养基中L-赖氨酸浓度随时间的变化。(d)培养开始后M小时基于消耗的甘油的L-赖氨酸得率。
具体实施例方式<1>弧菌属细菌本发明的细菌为具有L-赖氨酸生产能力，且经修饰使得fucO基因编码的蛋白活性减少的弧菌属细菌。本申请中提及的L-赖氨酸生产能力意指在培养基中培养本发明的细菌时，其在培养基或细胞中生成L-赖氨酸，并以能够从所述培养基或细胞中收集L-赖氨酸的程度蓄积L-赖氨酸的能力。即，本发明的细菌，是能够通过使用糖等作为碳源的发酵(亦称作直接发酵)来生产L-赖氨酸的弧菌属细菌。具体而言，例如，将经修饰使得由fucO基因编码的蛋白的活性减少的弧菌属细菌在适当的条件下培养时，如果在培养基中蓄积1.5倍以上，优选2倍以上，更优选3倍以上的L-赖氨酸，则该细菌具有L-赖氨酸生产能力。“L-赖氨酸”包括游离形式的L-赖氨酸和/或其盐，如硫酸盐、盐酸盐和碳酸盐。具有生产L-赖氨酸能力的弧菌属细菌可为固有地具有L-赖氨酸生产能力的细菌，或可为使用突变方法或DNA重组技术通过修饰如下所述的弧菌属细菌使其获得L-赖氨酸生产能力的细菌。而且，本发明的弧菌属细菌，除了 L-赖氨酸生产能力之外，可具有生产其他氨基酸，例如L-苏氨酸，L-谷氨酸等的能力。以下，就弧菌属细菌进行说明。弧菌属细菌为属于变形菌门(Proteobacteria) Y亚群的弧菌科 (Vibrionanceae)的革兰氏阴性兼性厌氧细菌，且为具有单一极性鞭毛的运动细菌 (motile bacteria)，见于淡水或海水中。在本发明中使用的弧菌属细菌期望为非病原性弧菌属细菌，可利用如下所述未知其病原性，且列于生物安全水平KOffice of Health and Safety (OHS)发行的 Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories(BMBL)，第四版)的弧菌属细菌。
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鲍鱼弧菌(Vibrioabalonicus)ATCC 27390适应弧菌(Vibrioadaptatus) ATCC 19263产气弧菌(Vibrioaerogenes) ATCC 700797河口弧菌(Vibrio aestuarianus) ATCC 35048解藻朊酸弧菌(Vibrioalginolyticus)ATCC 14582藻弧菌(Vibrioalgosus)ATCC 14390鳗弧菌(Vibrioanguillarum) ATCC 43305卡尔维湾弧菌(Vibriocalviensis)ATCC BAA-606坎氏弧菌(Vibriocampbellii)ATCC 25920鲨鱼弧菌(Vibriocarchariae) ATCC 35084溶珊瑚弧菌(Vibriocoralliilyticus)ATCC BAA-450肋生弧菌(Vibriocosticola)ATCC 43147Vibrio cyclitrophicus ATCC 700982食环弧菌(Vibriocyclosites)ATCC 14635双氮养弧菌(Vibriodiazotrophicus)ATCC 33466费氏弧菌(Vibrio fischeri)ATCC 25918产气弧菌(Vibriogazogenes) ATCC 29988鲍鱼肠弧菌(Vibriohalioticoli)ATCC 700680哈氏弧菌(Vibrioharveyi)ATCC14126西班牙弧菌(Vibriohispanica)ATCC 51589鱼肠道弧菌(Vibrioichthyoenteri)ATCC 700023鱼肠弧菌(Vibrioiliopiscarius)ATCC 51760迟缓弧菌(Vibriolentus)ATCC BAA-539液化弧菌(Vibrioliquefaciens) ATCC 17058火神弧菌(Vibriologei)ATCC 15382海洋活动弧菌(Vibriomarinagilis)ATCC 14398海深黄弧菌(Vibriomarinofulvus) ATCC 14395海洋普通弧菌(Vibriomarinovulgaris)ATCC 14394地中海弧菌(Vibriomediterranei) ATCC 43341梅氏弧菌(Vibriometschnikovii)ATCC 7708贻贝弧菌(Vibriomyttli)ATCC 51288需钠弧菌(Vibrionatregiens)ATCC 14048纳瓦拉弧菌(Vibrio navarrensis)ATCC 51183海蛹弧菌(Vibrionereis)ATCC 25917黑美人弧菌(Vibrionigripulchritudo)ATCC 27043奥氏弧菌(Vibrioorddalii) ATCC 33509东方弧菌(Vibrioorientalis)ATCC 33933杀扇贝弧菌(Vibriopectenicida)ATCC 700783海弧菌(Vibriopelagius)ATCC 33504
杀对虾弧菌(Vibriopenaeicida)ATCC 51841黑海弧菌(Vibrioponticus)ATCC 14391解蛋白弧菌(Vibrioproteolyticus)ATCC 53559冷红弧菌(Vibrio psychroerythrus) ATCC 27364杀鲑弧菌(Vibriosalmonicida)ATCC 43839Vibrio shiloii ATCC BAA-91灿烂弧菌(Vibriosplendidus)ATCC 33125酪氨酸弧菌(Vbiriotyrosinaticus)ATCC 19378粘弧菌(Vibrioviscosus)ATCC BAA-105Vibrio wodanis ATCC BAA-104海贝内克氏菌(Beneckeapelgia)ATCC 25916鳗利斯顿氏菌(Listonellaangui 11 arum)ATCC 19264海贝内克氏菌和鳗利斯顿氏菌与弧菌属细菌紧密相关，且根据目前的分类其一些菌株分类为弧菌属细菌(Thompson, F. L.等 Microbiol. Mol. Biol. Rev.，23，403-431 (2004) 以及 Macian，M. C.等 Syst. Appl. Microbiol. , 23, 373-375 (2000)) 因此，这样的细菌亦可在本发明中用作弧菌属细菌。其中，优选使用需钠弧菌。需钠弧菌为属于变形菌门Y亚群弧菌科的海洋性兼性厌氧细菌，且其在1958年作为糖醛酸氧化细菌而分离O^ayn^W. J. J. Bacteriology, 76, 301(1958))。起初，该细菌被认为属于变形菌门Y亚群的假单胞菌属，但该细菌重分类为贝内克氏菌属(Beneckea)，然后与其他属于贝内克氏菌属的细菌一起并入了弧菌属。该细菌在 ATCC 中分类为生物安全水平 1，在 DSMZ (the German National Resource Centre for Biological Material)中分类为风险组1 (德国分类)，且该细菌的病原性未知。作为需钠弧菌，可使用需钠弧菌ATCC 14048株(NBRC 15636株)。上述弧菌属细菌可从例如美国典型培养物保藏中心(地址Ρ.0.Βοχ 1549, Manassas, VA 20108，United States of America)获得。即赋予各菌株对应的登录号， 可利用该登录号通过订购而获得(参照http://www.atcc. org/)。各菌株对应的登录号记载于美国典型培养物保藏中心的目录中。此外，需钠弧菌ATCC14048株以NBRC15636 的编号保存在独立行政法人制品评价技术基盘机构生物遗传资源部门(NITE NBRC, 2-5-8Kazusakamatari, Kisarazushi, Chiba-ken，292-0818，日本)，并可由该机构提供。在当氨基酸发酵后期产生的物质以高水平蓄积的时期内观察到的高渗透压条件下，或由高糖浓度诱导的高渗透压条件下，与已经常规地用于L-氨基酸生产的微生物(如大肠杆菌或棒状杆菌型细菌)在这样的条件下生长不充分相比，弧菌属细菌可良好地生长。“高渗透压”为，例如不低于925m0sm，优选不低于IlOOmOsm,更优选不低于1500m0sm。 高渗透压的上限只要是可以进行氨基酸发酵则并无特别的限制，且为，例如2000m0sm。此外，“细菌可在高渗透压下良好地生长”意指，在大肠杆菌野生型株，例如MG1655株(ATCC 47076)的生长速率下降到最大时的50%以下的IlOOmOsm条件下，生长速率保持为不低于最大生长速率的50 %，优选不低于最大生长速率的90 %。<2>赋予弧菌属细菌L-赖氨酸生产能力的方法具有L-赖氨酸生产能力的弧菌属细菌可通过向如上所述的任何弧菌属细菌的野生型株赋予L-赖氨酸生产能力来获得。为了赋予L-赖氨酸生产能力，可使用在培育棒状杆菌型细菌、埃希氏菌属细菌等中常规采用的方法(参见氨基酸发酵(株)学会出版中心)。 这样的方法包括获得营养缺陷型突变株、对L-赖氨酸如L-赖氨酸类似物有抗性的株、或代谢调节突变株，构建L-赖氨酸生物合成酶的活性增加的重组株等。L-赖氨酸生物合成酶活性可通过增加编码该酶的基因的拷贝数或修饰基因的表达调节序列如启动子来增强。在 L-赖氨酸生产菌的培育中，这样的性质如营养缺陷型、类似物抗性和代谢调节突变的赋予， 可与L-赖氨酸生物合成酶的增强相组合。以下，例示了赋予L-赖氨酸生产能力的方法。例如，L-赖氨酸生产菌可培育为对于L-高丝氨酸、或L-苏氨酸及L-甲硫氨酸营养缺陷的突变株(特公昭48-28078号、特公昭56-6499号))，对于肌醇或乙酸营养缺陷的突变株(特開昭55-9784号和特開昭56-8692号)，或者对氧代赖氨酸、赖氨酸氧肟酸、 S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸、Y-甲基赖氨酸、α-氯己内酰胺、DL-α-氨基-ε-己内酰胺、α -氨基十二烷基内酰胺、天冬氨酸类似物、磺胺药、醌类或N-月桂酰亮氨酸有抗性的突变株。特别优选的培育对于作为L-赖氨酸类似物的S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸 (AEC)具有抗性的株。获得弧菌属细菌的突变株的突变方法的实例包括紫外线照射或者使用用于常规突变的诱变剂，如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)或亚硝酸处理。而且，亦可通过选择弧菌属细菌的天然存在的突变体来获得具有L-氨基酸生产能力的弧菌属细菌。L-氨基酸类似物抗性突变株可通过，例如将经突变处理的弧菌属细菌接种于含有不同浓度的L-氨基酸类似物的琼脂培养基并选择形成菌落的菌株来获得。而且，营养缺陷型突变株可通过使弧菌属细菌在含有特定营养物(例如L-氨基酸)的琼脂培养基中形成菌落，然后将所述菌落复印至不含前述营养物的另一琼脂培养基上，并选择在不含该营养物的培养基上不能形成菌落的菌株来获得。对AEC有抗性的需钠弧菌的L-赖氨酸生产株的实例包括需钠弧菌观-15株(FERM ΒΡ-10946)株(W02008/093829)。该株被命名为AJl 10593株，于2006年10月M日保藏于独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心(〒305-8566日本国茨城县筑波市东1 丁目1番地1中央第6)，并分配登录号FERM Ρ-21066，它之后转为国际保藏，分配登录号 FERM ΒΡ-10946。通过增强L-赖氨酸生物合成酶的活性，赋予或增强L-赖氨酸生产能力的方法如下所述。例如，L-赖氨酸生产能力可通过增强二氢吡啶二羧酸合酶活性和/或天冬氨酸激酶活性来赋予。弧菌属细菌的二氢吡啶二羧酸合酶活性和/或天冬氨酸激酶活性的增强可通过如下得到将编码二氢吡啶二羧酸合酶的基因片段和/或编码天冬氨酸激酶的基因片段与在弧菌属细菌中起作用的载体，优选多拷贝类型的载体连接而构建重组DNA，并将所述DNA 导入宿主弧菌属细菌进行转化。转化株的细胞内编码二氢吡啶二羧酸合酶的基因和/或编码天冬氨酸激酶的基因的拷贝数增加的结果是增强了这些酶的活性。下文中，二氢吡啶二羧酸合酶可略为DDPS，天冬氨酸激酶可略为ΑΚ，而天冬氨酸激酶III可略为AKIII。任何微生物可用作编码DDPS和AK的基因的供体，只要选择可在属于弧菌属的微生物中表达DDPS和AK活性的微生物。所述微生物可为野生型株或源自野生型株的突变株。其具体实例包括大肠杆菌(Escherichia coli)K_12株以及需钠弧菌ATCC14048 株(NBRC15636)。已经阐明了源自埃希氏菌属细菌的编码DDPS的基因(dapA，Richaud, F.等 J. Bacteriol.，297 (1986))以及编码 AKIII 的基因(lysC, Cassan, M.，Parsot, C.， Cohen, G. N.和 Patte，J. C.，J. Biol. Chem.，261，1052 (1986))两者的核苷酸序列。因此，可通过基于这些基因的核苷酸序列合成引物，并使用微生物如大肠杆菌K-12株或需钠弧菌 ATCC14048株的染色体DNA作为模板进行PCR来获得这些基因。弧菌属细菌的基因也可通过使用下述GenBank数据库信息来获得。霍乱弧菌01生物变型eltor株附6961染色体I，全序列；AE003852霍乱弧菌01生物变型eltor株附6961染色体II，全序列；AE003853副溶血弧菌RIMD 2210633染色体I，全序列；BA000031副溶血弧菌RIMD 2210633染色体II，全序列；BA000032费氏弧菌ESl 14染色体I，全序列；CP000020费氏弧菌ES114染色体II，全序列；CP000021创伤弧菌(Vibriovulnificus) CMCP6 染色体 I，全序列；AE016795创伤弧菌CMCP6染色体II，全序列；AEO16796创伤弧菌YJO16染色体I，全序列；BA000037创伤弧菌YJO16染色体II，全序列；BA000038用于本发明的DDPS和AK优选不受L-赖氨酸的反馈抑制。已知源自弧菌属细菌的野生型DDPS受L-赖氨酸的反馈抑制，而源自弧菌属细菌的野生型AKIII受L-赖氨酸的抑制和反馈抑制。因此，要导入弧菌属细菌的dapA和lysC，优选为编码具有使其对L-赖氨酸的反馈抑制脱敏的突变的DDPS和AKIII的那些。然而，在本发明中，DDPS和AK可不必为突变体。例如，已知源自棒杆菌属细菌的 DDPS原本不受L-赖氨酸的反馈抑制。可存在编码天冬氨酸激酶的基因的同源物，而且该基因的来源没有限制，只要该基因编码具有天冬氨酸激酶活性的蛋白。例如，需钠弧菌的AK基因的实例包括AKO基因、thrA基因、metL基因、IysC基因和推定的AK(putative-AK)基因。SEQ ID NO 11为包含需钠弧菌AKO基因的区的核苷酸序列。在SEQ IDNO 11中， 估计核苷酸编号5沈-5观的GTG、核苷酸编号544-546的GTG或核苷酸编号568-570的GTG 构成起始密码子，核苷酸编号1711-1713的TGA构成终止密码子。因此，具有SEQ ID N0: 11中的核苷酸编号526-1710的核苷酸序列(编码的氨基酸序列为SEQ ID NO :12中的氨基酸编号1-395) ,SEQID NO 11中的核苷酸编号M4-1710的核苷酸序列(编码的氨基酸序列为SEQID NO 12中的氨基酸编号7-395)或SEQ ID NO 11中的核苷酸编号568-1710的核苷酸序列(编码的氨基酸序列为SEQ ID N0:12中的氨基酸序列15-395)的DNA作为开读框可用作AKO基因。SEQ ID NO :13为包含需钠弧菌thrA基因的区的核苷酸序列。在SEQ IDN0:13中， 估计核苷酸编号486-488的ATG、核苷酸编号591-593的GTG或核苷酸编号633-635的GTG 构成起始密码子，核苷酸编号四43-2945的TAA构成终止密码子。因此，具有SEQ ID N0 13 中的核苷酸编号4864942的核苷酸序列(编码的氨基酸序列为SEQ ID N0:14中的氨基酸编号1-819) ,SEQID NO :13中的核苷酸编号59H942的核苷酸序列(编码的氨基酸序列为 SEQID NO: 14中的氨基酸编号35-819)或SEQ ID NO 13中的核苷酸编号6334942的核苷酸序列(编码的氨基酸序列为SEQ ID NO 14中的氨基酸序列50-819)的DNA作为开读框可用作thrA基因。SEQ ID NO :15为包含需钠弧菌metL基因的区的核苷酸序列。在SEQ IDN0:15中， 估计核苷酸编号376-378的ATG、核苷酸编号487-489的GTG或核苷酸编号490-492的GTG 构成起始密码子，核苷酸编号2782-2784的TAA构成终止密码子。因此，具有SEQ ID NO 15 中的核苷酸编号376-2781的核苷酸序列(编码的氨基酸序列为SEQ ID N0:16中的氨基酸编号1-802) ,SEQID NO 15中的核苷酸编号487-2781的核苷酸序列(编码的氨基酸序列为 SEQID NO 16中的氨基酸编号38-802)或SEQ ID NO 15中的核苷酸编号490-2781的核苷酸序列(编码的氨基酸序列为SEQ ID NO 16中的氨基酸序列39-802)的DNA作为开读框可用作metL基因。SEQ ID NO 17为包含需钠弧菌IysC基因的区的核苷酸序列。在SEQ IDNO 17 中，估计核苷酸编号1060-1062的GTG或核苷酸编号1117-1119的ATG构成起始密码子， 核苷酸编号M10-2412的TAA构成终止密码子。因此，具有SEQ ID N0:17中的核苷酸编号1060-2409的核苷酸序列(编码的氨基酸序列为SEQ ID NO 18中的氨基酸编号1_450) 或SEQ ID N0:17中的核苷酸编号1117-M09的核苷酸序列(编码的氨基酸序列为SEQ ID NO 18中的氨基酸序列20-450)的DNA作为开读框可用作IysC基因。SEQ ID NO :19为包含需钠弧菌推定的AK基因的区的核苷酸序列。在SEQ ID NO 19中，估计核苷酸编号344-346的ATG、核苷酸编号380-382的ATG或核苷酸编号470-472 的ATG构成起始密码子，核苷酸编号1766-1768的TAA构成终止密码子。因此，具有SEQ ID NO 19中的核苷酸编号344-1765的核苷酸序列(编码的氨基酸序列为SEQ ID NO 20中的氨基酸编号1-474)、SEQ ID NO :19中的核苷酸编号380-1765的核苷酸序列(编码的氨基酸序列为SEQ ID NO :20中的氨基酸编号13-474)或SEQ ID NO 19中的核苷酸编号470-1765 的核苷酸序列(编码的氨基酸序列为SEQ ID NO :20中的氨基酸序列43-474)的DNA作为开读框可用作推定的AK基因。此外，上述AKO基因、thrA基因、metL基因、IysC基因和推定的AK基因可为与每个序列的互补链或由这些序列制备的探针在严格条件下可杂交的、且编码具有天冬氨酸激酶活性的蛋白的DNA。在此，“严格条件”指形成所谓的特异性杂交物，而不形成非特异性杂交物的条件。 虽然难以将这些条件明确地数值化，严格条件的实例包括高度同源的DNA相互杂交，例如具有80 %以上，优选90 %以上，更优选95 %以上，还更优选97 %以上，特别优选99 %以上同源性的DNA相互杂交，而比上面更低的同源性的DNA不互相杂交的条件，或者为在与常规Southern杂交中的洗涤相应的盐浓度和温度下，即在60°C、IX SSC、0. 1% SDS，优选在 60°C、0. IX SSC、0. SDS，更优选在 68°C、0. IX SSC、0. 1 % SDS，洗涤一次，优选 2 或 3 次的条件。虽然探针的长度可根据杂交的条件适当地选择，但其通常为IOObp至ΙΙΛρ。而且，在本说明书中，术语“同源性”(homology)可指“同一性”(identity)。天冬氨酸激酶活性可通过Miyajima，R 等；The Journal of Biochemistry (1968)，63 (2)，139-148中所述的方法来测量。
上述AKO基因、thrA基因、metL基因、IysC基因和推定的AK基因均不限于野生型基因，亦可为编码具有由每个基因的开读框编码的氨基酸序列但在一个或多个位置包括一个或几个氨基酸的取代、缺失、插入、添加等的保守变体蛋白的突变体或人工修饰的基因， 只要所述基因编码具有天冬氨酸激酶活性的蛋白。虽然本文提及的“一个或几个”氨基酸残基的数目可取决于蛋白的氨基酸的类型或在三维结构中的位置而不同，但具体地其可为优选1 20、更优选1 10、还更优选1 5。上述一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加为保留蛋白的正常功能的保守突变。保守突变为，当取代部位为芳族氨基酸时取代发生在Wie、Trp, Tyr相互之间的突变； 当取代部位为疏水性氨基酸时取代发生在LeU、Ile、Val相互之间的突变；当取代部位为极性氨基酸时取代发生在GlruAsn之间的突变；当取代部位为碱性氨基酸时取代发生在Lys、 Arg、His相互之间的突变；当取代部位为酸性氨基酸时取代发生在Asp、Glu之间的突变；当取代部位为具有羟基的氨基酸时取代发生在义！·、!!!!·之间的突变。保守突变的典型实例是保守取代，作为可视作保守取代的取代，具体地包括用Ser或Thr取代Ala，用Gin、His或 Lys 取代 Arg，用 Glu、Gin、Lys、His 或 Asp 取代 Asn，用 Asn、Glu 或 Gln 取代 Asp，用 Ser 或 Ala 取代 Cys，用 Asn、Glu、Lys、His、Asp 或 Arg 取代 Gln，用 Gly、Asn、Gln、Lys 或 Asp 取代 Glu,用 Pro 取代 Gly,用 Asn、Lys、Gin、Arg 或 Tyr 取代 His，用 Leu、Met、Val 或 Phe 取代 lie, M lie、Met、Val 或 Phe 取代 Leu，用 Asn、Glu、Gin、His 或 Arg 取代 Lys，用 lie、Leu、 Val 或 Phe 取代 Met，用 Trp、Tyr、Met、lie 或 Leu 取代 Phe，用 Thr 或 Ala 取代 Ser,用 Ser 或Ala取代Thr，用Phe或Tyr取代Trp，用His、Phe或Trp取代Tyr，以及用Met、Ile或 Leu取代Val。上述氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位等可为天然存在的突变或由于携带AKO、thrA、metL、IysC和推定的AK基因的微生物的个体差异或种间差异所引起的变异的结果。这样的突变体或如上所述修饰的基因可通过如下获得通过例如位点特异性的突变修饰上述各开读框的核苷酸序列以使编码的蛋白质在特定位点包含氨基酸残基的取代、 缺失、插入或添加。作为AKO基因、thrA基因、metL基因、IysC基因和推定的AK基因，可存在使用的基因，其编码与有各基因上述开读框编码的完整氨基酸序列具有80%以上、优选90%以上， 更优选95%以上，还更优选97%以上，特别优选99%以上同源性的氨基酸序列，且编码具有天冬氨酸激酶活性的蛋白。氨基酸序列和核苷酸序列的同源性可使用，例如由Karlin和 Altschul 创造的BLAST算法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873 (1993))或FASTA (Methods Enzymo 1.，183，63 (1990))来确定。基于该BLAST算法，开发了称作BLASTN或BLASTX的程序(参照 http://www. ncbi. nlm. nih. gov)。涉及保守的变体及其编码基因以及保守突变的上述描述亦适用于天冬氨酸激酶以外的酶和编码该酶的基因，以及下述的FucO蛋白和fucO基因。用于基因克隆的质粒可为在细菌如埃希氏菌属细菌中可复制的那些，且其具体实例包括 pBR322、pTWV228、pMW119、pUC19 等。作为在弧菌属细菌中有功能的载体，可使用能够在弧菌属细菌中自主复制的任何载体。作为载体质粒，可使用任何具有源自PUC质粒、pACYC184质粒、IncQ质粒的ori的载体质粒。作为用于选择的标记基因，可使用源自Tn903的卡那霉素抗性基因、源自Τη9的氯霉素抗性基因、链霉素抗性基因、四环素抗性基因等。
为了通过将dapA和IysC连接于在弧菌属细菌中有功能的载体而制备重组DNAJf 载体用对应于包含dapA和IysC的DNA片段的末端的限制酶消化。连接通常使用连接酶如 T4DNA连接酶进行。dapA和IysC可由不同的载体或单一的载体携带。编码不受L-赖氨酸的反馈抑制的突变型二氢吡啶二羧酸合酶的DNA的实例包括编码具有118位的组氨酸残基被酪氨酸残基取代的氨基酸序列的蛋白的DNA。编码不受 L-赖氨酸的反馈抑制的突变型天冬氨酸激酶的DNA的实例包括编码具有352位的苏氨酸残基、323位的甘氨酸残基和318位的甲硫氨酸残基分别被异亮氨酸、天冬酰胺和异亮氨酸残基取代的氨基酸序列的AKIII的DNA(关于这些突变体，参见美国专利5，661，012号和 6，040，160号说明书)。所述突变DNA可通过位点特异性突变使用PCR等来获得。宽宿主范围质粒RSFD80、pCABl、pCABD2称为包含编码突变型二氢吡啶二羧酸合酶的突变型dapA基因和编码突变型天冬氨酸激酶的突变型IysC基因的质粒(美国专利 6，040，160号说明书)。由RSFD80转化的大肠杆菌JM109株(美国专利6，040, 160号说明书)命名为AJ12396，并于1993年10月观日保藏于通产省工业技术院生命工程工业技术研究所(现为独立行政法人工业技术综合研究所专利生物保藏中心)并分配登录号FERM P-13936。该保藏物于1994年11月1日根据布达佩斯条约转为国际保藏，并分配登录号 FERM BP-4859。RSFD80可从AJ12396株通过常规方法获得。如上所述制备的重组DNA可通过能够获得充分的转化效率的任何方法导入弧菌属细菌，而其实例包括电穿孔(Canadian Journal of Microbiology，43，197 (1997))。DDPS活性和/或AK活性亦可通过将dapA和/或IysC的多拷贝导入弧菌属细菌的染色体DNA来增强。将dapA和/或IysC的多拷贝导入弧菌属细菌的染色体DNA可通过靶向以多拷贝存在于染色体DNA上的序列的同源重组来进行。所述以多拷贝存在于染色体 DNA上的序列可为重复DNA或转座元件端部存在的反向重复序列。或者，如特开平2-109985 公报所公开的，可通过如下将dapA和/或IysC的多拷贝导入染色体DNA 将所述基因插入转座子并将其转移使得该基因的多拷贝导入染色体DNA。这些方法增加了 dapA和/或IysC 的拷贝数，这导致DDPS活性和/或AK活性增强。除了上述基因扩增之外，DDPS活性和/或AK活性的增强还可通过用强力序列代替dapA和/或IysC的表达调节序列如启动子来达成(参见特开平1-215280号公报)。强力的启动子的实例包括Iac启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子、Lambda噬菌体的I3R启动子和PL启动子，以及上述的杂合启动子等。用这些启动子的替代增强了 dapA和 /或IysC的表达，并由此增强了 DDPS活性和/或AK活性。表达调节序列的替代可与提高 dapA和/或IysC的拷贝数组合(Science，1997 Sep. 5,277(5331) :1453-74 ；Nucleic Acids Res. ,1993Apr. 11,21 (7) :1507-16 ；Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1983Jan, 80 (1) :21-5,国际专利公开 W098/04715、W098/17806、美国专利号 US 5，830，690 和 US 5,861,273)。DNA的消化、连接等，染色体DNA的制备，PCR，质粒DNA的制备，转化，作为引物使用的寡聚物的设计等可根据本领域技术人员公知的常规方法进行。这些方法记载于 Sambrook, J.，Fritsch, E. F.，禾口 Maniatis，Τ.，“ Molecular Cloning ALaboratory Manual，第 2 片反〃，Cold Spring Harbor Laboratory Press，(1989)等。除了 DDPS活性和/或AK活性的增强之外，可增强其他涉及L-赖氨酸生物合成的酶的活性。此种酶的实例包括二氨基庚二酸途径的酶，如二氢吡啶二羧酸还原酶(dapB)、二氨基庚二酸脱羧酶(IysA)、二氨基庚二酸脱氢酶(ddh)(以上，见国际专利公开 W096/40934)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(ppc，特开昭60-87788号公报)、天冬氨酸氨基转移酶(aspC，特公平6-1020 号公报)、二氨基庚二酸差向异构酶(dapF，特开2003-135066号公报)、和天冬氨酸半醛脱氢酶(asd，国际专利公开00/61723号小册子)，或者氨基己二酸途径的酶，如高乌头酸水合酶(特开2000-157276号公报)等。酶名称后面的括号内提及的那些为基因名称(这同样适用于如下描述)。前述pCABD2包含源自大肠杆菌且编码具有对L-赖氨酸的反馈抑制脱敏的突变的DDPS的突变型dapA基因、源自大肠杆菌且编码具有对L-赖氨酸的反馈抑制脱敏的突变的AKIII的突变型IysC基因、源自大肠杆菌且编码二氢吡啶二羧酸还原酶的dapB基因、和源自乳发酵短杆菌且编码二氨基庚二酸脱氢酶的ddh基因(国际专利公开W095/16042和 W001/53459号小册子)。本发明的弧菌属细菌可为通过增强L-赖氨酸分泌活性而增加L-赖氨酸生产能力的细菌。例如，可通过增加ybjE基因的表达量或增加IysE基因的表达量来增强L-赖氨酸分泌活性(特开2005-237379，国际专利公开W097/23697号小册子)。此外，在本发明的细菌中，可减少或缺失催化从L-赖氨酸生物合成途径分歧而生成除L-赖氨酸以外的化合物的反应的酶的活性，或针对L-赖氨酸合成或积蓄而起消极作用的酶的活性。用于L-赖氨酸产生的酶的活性包括高丝氨酸脱氢酶、苹果酸酶等，且可参考国际专利公开W095/23864号、W096/17930号小册子和W02005/010175号小册子来构建所述酶活性减少或缺损的菌株。可通过如下减少或缺失这些酶的活性采用常规的突变或基因工程技术，在基因组上编码上述酶的基因中导入使得细胞中该酶的活性减少或缺失的突变。这样的突变的导入可通过如下达成例如，通过基因重组或通过修饰表达调节序列如启动子或 Shine-Dalgarno(SD)序列消除基因组上的编码所述酶的基因。此外，还可以通过如下达成向基因组上的编码酶的区域导入氨基酸取代的突变(错义突变)，导入终止密码子(无义突变)，导入添加或缺失一或两个核苷酸的移码突变，或者使基因的部分或整个区域缺失 (J. Biol. Chem. 272,8611-8617(1997) ；Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95 :5511-5515(1998)， J. Biol. Chem.，266，20833-20839 (1991))。此外，酶活性还可通过如下减少或消除构建编码突变酶的突变基因，其编码区的部分或全部分缺失，然后通过同源重组等用突变基因替代基因组上的正常基因，或者将转座子或IS因子导入该基因中。例如，使用如下所述的方法以通过基因重组导入使得上述酶的活性减少或消除的突变。通过对目的基因的部分序列进行修饰来制备突变型基因使得它不产生正常发挥功能的酶。然后，用含该突变型基因的DNA转化弧菌属细菌以导致基因组上的基因与突变型基因的重组，并由此用突变型基因替代基因组上的目的基因。此类使用同源重组的基因取代的实例包括使用线性DNA的方法，如称为“Red驱动整合(Red-driven integration) ”的方法(Datsenko, K. A 和 Wanner，B. L.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97 :6640-6645 QOOO))、和由Red驱动整合和源自λ噬菌体的切出系统的组合组成的方法(Cho，E.H.，Gumport，R. I.， Gardner, J. F.，J. Bacteriol.，184 :5200-5203 (2002)，参照国际专利公开 W02005/010175 号)，使用含温度敏感型复制起点的质粒的方法(美国专利第6，303，383号、特开平 05-007491号公报)等。如上所述基于利用同源重组的基因取代的位点特异性突变还可通过使用在宿主中不能够复制的质粒来进行。用于降低酶活性的上述方法还可适用于下述FucO蛋白活性的降低。<3>由fucO基因编码的蛋白的活性的降低本发明的细菌可通过如下获得修饰如上所述属于弧菌属并具有L-赖氨酸生产能力的细菌使得由fucO基因编码的蛋白(以下，该蛋白亦描述为“FucO”)的活性降低。在本发明的弧菌属细菌的培育中，可先赋予L-赖氨酸生产能力或先进行降低FucO蛋白活性的修饰。虽然本发明的细菌可为经修饰使得由fucO基因编码的蛋白的活性与野生型株或非修饰株相比降低的细菌，但更期望它与野生型株或非修饰株相比改进了 L-赖氨酸蓄积能力。在本发明中，fucO基因意指能够从弧菌属细菌获得的大肠杆菌fucO基因的同源物，且实例包括例如具有SEQ ID NO :1的核苷酸序列的基因。SEQ IDNO :1的核苷酸序列为需钠弧菌观-15株的fucO基因的核苷酸序列。由该基因编码的氨基酸序列示于SEQ ID NO :2 中。本发明的fucO基因为与大肠杆菌fucO基因显示同源性的基因。大肠杆菌MG1655 株的fucO基因作为编码L-I，2-丙二醇氧化还原酶的基因，登录于Genebank (GenBank NC_000913. 2、核苷酸编号四四887-四31038的互补链)。而且，本发明的fucO基因包括副溶血弧菌的eutG基因和与该基因显示同源性的基因。副溶血弧菌RIMD 2210633株的eutG基因产物，作为含铁的醇脱氢酶(NP_797614)， 登录于 GenPept 数据库(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/protein/NP_797614. 1 ？ report = genp印t)。此外，所述eutG基因，作为含铁的醇脱氢酶的基因登录于GenBank (NC 004603. 1、核苷酸编号 1301840-1303159)。大肠杆菌的fucO基因产物与大肠杆菌的eutG基因产物之间在氨基酸组成上的同源性为 77. 3% (使用 Molecular Devices, Inc.的 Genetix 9. 0. 3 版本)。弧菌属细菌的fucO基因的同源物可通过如下获得例如，使用BLAST(http:// blast, genome, jp/)检索与具有SEQ ID NO :1的核苷酸序列的基因、大肠杆菌的fucO基因或所述eutG基因显示高同源性的基因。同源性的程度无特别限制，只要通过基因表达产物的活性下降改进了 L-赖氨酸的蓄积，但是同源性为，例如相对于整个氨基酸序列80%以上，优选90%以上，更优选95%以上，还更优选97%以上，特别优选99%以上。由fucO基因编码的蛋白的实例包括具有SEQ ID NO 2的氨基酸序列的那些。然而，蛋白可为保守变体，只要蛋白的功能不改变。此外，fucO基因只要其编码FucO蛋白，可为与SEQ ID NO 1的核苷酸序列或可由该核苷酸序列制备的探针在严格条件下可杂交的DNA。所述“严格条件”具有与上述相同的含义。表述“降低由fucO基因编码的蛋白的活性”意指通过使用药物或遗传工程达成的、由于将突变导入在fucO基因的编码区而导致的，由fucO基因编码的FucO蛋白的功能削弱或缺失，也指由于将突变导入fucO基因的表达调控区等而导致fucO基因的表达或翻译降低从而降低FucO蛋白的量。此外，可通过所谓基因破坏，即缺失染色体上整个fucO基因或fucO基因的一部分，来降低FucO蛋白的活性。而且，活性的降低包括活性的完全消除。为了降低FucO蛋白的活性，具体而言，可使用所述用于赋予L-赖氨酸生产能力的降低酶活性的方法。<4>产生L-赖氨酸的方法本发明的方法为将本发明的细菌在培养基中培养以产生并在该培养基或细菌细胞中蓄积L-赖氨酸，和从该培养基或细胞回收L-赖氨酸的方法。作为使用的培养基，可使用在使用微生物通过发酵进行的L-氨基酸生产中常用的培养基。即，可使用包含碳源、氮源、无机离子和根据需要任选的其他有机组分的常规培养基。作为碳源，可使用糖，如葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、果糖、淀粉水解物；醇，如甘油、山梨醇；有机酸，如延胡索酸、柠檬酸、琥珀酸。在本发明中特别优选使用甘油作为碳源。在本发明中，优选使用甘油作为碳源。甘油可以任何浓度使用，只要选择适于产生 L-赖氨酸的浓度。当甘油用作培养基中唯一的碳源时，其优选以约0. 1 50w/V%，更优选约0. 5 40W/v%，特别优选约1 30W/v%的量包含在培养基中。甘油也可与其他碳源如葡萄糖、果糖、蔗糖、赤糖糊、淀粉水解物组合使用。在此情况下，虽然甘油与其他碳源可以任意比例混合，但期望碳源中甘油的比例为10wt%以上，更优选50wt%以上，还更优选 70wt%以上。其他优选的碳源为糖如葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、赤糖糊、淀粉水解物或由生物质水解所得的糖溶液，醇如乙醇，有机酸如延胡索酸、柠檬酸、琥珀酸。其中优选葡萄糖。虽然培养开始时甘油的初始浓度优选如上所述，但随着培养过程中甘油的消耗可补充甘油。使用的甘油可为纯甘油或粗甘油。粗甘油指工业生产的含杂质的甘油。粗甘油是通过将油脂在高温高压下与水接触以将其水解或通过用于生物柴油燃料生产的酯化反应在工业上生产的。生物柴油燃料指通过酯交换反应从油脂和甲醇生成的脂肪酸甲酯，且作为该反应的副产物生成了粗甘油(参见Fukuda, H.，Kondo, A.和Noda, H. 2001，J. Biosci. Bioeng. 92,405-416)。在生物柴油燃料生产工艺中，碱催化剂方法在很多情况下用于酯交换，并添加酸用于中和。因此，生成了包含水和杂质的纯度为约70 95wt%的粗甘油。生物柴油燃料生产工艺中产生的粗甘油除了水之外，还包含残余甲醇和作为催化剂的碱如NaOH 与用于中和碱的酸如K2SO4形成的盐作为杂质。虽然取决于生产者或制造方法，此种盐或甲醇的量可达到百分之几。粗甘油优选含有源自碱和用于中和碱的酸的离子，如钠离子、钾离子、氯离子、硫酸根离子，其量基于粗甘油的重量计为2-7%，优选3-6%，更优选4-5.8%。 虽然可不含甲醇作为杂质，但其优选以0.01%以下的量存在。粗甘油可进一步包含微量金属、有机酸、磷、脂肪酸等。有机酸的实例包括甲酸、乙酸等，虽然可不含它们作为杂质，但它们优选以0.01%以下的量存在。作为粗甘油中包含的微量金属，优选为微生物生长所需的微量金属，且实例包括例如镁、铁、钙、锰、铜、锌等。 按基于粗甘油重量的总量计，镁、铁和钙优选以0. 00001 0. 1%、优选0. 0005 0. 1%, 更优选0. 004 0. 05%、还更优选0. 007 0. 01%的量存在。锰、铜和锌按总量计优选以 0. 000005 0. 01%、优选0. 000007 0. 005%、更优选 0. 00001 0. 001%的量存在。粗甘油的纯度可为10%以上，优选50%以上，更优选70%以上，特别优选80%以上。只要杂质含量在上述范围内，甘油的纯度可为90%以上。使用粗甘油时，可根据甘油的纯度向培养基添加粗甘油使得甘油的量在上述浓度范围内。可向培养基添加甘油和粗甘油两者。
作为氮源，可使用无机铵盐如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵，有机氮如大豆水解物、氨气、氨水等。作为有机微量营养源，培养基期望含有适量的所需物质如维生素BpL-高丝氨酸、酵母提取物等。除上述外，根据需要，少量添加磷酸钾、硫酸镁、铁离子、锰离子等。此夕卜，在本发明中使用的培养基可为天然培养基或合成培养基，只要使用包含碳源、氮源和无机离子以及根据需要包含其他有机微量成分的培养基。培养优选在有氧条件下进行1至7日，培养温度优选为M至37°C，培养过程中的 PH优选为5 9。用于pH调整，可使用无机或有机酸性或碱性物质，氨气等。在生产碱性氨基酸如L-赖氨酸时，可通过下述方法进行生产通过将培养过程中培养基的PH控制为6. 5 9. 0，将培养结束时培养基的pH控制为7. 2 9. 0，提供培养基包含20mM以上的碳酸氢根离子和/或碳酸根离子的培养期，使得这些碳酸氢根离子和/ 或碳酸根离子作为碱性氨基酸的反荷离子来进行发酵，然后收集目标的碱性氨基酸(特开 2002-65287、美国专利申请公开 US2002-0025564A，EP 1813677A)。在培养基中在有氧条件下培养具有碱性氨基酸生产能力的微生物时，可将碳酸根离子或碳酸氢根离子或两者用作碱性氨基酸的主要反荷离子。为了在培养基中以充当碱性氨基酸的反荷离子所需的量提供碳酸氢根离子和/或碳酸根离子，已知可将培养过程中培养基的PH控制为6. 5 9. 0，或在另一个实施例中为6. 5 8. 0，培养结束时培养基的pH 控制为7. 2 9. 0，并可控制发酵罐中的压力使其在发酵过程中为正，或可将二氧化碳或包含二氧化碳的混合气体供予培养基(特开2002-65287、美国专利申请公开20020025564号、 EP1813677A)。可通过如下常规已知方法的组合从发酵液回收L-赖氨酸使用离子交换树脂 (Nagai，H. Separation Science and Technology，39 (16)，3691-3710)、沉淀、膜分离 (特开平 9-164323 号和特开平 9-173792 号)、晶析(W02008/078448、W02008/078646)等。 当L-赖氨酸在细胞中蓄积时，可用例如超声处理等破坏细胞，并可通过离子交换树脂从藉由离心由破坏细胞的悬液去除细胞所得的上清收集L-赖氨酸。回收的L-赖氨酸除了赖氨酸以外可包含细菌细胞、培养基组分、水分和细菌的代谢副产物。收集的L-赖氨酸的纯度可为50%以上，85%以上，甚至95%以上(日本专利 JP1214636B、美国专利 5，431，933,4, 956，471,4, 777，051,4, 946，654,5, 840，358、 6，238，714、美国专利申请公开 US2005/0025878)。此外，当L-赖氨酸在培养基中析出时，可通过离心或过滤等对其进行收集。当在培养基中溶解的L-赖氨酸结晶之后，可将在培养基中析出的L-赖氨酸与在培养基中溶解的L-赖氨酸一起分离。实施例以下通过实施例更加具体地说明本发明。[实施例1]破坏fucO基因的需钠弧菌的构建破坏了赖氨酸生产细菌需钠弧菌观-15的染色体上的fucO基因。首先，使用具有枯草芽孢杆菌的sacB基因的pDNR-Dual Doner载体(Clontech公司，USA)作为模板DNA，具有SEQ ID NO :3和4的序列的合成DNA作为引物，通过PCR扩增了枯草芽孢杆菌的sacB基因。sacB基因是编码果聚糖蔗糖酶(levari sucrase)、用于高效选择其载体部分从染色体上消除的菌株的基因6chafer，A.等，Gene，145，69_73，(1994))。艮口，若表达果聚糖蔗糖酶，同化蔗糖且生成的果聚糖对细菌具有致死作用使得它们无法生长。因此，携带果聚糖蔗糖酶的载体仍然保留在染色体上的菌株在含有蔗糖的平板上培养时无法生长，从而可在含有蔗糖的平板上选择载体消除的菌株。通过将扩增的sacB基因片段和pUT399用限制性酶EcoRI消化并连接以获得载体 pUT_sacB。在此使用的pUT399为具有R6K的复制起点、并包含接合转移所需的mob区的质粒，并且其为在不具有Pir基因的菌株中无法复制的质粒(美国专利7，090, 998号)。然后， 使用需钠弧菌观-15的染色体DNA作为模板DNA，具有SEQ ID NO :5和6或者SEQ ID NO 7 和8的序列的合成DNA作为引物进行PCR，分别扩增了 fucO基因两侧约SOObp的序列。然后使用所得的两种PCR产物的混合物作为模板，具有SEQ ID NO 5和7的序列的合成DNA 作为引物再次进行PCR。将所得的PCR产物和pUT_sacB —同用限制性酶MlI和SphI消化并连接以获得载体pUT_sacB_fucOFR。pUT_sacB_fucOFR为缺少fucO编码区的一部分用于破坏fucO基因的质粒。并将pUT_sacB_fucOFR导入大肠杆菌S17-1 ( λ pir+，可从Biomedal 获得R. Simon.等，Bio/technology，1 :784-791 (1983))以获得 S17_l/pUT_sacB_fuc0FR。接着，将S17_l/pUT_sacB_fuc0FR接种入1. 5ml LB培养基(包含10g/L细菌胰蛋白胨(Bacto-tryptone)，5g/L 细菌酵母提取物(Bacto-yeast extract)，5g/LNaCl 禾口 40mg/ L氯霉素，pH 7. 0)，并在37°C培养18小时。通过将获得的培养基离心(在5000rpm，5分钟)来收集细胞，并悬于50 μ 1新鲜LB培养基。将此细胞悬液接种于LB-NaCl琼脂培养基 (包含10g/L细菌胰蛋白胨、5g/L细菌酵母提取物、30g/LNaCl、0. 4g/LMgS04* 20g/L琼脂， PH 7.0)上形成直径2cm的圆形，并通过将接种的培养基在室温放置30分钟来干燥。同时， 将需钠弧菌28-15接种入1. 5ml LB-NaCl培养基(包含10g/L细菌胰蛋白胨、5g/L细菌酵母提取物、30g/L NaCl和0. 4g/L MgSO4, pH 7. 0)，并在37°C培养18小时。通过将获得的培养基离心(在6000rpm，2分钟)来收集细菌，并悬于50 μ 1新鲜的LB-NaCl培养基。将此细胞悬液接种于先前以圆形接种S17-l/pUT sacB fucOFR的位置，并通过将接种的培养基在室温放置30分钟来干燥。然后，将细胞在37°C放置4小时以通过接合转移将S17-1/ pUT_sacB_fucOFR 携带的 pUT_sacB_fucOFR 转移至需钠弧菌沘_15。将获得的细菌细胞刮在一起，并悬于Iml LB-NaCl培养基，然后将其全部体积的悬液接种于TCBS琼脂培养基(包含5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，17g/L蔗糖，10g/L硫代硫酸钠(五水合物)，10g/L柠檬酸钠(二水合物)，3g/L胆酸钠，lg/L柠檬酸铁，10g/L氯化钠，5g/L牛胆汁末，0. 04g/L溴百里酚蓝，0. 05g/L百里酚蓝，15g/l琼脂以及10mg/L氯霉素，日水制药公司，日本)上，并且培养在37°C进行18小时而形成黄色菌落。在TCBS培养基上，大肠杆菌无法增殖。此外，pUT_sacB_fuc0FR无法在需钠弧菌观-15中复制。因此， 获得的菌落是通过在染色体上导入pUT_sacB_fUc0FR而获得氯霉素抗性的需钠弧菌观-15 株的菌落。将该株接种于补充了 10% (w/v)蔗糖的LB-NaCl培养基，并允许菌落形成以获得用在染色体上插入的pUT_sacB_fuc0FR的消除而破坏染色体上的fucO基因的需钠弧菌 28-15 (需钠弧菌28-15 Δ fucO)。使用由获得的株以常规方式提取的染色体DNA作为模板 DNA,具有SEQ ID NO 9和10的序列的DNA作为引物，通过PCR来确认fucO基因的破坏。[实施例2]检查需钠弧菌28-15 Δ fucO的L-赖氨酸分解活性
通过电穿孔将pCABD2 (美国专利6，040, 160号说明书)导入需钠弧菌 28-15 AfucO和需钠弧菌沘-15。电穿孔是使用Gene pluser Xcell (BioRad公司，USA)， 以9kV/cm、25 μ F、200 Ω的脉冲条件进行的。 将获得的需钠弧菌28-15 Δ fuc0/pCABD2和需钠弧菌^_15/pCABD2各自在 LB-NaCl琼脂培养基(包含500mg/L链霉素)上在37°C培养10小时。将获得的细胞刮在一起，接种于坂口烧瓶(500ml容量)中的20ml MS培养基(包含500mg/L链霉素)至0D660为 0. 1，并在37°C振荡培养。每个株在3支烧瓶中进行培养。将培养基定期取样Iml的体积，并测量0D660以及培养基中的葡萄糖浓度和L-赖氨酸浓度。使用分光光度计DU-800 (Beckman Coulter, USA)对于用2% (w/v) NaCl水溶液稀释51倍的培养基测量0D660。使用Biotech Analyzer AS-300 (Sakura Seiki Co.，Ltd.，日本)测量培养基中葡萄糖浓度和L-赖氨酸浓度。[MS 培养基](终浓度)
葡萄糖40g/L (单独灭菌)
MgSO4 · 7H201 g/L (单独灭菌)
(NH4)2SO416 g/L
KH2PO41 g/L
酵母提取物2 g/L
FeSO40.01 g/L
MnSO40.01 g/L
CaCO330 g/L (单独灭菌)
NaCl15g/L结果，对于需钠弧菌28-15 Δ fuc0/pCABD2，观察到蓄积了 IOmM的L-赖氨酸，并在葡萄糖完全消耗之后未观察到L-赖氨酸的分解(图1)。相反，对于fucO基因未破坏的株，虽然观察到蓄积了最高3mM的L-赖氨酸，但在之后观察到L-赖氨酸的分解。S卩，对于 fucO-缺陷株，与未缺失fucO基因的株相比，观察到超过3倍高的L-赖氨酸蓄积，并且还抑制了 L-赖氨酸的分解。如上所述，表明fucO基因涉及需钠弧菌中L-赖氨酸的分解的可能性。因此，需钠弧菌的L-赖氨酸分解途径可与从L-赖氨酸生成尸胺的途径相异。[实施例3]然后，对于需钠弧菌15 Δ fuc0/pCABD2，通过使用葡萄糖作为碳源在高盐浓度下进行了 L-赖氨酸的生产。将需钠弧菌28-15 Δ fuc0/pCABD2在LB-NaCl琼脂培养基 (包含500mg/L链霉素)上在37°C培养8小时。将获得的细胞刮在一起，接种入坂口烧瓶 (500ml容量)中的20ml MS培养基(包含500mg/L链霉素和0-8% (w/v) NaCl)至0D660 为0. 1，并在37°C振荡培养。对于每个盐浓度将株在3支烧瓶中进行培养。将培养基定期取样Iml的体积，并测量0D660以及培养基中的葡萄糖浓度和L-赖氨酸浓度。使用分光光度计DU-800 (Beckman Coulter, USA)对于用2% (w/v)NaCl水溶液稀释51倍的培养基测量 0D660。使用 Biotech Analyzer AS-300 (Sakura Seiki Co. ,Ltd.，日本)测量培养基中葡萄糖浓度和L-赖氨酸浓度。结果，在添加6% (w/v)NaCl的培养条件下观察到蓄积了最高27mM L-赖氨酸，此时基于消耗的糖，L-赖氨酸得率为12% (w/w)(图2)。[实施例4]然后，对于需钠弧菌^-15Afuc0/pCABD2，通过使用甘油作为碳源进行了 L-赖氨酸的生产。具体而言，将需钠弧菌28-15 Δ fuc0/pCABD2在LB-NaCl琼脂培养基(包含 500mg/L链霉素)上在37°C培养8小时。将获得的细胞刮在一起，并接种入20ml MS培养基(包含500mg/L链霉素，以及2% (w/v)或4% (w/v)NaCl)至0D660为0. 1，在37°C振荡培养。使用纯正化学公司(日本)生产的甘油作为碳源甘油。对于每个盐浓度将株在3支烧瓶中进行培养。将培养基定期取样Iml的体积，并测量0D660以及培养基中的甘油浓度和L-赖氨酸浓度。使用分光光度计DU-800 (Beckman Coulter, USA)对于用2% (w/v) NaCl 水溶液稀释51倍的培养基测量0D660。使用Biosensor BF_5 (王子测定机器公司，日本) 测量培养基中的甘油浓度，并使用Biotech Analyzer AS-300 (Sakura Seiki Co. ,Ltd.，日本)测量L-赖氨酸浓度。结果，在添加4% (w/v) NaCl的培养条件下观察到蓄积了最高30mM L-赖氨酸，并且基于消耗的甘油，L-赖氨酸得率为15% (w/w)(图3)。[实施例5]除了使用需钠弧菌野生型株ATCC14048株(NBRC15636、AJ13670)替代需钠弧菌 28-15株而之外，以与实施例1用于获得需钠弧菌28-15 AfucO的相同的方式，获得了破坏 7 fucO基因的VLD01株。[实施例6]对于需钠弧菌^-15Afuc0/pCABD2、VLD01/pCABD2 以及需钠弧菌 ATCC14048/ PCABD2，通过使用甘油作为碳源，在MS4Y培养基(其为过量补充酵母提取物的MS培养基) 中进行L-赖氨酸的生产。首先，将各株在LB-NaCl琼脂培养基(包含500mg/L链霉素)上在37°C培养8小时。将获得的细胞刮在一起，接种入20ml MS4Y培养基至0D660为0. 1，并在37°C振荡培养。使用纯正化学公司(日本)生产的甘油作为碳源甘油。各株在2支烧瓶中进行培养。将培养基定期取样Iml的体积，并测量0D660以及培养基中甘油浓度和L-赖氨酸浓度。使用分光光度计DU-800 (Beckman Coulter，USA)对于用INHCl水溶液稀释50 倍的培养基测量0D660。使用Biosensor BF_5 (王子测定机器公司，日本)测量培养基中的甘油浓度，并使用 Biotech Analyzer AS-300 (Sakura Seiki Co.，Ltd.，日本)测量 L-赖氨酸浓度。[MS4Y 培养基](终浓度)甘油40g/L (单独灭菌)
MgSO4 · 7H201 g/L (单独灭菌)
(NH4)2S0424 g/L
KH2PO41 g/L
酵母提取物8 g/L
FeSO40.01 g/L
MnSO40.01 g/L
CaCO330 g/L (单独灭菌)
NaCl20 g/L (单独灭菌)在过量补充酵母提取物的培养基中，需钠弧菌28-15 Δ fuc0/pCABD2蓄积了 61mM 的L-赖氨酸(图4)。在此情况中，基于消耗的甘油，L-赖氨酸得率为(w/w) 0此外， 对于VLD01/pCABD2，亦观察到蓄积了 45mML_赖氨酸，而且基于消耗的甘油，L-赖氨酸收率为21% (w/w) 0对于需钠弧菌ATCC14048/pCABD2基本上未观察到L-赖氨酸的蓄积。[序列表说明]SEQ ID NO=I 需钠弧菌的fucO基因的核苷酸序列SEQ ID NO 2 由需钠弧菌的fucO基因编码的氨基酸序列SEQ ID NO 3 用于扩增sacB基因的PCR引物的核苷酸序列SEQ ID NO 4 用于扩增sacB基因的PCR引物的核苷酸序列SEQ ID NO 5 用于扩增fucO基因两侧0. 8kbp序列的PCR引物的核苷酸序列SEQ ID NO 6 用于扩增fucO基因两侧0. 8kbp序列的PCR引物的核苷酸序列SEQ ID NO 7 用于扩增fucO基因两侧0. 8kbp序列的PCR引物的核苷酸序列SEQ ID NO 8 用于扩增fucO基因两侧0. 8kbp序列的PCR引物的核苷酸序列SEQ ID NO 9 用于确证染色体上fucO基因的破坏的PCR引物的核苷酸序列SEQ ID NO 10 用于确证染色体上fucO基因的破坏的PCR引物的核苷酸序列SEQ ID NO 11 需钠弧菌的AKO基因的核苷酸序列SEQ ID NO 12 由需钠弧菌的AKO基因编码的氨基酸序列SEQ ID NO 13 需钠弧菌的thrA基因的核苷酸序列SEQ ID NO 14 由需钠弧菌的thrA基因编码的氨基酸序列SEQ ID NO 15 需钠弧菌的metL基因的核苷酸序列SEQ ID NO 16 由需钠弧菌的metL基因编码的氨基酸序列SEQ ID NO 17 需钠弧菌的IysC基因的核苷酸序列SEQ ID NO 18 需钠弧菌的IysC基因编码的氨基酸序列SEQ ID NO 19 需钠弧菌的推定AK基因的核苷酸序列SEQ ID NO 20 由需钠弧菌的推定AK基因编码的氨基酸序列产业上的利用可能性依照本发明的方法，可使用弧菌属细菌高效地生产L-赖氨酸。具体而言，使用fucO基因有缺陷的弧菌属细菌，抑制随时间蓄积的L-赖氨酸的分解，从而可非常高效地蓄积L-赖氨酸。
权利要求
1.一种产生L-赖氨酸的方法，其包括在培养基中培养具有L-赖氨酸生产能力的弧菌属(Vibrio)细菌，以在该培养基中或细菌细胞内产生并蓄积L-赖氨酸，并从该培养基或细胞收集L-赖氨酸，其中所述弧菌属细菌经过修饰而减少了由fucO基因编码的蛋白的活性。
2.权利要求1的方法，其中所述蛋白的活性是通过向fucO基因的编码区和/或该基因的表达调控区中导入突变而减少的。
3.权利要求1或2的方法，其中破坏了染色体上的fucO基因。
4.权利要求1至3中任一项的方法，其中所述蛋白是如下述(A)或(B)所限定的蛋白(A)具有SEQID NO :2所示的氨基酸序列的蛋白，(B)具有在SEQID NO :2所示的氨基酸序列中包含一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加而得到的氨基酸序列，并且在细菌中活性减少时可改善L-赖氨酸生产能力的蛋白。
5.权利要求1至4中任一项的方法，其中所述fucO基因是如下述(a)或(b)所限定的DNA (a)包含SEQID NO 1的核苷酸序列的DNA，(b)与SEQID NO :1的核苷酸序列或能够从该核苷酸序列制备的探针在严格条件下杂交，并编码在细菌中活性减少时可改善L-赖氨酸生产能力的蛋白的DNA。
6.权利要求1至5中任一项的方法，其中一种或两种或更多种选自下组的酶的活性得到增强二氢吡啶二羧酸合酶、天冬氨酸激酶、二氢吡啶二羧酸还原酶和二氨基庚二酸脱氢酶。
7.权利要求1至6中任一项的方法，其中所述弧菌属细菌是需钠弧菌(Vibrio natriegens)0
8.权利要求1至7中任一项的方法，其中所述培养基含有甘油作为碳源。
9.一种弧菌属细菌，其具有L-赖氨酸生产能力，并经过修饰而减少了由fucO基因编码的蛋白的活性。
10.权利要求9的弧菌属细菌，其为需钠弧菌。
全文摘要
通过如下产生L-赖氨酸在培养基中培养具有产生L-赖氨酸的能力，并经修饰使得由fucO基因编码的蛋白活性降低的弧菌属细菌以在培养基或细菌细胞中产生和蓄积L-赖氨酸，并从培养基或细胞收集L-赖氨酸。
文档编号C12N1/21GK102471791SQ20108003456
公开日2012年5月23日 申请日期2010年6月28日 优先权日2009年8月3日
发明者井之上一平, 安枝寿 申请人:味之素株式会社