专利名称：新脂肪酸延伸组合物及其用途的制作方法
新脂肪酸延伸组合物及其用途本发明主要涉及脂肪酸的重组产生领域。其提供编码新脂肪酸脱水酶/烯酰-C0A 还原酶(nECR)家族成员的核酸分子。本发明也提供含有nECR核酸分子的重组表达载体、 已经引入了表达载体的宿主细胞，以及用于大规模产生长链多不饱和脂肪酸(LCPUFA)，如 ARA、ERA和DHA的方法。脂肪酸是具有长链碳氢化合物侧基的羧酸，其在许多生物学过程中发挥着重要的作用。在自然界中，很少发现脂肪酸是游离的，且相反，其以酯化形式存在，作为脂质的主要组分。因此，脂质/脂肪酸是能量的来源(例如，b_氧化)。此外，脂质/脂肪酸是细胞膜的组成部分，并因此对于处理生物学或生物化学信息是必不可少的。可以将脂肪酸分为两组单碳键形成的饱和脂肪酸和含有一个或多个顺式构型的碳双键的不饱和脂肪酸。不饱和脂肪酸通过末端去饱和酶产生，所述末端去饱和酶属于非血红素铁酶种类。这些酶的每一种都是电子传递系统的一部分，所述电子传递系统含有两种其他的蛋白质，命名为细胞色素b5和NADH-细胞色素b5还原酶。具体而言，此类酶例如，通过催化脂肪酸的氧依赖性脱氢作用，催化脂肪酸分子的碳原子之间双键的形成 (Sperling等人，2003)。人类和其他哺乳动物具有有限的去饱和酶谱，所述去饱和酶对于在不饱和脂肪酸中形成特殊的双键是必需的，因此，对于合成必需脂肪酸，如长链多不饱和脂肪酸(LCPUFA)具有有限的能力。因而，人类不得不通过他们的饮食吸收一些脂肪酸。此类必需脂肪酸包括，例如亚油酸(C18:2)，亚麻酸(C18:3)。相反，昆虫、微生物和植物能合成更多种类的不饱和脂肪酸及其衍生物。事实上，脂肪酸的生物合成是植物和微生物的主要活性。长链多不饱和脂肪酸(LCPUFA)例如二十二碳六烯酸(DHA，22:6 (4，7，10，13，16， 19))在哺乳动物中是多种组织和器官(神经、视网膜、脑和免疫细胞)的细胞膜的必需组分。例如，在脑磷脂中，超过30 %的脂肪酸是22:6 (n-3)和20:4 (n-6) (Crawford, M. A.， 等人，(1997) Am. J. Clin. Nutr. 66 1032S-1041S) 在视网膜中，DHA 在视杆外段(rod outersegment)(感光细胞的光敏感部分)中占总脂肪酸的60%以上(Giusto, N. M.,等人 (2000) Prog. Lipid Res. 39 :315-391)。临床研究显示，DHA对于婴儿脑的生长和发育，和对于成人中正常脑功能的维持是必需的(Martinetz, M. (1992) J. Pediatr. 120 :S129_S138)。 DHA也对参与信号转导过程、视紫红质活化和视杆和视锥发育的光受体功能具有显著的影响(Giusto，N. M.，等人(2000) Prog. Lipid Res. 39 :315-391)。此外，也发现 DHA 对疾病如高血压、关节炎、动脉硬化、抑郁、血栓形成和癌症具有一些积极的影响(Horrocks, LA.和 Yeo, Y. K. (1999)Pharmacol. Res. 40 :211-215)。因此，合适的饮食供应脂肪酸对于人类健康是重要的。由于婴儿、幼童和老人不能有效地合成此类脂肪酸，所以对于这些个体从饮食中足够地摄取这些脂肪酸是特别重要的(Spector，A. A. (1999) Lipids34 :S1_S3)。目前，DHA的主要来源是来自鱼和藻类的油。鱼油是这种脂肪酸的主要和常规来源，然而，其通常在销售时被氧化。另外，特别是由于鱼类种群缩减，鱼油的供应也变化不一。此外，由于提取的产量低和花费高，藻类来源的油比较昂贵。EPA和ARA都是必需脂肪酸。它们形成了用于人类和动物的食物和饲料组分的独特种类。EPA属于在酰基链中具有5个双键的n-3系列。EPA见于海产品中，并在来自北大西洋的油质鱼中含量丰富。ARA属于具有4个双键的n-6系列。在ω-3位置中缺失的双键赋予ARA不同于EPA中所观察到的特性的特性。产生自AA的类二十烷酸具有强的炎症性和血小板聚集特性，然而那些衍生自EPA的类二十烷酸具有抗炎症和抗血小板聚集特性。ARA 可以获自一些食物如肉、鱼和蛋,但浓度较低。Y -亚麻酸(GLA)是在哺乳动物中发现的另一种必需脂肪酸。GLA是极长链n-6脂肪酸和多种活性分子的代谢中间物。在哺乳动物中，长链多不饱和脂肪酸的形成受Λ6去饱和作用的限速。许多生理和病理状况如衰老、应激、糖尿病、湿疹和一些传染病都显示出降低Λ6去饱和作用的步骤。此外，氧化和与某些疾病，如癌症或炎症相关的快速细胞分裂可以容易地分解代谢GLA。因此，饮食补充GLA可以降低这些疾病的风险。临床研究已经显示，饮食补充GLA可以有效地治疗一些病理疾病如特应性湿疹、经前期综合征、糖尿病、高胆固醇血症，以及炎症和心血管疾病。尽管生物技术提供了用于产生特定脂肪酸的诱人途径，但当前技术还不能提供用于大规模生产不饱和脂肪酸的有效方法。因此，对于改进并有效的产生不饱和脂肪酸，例如 DHA, EPA和ARA的方法，还存在需求。因此，本发明涉及包含这样的核酸序列的多核苷酸，所述核酸序列选自a)具有SEQ ID NO :1或3显示的核苷酸序列的核酸序列；b)编码这样的多肽的核酸序列，所述多肽具有SEQ ID NO :2或4显示的氨基酸序列；c)与a)或b)的核酸序列具有至少50%同一性的核酸序列，其中所述核酸序列编码具有脱水酶/烯酰-CoA还原酶(nECR)活性的多肽；d)编码具有nECR活性并与a)至c)任意之一的氨基酸序列具有至少50%同一性的氨基酸序列的多肽的核酸序列；和e)能在严格条件下与a)至d)任意之一杂交的核酸序列，其中所述核酸序列编码具有nECR活性的多肽。根据本发明，术语“多核苷酸”用于指包含这样的核酸序列的多核苷酸，所述核酸序列编码具有脱水酶/烯酰-CoA还原酶(nECR)活性的多肽。优选地，由本发明的多核苷酸编码的具有nECR活性的多肽，当在植物中表达时应当能增加例如，种子油或者整株植物或其部分中PUFA和特别是LCPUFA的量。当与产LCPUFA的转基因对照植物比较时，该增加优选地是统计学显著的，所述产LCPUFA的转基因对照植物表达极小集(minimal set)的对于LCPUFA合成所需的去饱和酶和延伸酶，但是并不表达本发明的多核苷酸。可以通过本领域熟知的统计学检验，包括例如Student' s t-检验测定增加是否显著。更优选地，与所述对照比较，增加是含LCPUFA的甘油三酯的量的至少5%、至少10%、至少15%、至少20%或至少30%的增加。优选地，前面提及的LCPUFA是具有C-20、C-22或C24脂肪酸体的多不饱和脂肪酸，更优选是ARA、EPA或DHA。在所附实施例中描述了用于测量前述活性的合适测定法。如本文中所用，术语“nECR活性”或“脱水酶/烯酰-CoA还原酶活性”指烯酰-CoA 还原酶和脱水酶的组合活性，即该酶具有组合的活性，能从3-羟基-酰基-CoA中去除羟基，并还原所形成的双键(作为脂肪酸的延伸过程的一部分)。在四个步骤中催化脂肪酸延伸，由四种酶代表=KCS (酮基-酰基-CoA合酶)、KCR(酮基-酰基-CoA还原酶)、DH(脱水酶)、和ECR(烯酰-CoA还原酶)。在第一个步骤中，脂肪酸-CoA酯与丙二酰-CoA缩合产生酮-酰基-CoA中间物(其通过两个碳原子延伸)和C02。然后KCR将中间物的酮基团还原成羟基基团。在接下来的步骤中，DH切割羟基基团(产生H2O),形成酰基-2-en-CoA 酯(Λ -2-烯酰-CoA)。在最终步骤中，ECR还原位置2、3处的双键，形成延伸的酰基-CoA 酉旨(Buchanan, Gruissem, Jones(2000)Biochemistry & Molecular biology of plants, American Society of Plant Physiologists)。在产生本发明的研究中，提供了天然存在的针对LCPUFA具有优良催化活性和特异性的DH和ECR的融合物。更优选地，多核苷酸具有如在SEQ ID NO :1或3中所示的核酸序列的多核苷酸，所述核酸序列编码具有如在SEQ ID NO :2或4中所示的氨基酸序列或其变体,优选地显示出 nECR活性的多肽。根据本发明，如上所述的编码具有nECR活性的多肽的多核苷酸优选地获自假微型海链藻(Thalassiosira pseudonana)或三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)。 然而，可以从其他物种中鉴定直向同源物、旁系同源物或者其他同源物。优选地，它们获自植物如藻类，例如等鞭金藻属(Isochrysis)、Mantoniella、Ostreococcus或 Crypthecodinium,藻类 / 娃藻类如褐指藻属(Phaeodactylum)、海链藻属(Thalassiosira) 或破囊壶菌属(Thraustochytrium)、藓类植物如剑叶藓属(Physcomitrella)、角齿藓属 (Ceratodon)或者高等植物如报春花科(Primulaceae)如石栗(Aleuritia)、Calendula stellata、Osteospermum spinescens 或者 Osteospermum hyoseroides,微生物如真菌， 例如曲霉属(Aspergillus)、疫霉属(Phytophthora)、虫霉属(Entomophthora)、毛霉属 (Mucor)或者被孢霉属(Mortierella),细菌如Shewanella,酵母或动物。优选的动物是线虫如新杆状线虫(Caenorhabditis)，昆虫或者脊椎动物。在脊椎动物中，该核酸分子可以优选地来源于真骨类(Euteleostomi)、福鳍鱼纲(Actinopterygii);新鳍类(Neopterygii)； 真骨鱼类(Teleostei);真真骨鱼(Euteleostei)、原棘鳍总目(Protacanthopterygii)、 鲑目(Salmoniformes);鲑科(Salmonidae)或大麻哈鱼属(Oncorhynchus),更优选地来源鲑目，最优选地，鲑科，如鲑属(Salmo)，例如来自下述的属和种:虹鳟(Oncorhynchus mykiss)、Trutta trutta或河鲑(Salmo truttafario)。此外，该核酸分子可以获自娃藻类如海链藻属(Thallasiosira)或褐指藻属。因此，根据本发明所用的术语“多核苷酸”另外涵盖了上述特定多核苷酸的变体， 其代表了本发明多核苷酸的直向同源物、旁系同源物或者其他同源物。此外，本发明多核苷酸的变体也包括人工改造的突变蛋白。所述突变蛋白包括，例如通过诱变技术产生的并且显示出改进的或者改变的底物特异性的酶、或者密码子优化的多核苷酸。多核苷酸变体优选地包含这样的核酸序列，所述核酸序列的特征在于，通过至少一个核苷酸取代、添加和/或缺失，其序列可以衍生自前述SEQ ID NO :1或3的任意之一显示的特定核酸序列或者通过编码具有如在SEQ ID NO :2或4的任意之一中所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸衍生，从而，变体核酸序列应当仍编码具有如上所指定的nECR活性的多肽。变体还包括这样的多核苷酸，其包含能与上述特定核酸序列杂交的核酸序列，优选在严格条件下能与上述特定核酸序列杂交的核酸序列。这些严格条件是技术人员已知的，并可见于Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989),6. 3. 1-6. 3. 6。严格杂交条件的优选实例是在约45 °C的6x氯化钠/柠檬酸钠(=SSC)中杂交，然后在50-65 °C 下在O. 2xSSC,0. 1% SDS中进行一次或多次洗涤步骤。技术人员知道根据核酸类型和例如当存在有机溶剂时，在温度和缓冲液浓度方面，杂交条件中是不同的。在“标准杂交条件” 下，在浓度为O. I至5 X SSC (pH 7. 2)的水性缓冲溶液中，根据核酸类型，杂交温度在42°C 和58°C之间。如果上述缓冲液中存在有机溶剂，例如50%甲酰胺，则标准条件下的杂交温度是大约42°C。对于DNA:DNA杂交体，杂交条件优选是O. I X SSC和20°C至45°C，优选在 30°C至45°C之间。对于DNA: RNA杂交体，杂交条件优选是O. I X SSC和30°C至55°C，优选在 45°C至55°C之间。上述杂交温度是针对例如长度约IOObp (=碱基对)，G+C含量为50%的核酸，在缺少甲酰胺的情况下确定的。技术人员在教科书帮助下知道如何确定需要的杂交条件，例如上述的，或者来自以下教科书Sambrook等人,Molecular Cloning, Cold Spring HarborLaboratory, 1989 ；Hames 和 Higgins (编著)1985, “NucleicAcids Hybridization A Practical Approach，，，IRL Press at OxfordUniversity Press, Oxford ；Brown(编著)1991,“Essential Molecular Biology A Practical Approach，，，IRL Press at Oxford University Press, Oxford。备选地,通过基于PCR的技术如基于混合的寡核苷酸引物的 DNA扩增，即使用针对本发明多肽的保守结构域的简并引物，可以获得多核苷酸变体。本发明多肽的保守结构域可以通过序列比较本发明多核苷酸的核苷酸序列或者多肽的氨基酸序列来鉴定。在所附实施例中描述了适用作为PCR引物的寡核苷酸以及合适的PCR条件。 对于模板，可以使用来自细菌、真菌、植物或动物的DNA或cDNA。此外，变体包括这样的多核苷酸，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO :1或3的任意之一中所示的核酸序列具有至少50%、 至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、 至少95%、至少98%或至少99%同一性的核酸序列，优选地，其编码保留了如上所指定的 nECR活性的多肽。此外，还包括这样的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码具有与SEQ ID NO: 2或4的任意之一中所示的氨基酸序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %、至少98 %或至少99 %同一性的氨基酸序列的多肽的核酸序列，其中所述多肽，优选地其保留了如上所指定的nECR活性。优选地，在整个氨基酸或核酸序列区计算百分比同一性值。对于比较不同的序列，技术人员可以得到一系列基于多种算法的程序。在一个优选的实施方案中，使用已经整合到 EMBOSS软件包中的needle程序(EMBOSS TheEuropean Molecular Biology Open Software Suite, Rice, P.，Longden, I.，和 Bleasby, A, Trends in Genetics 16 (6)，276-277，2000) 中的 Needleman 和 Wunsch 算法(Needleman 1970, J. Mol. Biol. 48 ;443_453),使用用于远距离相关(distantly related)蛋白质的BLOSUM 45或PAM250评分矩阵或者用于密切相关蛋白质的BLOSUM 62或PAM160评分矩阵，以及16、14、12、10、8、6或4的空位开放罚分和0. 5、I、2、3、4、5或6的空位延伸罚分测定两个氨基酸序列之间的百分比同一性。可以在 http: //emboss. sourceforRe. net 发现 EMBOSS 包的本地安装以及与 WEB-Services 连接的指导。使用needle程序用于比对两个氨基酸序列的参数的优选非限制性实例是默认参数， 包括EBL0SUM62评分矩阵、10的空位开放罚分和0. 5的空位延伸罚分。又在另一优选的实施方案中，使用EMBOSS软件包中的needle程序(EMBOSS The European MolecularBiology Open Software Suite, Rice, P. , Longden, I.,和 Bleasby, A, Trends inGenetics 16(6), 276-277,2000)，使用EDNAFULL评分矩阵和16、14、12、10、8、6或4的空位开放罚分和O. 5、1、2、3、4、5或6的空位延伸罚分测定两个核苷酸序列之间的百分比同一性。使用needle程序，同时用于比对两个序列的参数的优选的、非限制性实例是默认参数，包括EDNAFULL评分矩阵、10的空位开放罚分和O. 5的空位延伸罚分。可以将本发明的核酸和蛋白质序列另外地用作为“查询序列”以对公共数据库进行检索，以例如鉴定其他家族成员或者相关序列。可以使用 Altschul 等人(Altschul 1990，J. Mol. Biol. 215 :403-10)的 BLAST 系列程序(版本2. 2)进行此类检索。使用本发明的nECR核酸序列作为查询序列，可以进行BLAST， 使用默认参数的BLASTn、BLASTx或tBLASTx程序，以获得与本发明的nECR序列同源的核苷酸序列(BLASTn、tBLASTx)或氨基酸序列(BLASTx)。使用本发明的nECR蛋白质序列作为查询序列可以进行BLAST，使用默认参数的BLASTp或tBLASTn程序，以获得与本发明的nECR 序列同源的氨基酸序列(BLASTp)或核酸序列(tBLASTn)。为了获得用于比较目的的空位比对，如在 Altschul 等人(Altschul 1997，Nucleic Acids Res. 25(17) :3389-3402)中所述，可以应用使用默认参数的Gapped BLAST。表I :用于多种BLAST程序的查询和命中序列的序列类型的关系
权利要求
1.多核苷酸，其包含选自以下的核酸序列a)具有如在SEQID NO :1或3中所示的核苷酸序列的核酸序列；b)编码具有在SEQID NO :2或4中所示的氨基酸序列的多肽的核酸序列；c)与a)或b)的核酸序列具有至少50%同一性的核酸序列，其中所述核酸序列编码具有nECR活性的多肽；d)编码具有nECR活性并与a)至c)任意之一的氨基酸序列具有至少50%同一性的氨基酸序列的多肽的核酸序列；和e)能在严格条件下与a)至d)任意之一杂交的核酸序列，其中所述核酸序列编码具有 nECR活性的多肽。
2.权利要求I的多核苷酸，其中所述多核苷酸另外包含与所述核酸序列有效连接的表达调控序列。
3.权利要求I或2的多核苷酸，其中所述多核苷酸另外包含与所述核酸序列有效连接的终止子序列。
4.载体，其包含权利要求I至3中任一项所述的多核苷酸。
5.宿主细胞，其包含权利要求I至3中任一项所述的多核苷酸或者权利要求4所述的载体。
6.产生由权利要求I至3中任一项所述的多核苷酸编码的多肽的方法，包括a)在允许所述多肽产生的条件下培养权利要求5所述的宿主细胞；和b)从步骤a)的宿主细胞获得所述多肽。
7.多肽，其由权利要求I至3中任一项所述的多核苷酸编码或者其通过权利要求6所述的方法获得。
8.非人类转基因生物，其包含权利要求I至3中任一项所述的多核苷酸或者权利要求 4所述的载体。
9.权利要求8的非人类转基因生物，其是植物、植物部分或者植物种子。
10.用于产生多不饱和脂肪酸的方法，包括a)在允许多不饱和脂肪酸在宿主细胞中产生的条件下培养权利要求5所述的宿主细胞；和b)从所述宿主细胞获得所述多不饱和脂肪酸。
11.用于产生多不饱和脂肪酸的方法，包括a)在允许多不饱和脂肪酸在所述宿主细胞中产生的条件下培养权利要求8或9所述的非人类转基因生物；和b)从所述非人类转基因生物获得所述多不饱和脂肪酸。
12.权利要求10或11的方法，其中所述多不饱和脂肪酸是花生四烯酸(ARA)、二十碳五烯酸(EPA)或二十二碳六烯酸(DHA)。
13.用于产生油、脂质或脂肪酸组合物的方法，包括权利要求10至12中任一项所述的方法的步骤和将所述多不饱和脂肪酸配制为油、脂质或脂肪酸组合物的另外步骤。
14.权利要求13的方法，其中将所述油、脂质或脂肪酸组合物用于饲料、食品、化妆品或药物。
15.包含多不饱和脂肪酸的油，所述多不饱和脂肪酸通过权利要求10至12中任一项所述的方法获得。
全文摘要
本发明提供编码新脂肪酸nECR的分离的核酸分子。本发明也提供含有nECR核酸分子的重组表达载体、已经引入了表达载体的宿主细胞，以及用于大规模产生长链多不饱和脂肪酸(LCPUFA)，如ARA、ERA和DHA的方法。
文档编号C12N15/82GK102597242SQ201080034907
公开日2012年7月18日 申请日期2010年5月20日 优先权日2009年6月8日
发明者F·博杜安, J·A·内皮尔, O·萨亚诺娃 申请人:罗特哈姆斯泰德研究有限公司