专利名称：：包含血凝素的嵌合流感病毒样颗粒的制作方法
技术领域：
：本申请要求于2009年6月M日提交的美国临时申请No.61/220，161的优先权。本发明涉及病毒样颗粒。更具体而言，本发明涉及包含嵌合流感血凝素的病毒样颗粒和生产嵌合流感病毒样颗粒的方法。
背景技术：
：流感是由呼吸道病毒引起的人死亡的首要原因，在流感季节，估计全世界1020%的人口被感染，每年导致250500,000的死亡。目前抗击人流感的方法是每年接种。疫苗通常是几种毒株的组合，这些毒株被预测为即将到来的流感季节的强势毒株(dominantstrain)，但是每年生产的疫苗剂数量不足以接种全世界人口。例如，根据目前的产量加拿大和美国获得足以免疫其约三分之一人口的疫苗剂，而仅有17%的欧洲人口可接种疫苗——在世界范围的流感大流行到来时，该产量是不够的。即使在给定年份中所需的年产量可以某种方式实现，但强势毒株逐年变化，因此在一年中的低需求时间大量储备是不实际的。经济、大规模地生产有效的流感疫苗是政府和私营企业等极为关注的。流感血凝素(HA)表面糖蛋白是受体结合蛋白也是膜融合蛋白。它是具有相同亚基的三聚体，每个亚基包含两条二硫键连接的多肽HAl和HA2，它们来自前体HAO的蛋白水解切割，HAO的N端有信号肽序列，HAO的C端有膜锚定序列。形成HAl和HA2的切割产生较小多肽HA2的N端，HA2的C端有膜锚定序列。切割对膜融合活性是必需的，但对免疫原性不是必需的。HA2的N端序列被称为“融合肽”，因为类似疏水序列的切割也是其他病毒融合蛋白所需要的，并且该序列20个残基的合成肽类似物在体外与膜融合。—般来说，球形“头部”的表面包含几个柔性环，其具有良好表征并且可变的抗原区域，称为位点A、B、C、D和E(综述见Wiley等，1987.AnnuRevBiochem56:365-394)。已描述了在一些位点(例如B和E)插入或替换短肽序列以进行免疫研究(Garcia-MstW等1995.Biologicals23:171-178)。大小从53至246个氨基酸的表皮生长因子(EGF)、单链抗体(scFV)和IgG的Fc结构域已被插入到H7的N端，并且已成功表达嵌合体(Hatziioannou等，1999.HumanGeneTherapy10:1533-1544)。最近，炭疽芽孢杆菌(Bacillusanthracis)保护性抗原的90和140个氨基酸的结构域已被融合到H3的氨基末端(Li等，2005.J.Virol79:10003-1002)。Copeland(Copeland等，2005.J.Virol79:6459-6471)描述了在H3柄(stalk)上表达gpl20EnvHIV表面糖蛋白，其中gpl20结构域替换了HA的整个球状头部。已开发了几种重组产物作为候选重组流感疫苗。这些方法集中于甲型流感病毒HA和NA蛋白的表达、生产和纯化，包括用杆状病毒感染的昆虫细胞(Crawford等，1999Vaccine17:2265-74Johansson,1999Vaccine17:2073-80)、病毒载体和DNA疫苗构建体(Olsen等，1997Vaccine15:1149-56)表达这些蛋白质。生产用于疫苗目的的非感染性流感病毒株是避免意外感染的一种方法。作为替代，已研究了用作培养病毒之替代物的病毒样颗粒(virus-likeparticle,VLP)0VLP模拟病毒衣壳的结构，但缺少基因组，因此不能复制或提供用于再次感染的工具。目前流感病毒VLP的生产技术依赖于多种病毒蛋白的共表达，这种依赖性是这些技术的缺点，因为在大流行和每年流行的情形中，响应时间对于接种来说是至关重要的。需要更简单的VLP生产系统(例如依赖于仅一种或几种病毒蛋白的表达而不需要表达非结构病毒蛋白)来加快疫苗的开发。包膜病毒可在从被感染细胞“出芽”时获得脂质包膜，并且从质膜或内部细胞器的膜获得膜。例如在哺乳动物细胞或杆状病毒细胞系统中，流感病毒从质膜出芽(Quan等2007J.Virol81:3514-3524)。已知仅有几种包膜病毒感染植物(例如，番茄斑萎病毒(Tospovirus)和弹状病毒(lihabdovirus)的成员)。已知的植物包膜病毒的特征在于从宿主细胞的内膜出芽，而不是从质膜出芽。虽然已在植物宿主中生产了少量重组VLP，但它们均不来源于质膜，这引出了如下问题，即是否可以在植物中生产质膜来源的VLP，包括流感病毒VLP0在任何系统中形成VLP都对蛋白质结构要求很高——改变对应于选定球状结构之表面环的短序列可能对多肽本身的表达没有太大影响，但是缺乏证明这些改变影响VLP形成的结构研究。HA多个区域的协调和结构(例如膜锚定序列，将球状头部与膜分隔开的三聚体柄或茎区域)随病毒而进化，并且可能不能进行类似的改变而不对HA三聚体完整性和VLP的形成造成损失。在WO2009/009876中，本发明人已描述了流感HAVLP的生产。
发明内容本发明涉及病毒样颗粒。更具体而言，本发明涉及包含嵌合流感血凝素的病毒样颗粒和生产嵌合流感血凝素病毒样颗粒的方法。本发明的一个目的是提供改进的嵌合流感病毒样颗粒(VLP)。本发明提供了包含嵌合流感HA的多肽，该嵌合流感HA包含茎结构域簇(stemdomaincluster,SDC)、头部结构域簇(headdomaincluster,HDC)和跨膜结构域簇(transmembranedomaincluster，TDC)，其中SDC包含F，1、F，2和F亚结构域；HDC包含RB、El和E2亚结构域；TDC包含TmD和Ctail亚结构域；并且其中至少一个亚结构域来自第一流感HA，其他亚结构域来自一种或更多种第二流感HA。第一和第二流感HA可独立地选自H1、H3、H5和B。而且，多肽可以包含信号肽。本发明还提供了编码包含嵌合流感HA之多肽的核酸，该嵌合流感HA包含茎结构域簇(SDC)、头部结构域簇(HDC)和跨膜结构域簇(TDC)，其中SDC包含F，1、F，2和F亚结构域；HDC包含RB、E1和E2亚结构域；TDC包含TmD和Ctail亚结构域；并且其中至少一个亚结构域来自第一流感HA，其他亚结构域来自一种或更多种第二流感HA。，核酸还可以编码除所述SDC、HDC和TDC外包含信号肽的多肽。还提供了在植物中生产嵌合流感病毒样颗粒(VLP)的方法，该方法包括a)向植物或其部分引入编码嵌合流感HA的核酸，该嵌合流感HA包含信号肽、茎结构域簇(SDC)、头部结构域簇(HDC)和跨膜结构域簇(TDC)，其中SDC包含F，1、F，2和F亚结构域；HDC包含RB、E1和E2亚结构域；TDC包含TmD和Ctail亚结构域；并且其中至少一个亚结构域来自第一流感HA，其他亚结构域来自一种或更多种第二流感HA，和b)在允许核酸表达的条件下孵育植物或其部分，从而生产VLP。本发明包括上述方法，其中在引入步骤(步骤a)中，核酸以瞬时方式引入植物中。或者，在引入步骤(步骤a)中，核酸被引入植物并且稳定整合。该方法还可包括步骤c)收获宿主并纯化VLP。本发明提供了包含嵌合流感HA或编码嵌合流感HA之核酸序列的植物或其部分，该嵌合流感HA包含茎结构域簇(SDC)、头部结构域簇(HDC)和跨膜结构域簇(TDC)，其中SDC包含F，1、F，2和F亚结构域；HDC包含RB、El和E2亚结构域；TDC包含TmD和Ctail亚结构域；并且其中至少一个亚结构域来自第一流感HA，其他结构域来自一种或更多种第二流感HA。该植物或其部分还可包含核酸，该核酸包含与在植物中有活性之调控区有效连接的编码一种或多于一种伴侣蛋白(chaperoneprotein)的核苷酸序列。所述一种或多于一种伴侣蛋白可选自Hsp40和Hsp70。本发明涉及包含嵌合流感HA的病毒样颗粒(VLP)，该嵌合流感HA包含茎结构域簇(SDC)、头部结构域簇(HDC)和跨膜结构域簇(TDC)，其中SDC包含F，1、F，2和F亚结构域；HDC包含RB、E1和E2亚结构域；TDC包含TmD和Ctail亚结构域；并且其中至少一个亚结构域来自第一流感HA，其他结构域来自一种或更多种第二流感HA。VLP还可包含植物特异性的N-聚糖或修饰的N-聚糖。还提供了包含有效剂量的上述VLP和可药用载体的组合物。在本发明的另一方面，提供了在对象中诱导对流感病毒感染的免疫的方法，包括向对象施用VLP。VLP可以经口、皮内、鼻内、肌内、腹腔内、静脉内或皮下施用给对象。可与编码嵌合HA蛋白之序列有效连接的调控区包括在植物细胞、昆虫细胞或酵母细胞中有效的调控区。这样的调控区可包括质体蓝素调控区、核酮糖1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶(RuBisCO)调控区、叶绿素a/b结合蛋白(CAB)调控区或ST-LSl调控区。其他调控区包括5’UTR、3’UTR或终止子序列。质体蓝素调控区可以是苜蓿质体蓝素调控区；5’UTR、3’UTR或终止子序列也可以是苜蓿序列。本发明提供了嵌合流感HA多肽，由第一流感和第二流感构成，第一流感和第二流感可独立地选自B、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15和H16；前提是第一流感和第二流感不是相同的流感类型、亚型或不具有相同的来源。根据本发明的一些方面，嵌合流感HA多肽包含信号肽序列，所述信号肽序列可选自天然信号肽序列、苜蓿PDI信号肽序列、流感H5信号肽序列和流感Hl信号肽序列。本发明提供了在能够生产VLP的宿主(包括植物、昆虫或酵母)中生产包含嵌合流感血凝素(HA)的VLP的方法，其包括在宿主中引入编码嵌合流感HA的核酸，和在允许核酸表达的条件下孵育宿主，从而生产VLP，该嵌合流感HA包含茎结构域簇(SDC)、头部结构域簇(HDC)和跨膜结构域簇(TDC)，其中SDC包含F，1、F，2和F亚结构域；HDC包含RB、El和E2亚结构域；TDC包含TmD和Ctail亚结构域；并且其中至少一个亚结构域来自第一流感HA，其他结构域来自一种或更多种第二流感HA。与在昆虫细胞培养物中生产VLP相比，在植物中生产这些颗粒具有若干优点。植物脂质可刺激特定免疫细胞并增强所诱导的免疫应答。植物的膜由脂质、磷脂酰胆碱(PC)和磷脂酰乙醇胺(PE)构成，并且还包含植物和一些细菌及原生动物所特有的鞘糖脂。鞘脂类不常见的原因是它们不是甘油酯(例如PC或PE)，而是由与含有多于18个碳的脂肪酸链形成酰胺键的长链氨基醇组成。PC和PE以及鞘糖脂可结合哺乳动物免疫细胞(例如抗原呈递细胞(APC)，如树突状细胞和巨噬细胞)和另一些细胞(包括胸腺和肝脏中的B淋巴细胞和T淋巴细胞)表达的CDl分子。此外，除植物脂质的存在所具有的潜在佐剂作用外，植物N-聚糖促进抗原呈递细胞捕获糖蛋白抗原的能力对在植物中生产嵌合VLP也可以是有利的。不希望受理论限制，预计由植物生产的嵌合VLP比在其他生产体系中制得的嵌合VLP诱导更强的免疫反应，并且与由活或减毒全病毒疫苗诱导的免疫反应相比，由这些植物生产的嵌合VLP诱导的免疫反应更强。与由全病毒制得的疫苗相比嵌合VLP具有优势，这是因为它们无感染性，因此限制性生物防范问题不再像使用感染性全病毒时那么重要，并且不是生产所必需的。由植物生产的嵌合VLP的另一优点是，允许表达系统生长在温室或田间，从而显著地更经济并适于扩大规模。另外，植物不包含参与合成唾液酸残基以及将其添加到蛋白质中的酶。VLP的生产可以不需要神经氨酸酶(NA)，并且不需要共表达NA或者用唾液酸酶(神经氨酸酶)处理生产细胞或提取物以确保VLP在植物中的生产。该发明概述未必描述本发明的所有发明特征。附图简述通过参照附图的以下描述，本发明的这些和其他特征会更加明显，在附图中图1显示HA亚结构域的示意图。SP:信号肽，F，1、F，2和F:融合亚结构域；RB受体结合亚结构域，El和E2酯酶亚结构域，TMD/CT跨膜和胞质尾区亚结构域。图IB显示基于质体蓝素的表达盒(构建体号774、M0、660、690、691、696)的示意图，该表达盒表达天然和嵌合形式的血凝素HlA/布里斯班/59/2007(Hl/Bri)、血凝素HlA/新喀里多尼亚/20/99(Hl/NC)和血凝素H5A/印度尼西亚/5/05(H5/Indo)。Plastopro苜蓿质体蓝素启动子，Plastoter苜蓿质体蓝素终止子，SP信号肽，RB受体结合亚结构域，E1-RB-E2酯酶和受体结合亚结构域，TMD/CT跨膜和胞质尾亚结构域，PDI苜蓿蛋白二硫键异构酶。图IC显示几种流感HA的氨基酸序列比对，附加了结构比对(B/佛罗里达/4/2006(B佛罗里达)，SEQIDNO:94(GenBank登录号ACA33493.1;B/马来西亚/2506/2004(B-马来西亚)，SEQIDNO:95(GenBank登录号ABU99194.1)；Hl/Bri(A-布里斯班)，SEQIDNO96(GenBank登录号ADE^750.1；HlA/所罗门群岛/3/2006(A-Sol.Isl)，SEQIDNO97(GenBank登录号ABU99109.1)；Hl/NC(A-NewCal)，SEQIDNO:98(GenBank登录号AAP;34324.1；H2A/新加坡/1/1957(Α-新加坡)，SEQIDNO99(GenBank登录号AAA64366.1)；H3A/布里斯班/10/2007(A-布里斯班)，SEQIDNO100(GenBank登录号ACU6318.1)；H3A/威斯康星/67/2005(A-WCN)，SEQIDNO101(GenBank登录号AB037599.1)；H5A/安徽/1/2005(A-安徽)，SEQIDNO:102(GenBank登录号AB拟8180.1)；H5A/越南/1194/2004(A-越南)，SEQIDNO103(GenBank登录号ACR48874.1)；H5-Indo,SEQIDNO:104(GenBank登录号ABW06108.1。标示了F，1、酯酶1、受体结合、酯酶2、F'2、肽融合、TMD/CT亚结构域之间的界限以及二硫桥。图2显示用构建体690、734(SEQIDNO:11)、696(SEQIDNO:112)(上图)和691(SEQIDN0:113)(下图)表达的嵌合HA所示亚结构域的氨基酸序列。SEQIDNO:111的1-92位氨基酸是H5/lndo的F，1+E1结构域；93-263位氨基酸是Hl/布里斯班的RB头部结构域，264-552位氨基酸是H5/Indo的E2+F，2结构域。SEQIDNO:112的1_92位氨基酸是H5/NC的F，1+E1结构域；93-301位氨基酸是H5/lndo的RB头部结构域，302-586位氨基酸是H1/NC的E2+F，2结构域。SEQIDNO:113的1-42位氨基酸是H5/lndo的F，1结构域；43-273位氨基酸是Hl/布里斯班的E1-RB-E2头部结构域，274-552位氨基酸是H5/Indo的F，2结构域。图3显示构建体690和734(SEQIDNO80)编码区的氨基酸序列，其包含Hl/Bri的RB亚结构域、H5/Indo信号肽和包含H5/IndoF，1、El、E2和F亚结构域的茎结构域复合体(stemdomaincomplex,SDC)。图4显示构建体691(SEQIDNO:81)编码区的氨基酸序列，其包含Hl/Bri头部结构域复合体(HDC)(包含El、RB、E2)、H5/Indo信号肽和包含H5/IndoF，1、F，2和F亚结构域的茎结构域复合体(SDC)。图5显示构建体696(SEQIDNO82)编码区的氨基酸序列，其包含H5/lndo的RB亚结构域、PDI信号肽和包含F，1、E1、E2和F，2的H1/NC茎结构域复合体。图6显示在植物中天然形式、构建体774(包含Hl/Bri)、构建体692(包含Hl/Bri的头部结构域复合体(HDC))和构建体690(包含与H5/Indo茎结构域复合体(SDC)融合的Hl/Bri的RB亚结构域)的Hl/Bri表达的免疫印迹分析。对于每个构建体，分析来自3个独立植物的总蛋白提取物。对于所分析的每个植物，上样的蛋白质为20微克。用抗HA单克隆抗体(抗Hl-布里斯班；FII10-150)显示Wfestern印迹。构建体774表达具有Hl/Bri天然信号肽的Hl/Bri；构建体690、691表达具有H5/lndo天然信号肽的HA。图7显示天然形式、构建体660(包含H5/Indo)或构建体696(包含与Hl/NCSDC、El和E2亚结构域融合的HlAndoRB亚结构域)的H5/Indo表达的免疫印迹分析。对于每个构建体，分析来自3个独立植物的总蛋白提取物。对于所分析的每个植物，上样的蛋白质为20微克。用抗H5印度尼西亚多克隆抗体(ITCIT-003-005V)显示^festern印迹。构建体660表达具有其天然信号肽的H5/lndo；构建体696表达具有PDI信号肽的嵌合WL图8显示基于35SCPMV/HT的表达盒的示意图，该表达盒表达天然(构建体732)和嵌合(构建体733和734)形式的Hl/Bri。构建体733包含PDI信号肽和Hl/Bri的HDC、SDC和跨膜结构域复合体(transmembranedomaincomplex，TDC)，构建体734包含H5/lndo信号Jft、F，1、El、E2、F，2、F和来自Hl/Bri的RB。！35SDro=CaMV35S启动子，NOSter胭脂氨酸合酶终止子，SP信号肽，RB受体结合亚结构域，E1-RB-E2酯酶和受体结合亚结构域，TMD/CT跨膜和胞质尾亚结构域，PDI苜蓿蛋白二硫键异构酶；CPMV-HT可过量翻译(hypertranslatable)的豇豆花叶病毒表达系统的5，和3，元件。图9显示天然形式、构建体732(包含在基于35SCPMV/HT的表达盒控制下的Hl/Bri)、构建体733(包含与Hl/Bri融合的PDI信号肽；在基于35SCPMV/HT的表达盒的控制下)或构建体734(包含与H5/IndoSDC,El和E2亚结构域融合的Hl/BriRB亚结构域；在基于35SCPMV/HT的表达盒的控制下)的Hl/Bri表达的免疫印迹分析。对于每个构建体，分析来自3个独立植物的总蛋白提取物。对于所分析的每个植物，上样蛋白为5微克。用抗HA单克隆抗体检测(FII10-150)显示^festern印迹。图10显示基于35SCPMV/HT的表达盒的示意图，该表达盒表达H3A/布里斯班/10/2007(H3/Bri)和B/佛罗里达/4/2006HA(B/Flo)血凝素。构建体736包含与PDI信号肽融合的H3/Bri。构建体737包含与PDI信号肽融合的H3/Bri和H5/IndoTMD/CT。构建体739包含与PDI信号肽融合的B/Flo。构建体745包含与PDI信号肽融合的B/Flo和H5/IndoTMD/CT。35SproCaMV35S启动子，NOSter胭脂氨酸合酶终止子，SP信号肽，RB受体结合亚结构域，E1-RB-E2酯酶和受体结合亚结构域，TMD/CT跨膜和胞质尾亚结构域，PDI苜蓿蛋白二硫键异构酶；CPMV-HT可过量翻译的豇豆花叶病毒表达系统的5’和3’元件。图11显示构建体745和737中的融合边界。HA序列的起始用锥形头箭头标示。跨膜结构域的氨基酸为QILSIYSTVA，，其前面是部分胞外结构域的氨基酸。图12显示嵌合H5/H3血凝素(SEQIDNO:83，构建体737)的氨基酸序列，其包含PDI信号肽、H3A/布里斯班/10/2007的胞外结构域和H5A/印度尼西亚/5/2005的TMD/CT。图13显示嵌合H5/B血凝素(SEQIDNO84)的氨基酸序列，其包含构建体号745的开放阅读框所编码的B/佛罗里达/4/2006的胞外结构域和H5A/印度尼西亚/5/2005的TMD/CT。图14显示天然形式、构建体739(包含PDI-B/Flo)或构建体745(包含与H5/IndoTDC融合的B/FloHDC和SDC)的B/Flo表达的免疫印迹分析。对于每个构建体，分析来自3个独立植物的总蛋白提取物。对于所分析的每个植物，上样的蛋白为20微克。用抗HAB/佛罗里达多克隆抗体(NIBSC07/356)显示^festern印迹。图15显示天然形式、构建体736(包含PDIsp_H3/Bri)或构建体737(与H5/IndoTDC融合的H3/BriHDC和SDC)的H3/Bri表达的免疫印迹分析。对于每个构建体，分析来自3个独立植物的总蛋白提取物。对于所分析的每个植物，上样的蛋白为20微克。用抗H3布里斯班多克隆抗体(NIBSC08/124)显示^festern印迹。图16显示用构建体号745侵染之植物的叶蛋白质提取物的体积排阻色谱。对于每种级分，显示洗脱级分的相对蛋白含量。在级分7至15中使用抗HAB/佛罗里达多克隆抗体(NIBSC07/356)对血凝素进行的免疫检测(Western印迹)在图下显示。箭头标示蓝葡聚糖2000的洗脱峰(级分8)。图17显示合成片段的核酸序列(SEQIDNO52)，其包含完整H5(A/印度尼西亚/5/05(H5N1))编码区(包含信号肽和终止密码子)，在5，侧翼有HindIII位点，在3，侧翼有SacI位点。图18显示构建体660的核酸序列(SEQIDNO53)，构建体660是HA表达盒，其包含苜蓿质体蓝素启动子和5，UTR、H5型A/印度尼西亚/5/05(H5W)血凝素的编码序列、苜蓿质体蓝素3’UTR和终止子序列。图19显示无TmD和Ctail的野生型Hl(A/新喀里多尼亚/20/99(HlNl))(GenBank登录号AY289929)编码序列的核酸序列(SEQIDNO:54)。图20显示合成片段的核酸序列(SEQIDNO:55)，该合成片段包含缺少TmD和Ctail的Hl(A/新喀里多尼亚/20/99(HlNl))编码序列。在5，区，最后几个核苷酸来自PDISP并且包含BglII限制性位点，在3’SacI/StuI双位点位于紧邻终止密码子的下游。图21显示包含C-terHl(A/新喀里多尼亚/20/99(HlNl))编码序列(包含TmD和Ctail)的合成片段的核酸序列(SEQIDNO:56)，其从KpnI位点至终止密码子(3’侧翼是SacIAtUI双位点)。图22显示来自紫苜蓿(Medicagosativa)蛋白二硫键异构酶mRNA的核苷酸序列。GenBank登录号Zl1499(SEQIDNO:57)。核苷酸32-103编码PDI信号肽。图23显示PromPlasto-PDISP-Plasto3，UTR质粒的核苷酸序列。图23A显示PromPlasto-PDISP(SEQIDNO:58)的核苷酸序列。图2!3B显示Plasto3，UTR(SEQIDNO85)的核苷酸序列。蛋白二硫键异构酶(PDI)信号肽序列用下划线表示。用于克隆的BglII(AGATCT)和&icI(GAGCTC)限制性位点以黑体显示。图M显示HA表达盒的核酸序列(SEQIDNO59；构建体M0)，该表达盒包含苜蓿质体蓝素启动子和5’UTR、PDI信号肽和Hl型A/新喀里多尼亚/20/99(HlNl)的编码序列、苜蓿质体蓝素3’UTR和终止子序列。来自A/新喀里多尼亚/20/1999的Hl编码序列用下划线表示。图25显示合成片段的核酸序列(SEQIDNO:60)，其包含完整Hl(A/布里斯班/59/07(HlNl))编码区(包含信号肽和终止密码子)，在5’侧翼有以DraIII位点起始的苜蓿质体蓝素基因序列(对应于起始ATG上游前84个核苷酸)，3’侧翼有McI位点。图沈显示HA表达盒的核酸序列(SEQIDNO:61，构建体774)，该HA表达盒包含苜蓿质体蓝素启动子和5’UTR、Hl型A/布里斯班/59/07(HlNl)的血凝素编码序列、苜蓿质体蓝素3’UTR和终止子序列。图27显示表达盒号828(SEQIDNO62)的核酸序列，从I^acI(启动子上游)至AscI(紧邻NOS终止子的下游)。CPMVHT3，UTR序列用下划线表示，其中突变的ATG用黑体表示。Apal限制性位点用下划线和斜体表示。图28显示嵌合H5/H1表达盒的核酸序列(SEQIDNO:63，构建体690)，该表达盒包含苜蓿质体蓝素启动子和5’UTR、嵌合血凝素编码序列、苜蓿质体蓝素3’UTR和终止子序列。嵌合HA编码序列用下划线表示。图四显示嵌合H5/H1表达盒的核酸序列(SEQIDNO:64，构建体691)，该表达盒包含苜蓿质体蓝素启动子和5’UTR、嵌合血凝素编码序列、苜蓿质体蓝素3’UTR和终止子序列。嵌合HA编码序列用下划线表示。图30显示嵌合H1/H5表达盒的核酸序列(SEQIDNO:65，构建体696)，该表达盒包含苜蓿质体蓝素启动子和5’UTR、嵌合血凝素编码序列、苜蓿质体蓝素3’UTR和终止子序列。嵌合HA编码序列用下划线表示。图31显示HA表达盒的核酸序列(SEQIDNO:66，构建体732)，该HA表达盒包含CaMV35S启动子、CPMV-HT5’UTR、Hl型A/布里斯班/59/07(HlNl)血凝素编码序列、CPMV-HT3，UTR和NOS终止子序列。Hl/Bri的编码序列用下划线标示。图32显示中间构建体787从ATG到终止的编码序列的核酸序列(SEQIDNO67)。图33显示SpPDIHl/Bri表达盒的核酸序列(SEQIDNO:68，构建体号733)，该表达盒包含CaMV35S启动子、CPMV-HT5’UTR、PDI信号肽编码序列、Hl型A/布里斯班/59/07(HlNl)血凝素编码序列、CPMV-HT3’UTR和NOS终止子序列。SpPDIHl/Bri编码序列用下划线表示。图34显示嵌合H5/H1表达盒的核酸序列(SEQIDNO:69，构建体734)，该表达盒包含CaMV35S启动子、CPMV-HT5’UTR、嵌合血凝素编码序列、CPMV-HT3’UTR和NOS终止9子序列。嵌合HA的编码序列用下划线表示。图35显示合成片段的核酸序列(SEQIDNO:70)，该合成片段包含完整H3(A/布里斯班/10/07编码区(包含信号肽和终止密码子)，5’侧翼有以DraIII位点起始的苜蓿质体蓝素基因序列(对应于起始ATG上游前84个核苷酸)，3’侧翼有McI位点。图36显示HA表达盒的核酸序列(SEQIDNO:71，构建体736)，该HA表达盒包含CaMV35S启动子、CPMV-HT5，UTR、PDI信号肽编码序列、H3型A/布里斯班/10/07(H2N3)血凝素编码序列、CPMV-HT3，UTR和NOS终止子序列。SpPDIH3/Bris编码序列用下划线表不。图37显示嵌合H5/H3表达盒的核酸序列(SEQIDNO:72，构建体号737)，该表达盒包含CaMV35S启动子、CPMV-HT5’UTR、嵌合血凝素编码序列、CPMV-HT3，UTR和NOS终止子序列。嵌合HA的编码序列用下划线表示。图38显示合成片段的核酸序列(SEQIDNO:73)，该合成片段包含完整HA(B/佛罗里达/4/06)编码区(包含信号肽和终止密码子)，5’侧翼有以DraIII位点起始的苜蓿质体蓝素基因序列(对应于起始ATG上游前84个核苷酸)，3’侧翼有McI位点。图39显示HA表达盒的核酸序列(SEQIDNO:74，构建体739)，该HA表达盒包含CaMV35S启动子、CPMV-HT5，UTR、PDI信号肽编码序列、HA型B/佛罗里达/4/06血凝素编码序列、CPMV-HT3，UTR和NOS终止子序列。SpPDIB/Flo编码序列用下划线表示。图40显示嵌合H5/B表达盒的核酸序列(SEQIDNO:75，构建体745)，该表达盒包含CaMV35S启动子、CPMV-HT5’UTR、嵌合血凝素编码序列、CPMV-HT3，UTR和NOS终止子序列。嵌合HA的编码序列用下划线表示。图41显示编码Msjl的核酸序歹Ij(SEQIDNO76)。图42显示部分构建体号R850的核酸序列(SEQIDNO77)，从HindIII(在多克隆位点中，启动子上游)至EcoRI(紧邻NOS终止子的下游)。HSP40编码序列用下划线表不。图43显示部分构建体号R860的核酸序列(SEQIDNO78)，从HindIII(在多克隆位点中，启动子上游)至EcoRI(紧邻NOS终止子的下游)。HSP70编码序列用下划线表7J\ο图44显示部分构建体号R870的核酸序列(SEQIDNO79)，从HindIII(在多克隆位点中，启动子5，上游)至EcoRI(紧邻NOS终止子的下游)。HSP40编码序列用下划线和斜体表示，HSP70编码序列用下划线表示。A)核苷酸1-4946;B)核苷酸4947-9493。图45显示构建体R472的示意图。图46显示甲型流感的二硫桥模式。桥编号l)Cys4HAl-Cysl37HA2、2)Cys60HAl-Cys72HAK3)Cys94HAl-Cys143HAU4)Cys292HAl-Cys318HA1,5)Cysl44HA2-Cysl48HA2和6)Cys52HAl-Cys277HAl。甲和乙亚型之间二硫桥的差异(图47)用箭头标示。使用成熟H3蛋白的编号。图47显示乙型流感HA的二硫桥模式。桥编号1)Cys4HAl-Cysl37HA2、2)Cys60HAl-Cys72HAK3)Cys94HA1-Cys143HA1,4)Cys292HA1-Cys318HAU5)Cysl44HA2-Cysl48HA2、6)Cys52HAl-Cys277HAK7)Cys54HAl-Cys57HAl禾口8)Cysl78HAl-Cys272HAl0甲和乙亚型之间二硫桥的差异(图46)用箭头标示。使用成熟H3蛋白的编号。图48显示结构域替换(swap)融合连接的示意图。图48A显示来自Hl/Bri、H3/Bri和B/Flo的RB亚结构域与H5/lndoSDC的融合，和H5/lndo的RB亚结构域与H1/NC莲结构域的融合。图48B显示来自Hl/Bri、H3/Bri或B/Flo的E1-RB-E2亚结构域(HDC)与H5/IndoSDC的融合，和H5/IndoHDC与Hl/NCSDC的融合。图49A显示HlA/加利福尼亚/04/09的核苷酸序列(SEQIDNO:86)。苜蓿蛋白二硫键异构酶信号肽编码序列用下划线表示，成熟Hl编码序列用黑体突出显示。图49B显示HlA/加利福尼亚/04/09的氨基酸序列(SEQIDNO:87)。苜蓿蛋白二硫键异构酶信号肽序列用下划线表示。图50显示用未稀释的AGL1/747侵染、与AGL1/443(空载体)共侵染和与AGLl/R870(HSP40/HSP70)共侵染后，H5/B嵌合血凝素(构建体747，包含与H5/IndoTDC融合的B/FloHDC和SDC)表达的免疫印迹分析。对于每个构建体，分析来自3个独立植物的总蛋白提取物。对于所分析的每个植物，上样的蛋白为20微克。用抗B/佛罗里达多克隆抗体(NIBSC)显示Western印迹。图51A显示2X35S启动子序列(SEQIDNO88)的核苷酸序列。图51B显示构建体747(SEQIDNO93)从I^cI(35S启动子上游)至AscI(紧邻NOS终止子下游)的核苷酸序列。嵌合HA的编码序列用下划线表示。2X35S启动子序列用斜体表示。详细描述本发明涉及病毒样颗粒。更具体而言，本发明涉及包含嵌合流感血凝素的病毒样颗粒和生产嵌合流感病毒样颗粒的方法。下面描述的是一个优选的实施方案。本发明提供了包含编码嵌合流感血凝素(HA)之核苷酸序列的核酸，其与在植物中有活性的调控区有效连接。此外，本发明提供了在植物中生产病毒样颗粒(VLP)的方法。所述方法包括向植物或植物部分中引入编码嵌合流感HA的核酸序列(与在植物中有活性的调控区有效连接)，并且在允许该核酸表达的条件下孵育植物或植物部分，从而产生VLP。本发明还提供了包含嵌合流感HA的VLP。可以通过本发明提供的方法生产VLP。“嵌合蛋白”或“嵌合多肽”是指包含来自于两种或多于两种来源的氨基酸序列的蛋白质或多肽，例如但不限于，作为单个多肽融合的两种或更多种流感类型或亚型或者不同来源的流感。嵌合蛋白或多肽可以包含与剩余多肽或蛋白质相同或异源的信号肽。嵌合蛋白或嵌合多肽可以作为转录本从嵌合核苷酸序列中转录，嵌合蛋白或嵌合多肽在合成后被切割，并且根据需要结合形成多聚体蛋白。因此，嵌合蛋白或嵌合多肽还包括这样的蛋白质或多肽，其包含通过二硫桥连接的亚基(即多聚体蛋白)。例如，包含来自两种或更多种来源的氨基酸序列的嵌合多肽可被加工成亚基，该亚基通过二硫桥连接，产生嵌合蛋白或嵌合多肽(见图46和47)。多肽可以是血凝素(HA)，每个形成多肽的两条或更多条氨基酸序列可以从不同的HA获得，以生产嵌合HA或嵌合流感HA。嵌合HA还可以包括这样的氨基酸序列，其包含在蛋白合成后或过程中被切割的异源信号肽(嵌合HA前体蛋白)。优选地，嵌合多肽或嵌合流感HA不是天然的。编码嵌合多肽的核酸可以被描述成“嵌合核酸”或“嵌合核苷酸序列”。包含嵌合HA的病毒样颗粒可以被描述成“嵌合VLP”。本发明多个实施方案的嵌合流感HA可包含茎结构域复合体(SDC)、头部结构域复合体(HDC)和跨膜结构域复合体(TDC)，其中SDC、HDC或TDC中的一个或多于一个亚结构域来自第一流感HA类型、亚型或者来自一个来源，并且SDC、HDC或TDC中的一个或多于一个亚结构域来自第二流感HA类型、亚型或者来自第二或不同来源。如本文所述，“SDC”包含F，1、F，2和F亚结构域，“HDC”包含RB,El和E2亚结构域，“TDC”包含TmD和Ctail亚结构域(TMD/CT；参见图1A、46和47)。术语“病毒样颗粒”(VLP)或“VLP”是指自组装并包含结构蛋白(如流感HA蛋白或嵌合流感HA蛋白)的结构。一般来说VLP和嵌合VLP的形态和抗原性类似于感染中产生的病毒粒，但是缺乏足以复制的遗传信息，因此不具有感染性。VLP和嵌合VLP可以在适当的宿主细胞(包括植物宿主细胞)中生产。从宿主细胞中提取后，在适当条件下分离并进一步纯化后，VLP和嵌合VLP可以作为完整结构被纯化。本发明的产生于流感来源蛋白的嵌合VLP或VLP不包含Ml蛋白。已知Ml蛋白结合RNA(WakefieldandBrownlee,1989)，而RNA是VLP制备时的污染物。在嵌合VLP产品获得监管批准时，不希望存在RNA，因此缺失RNA的嵌合VLP制剂是有利的。本发明的嵌合VLP可以在特征为缺少使蛋白质唾液酸化之能力的宿主细胞中产生，所述宿主细胞如植物细胞、昆虫细胞、真菌和其他生物(包括海绵动物、腔肠动物、环节动物、节肢动物、软体动物、线形动物(nemathelminthea)、trochelmintes、扁形动物、毛颚动物、触手动物、衣原体、螺旋体、革兰氏阳性细菌、蓝细菌、古细菌等。参见例如Gupta等，1999.NucleicAcidsResearch27:370-372;Toukach等，2007.NucleicAcidsResearch35:D280-D286;Nakahara等，2008.NucleicAcidsResearch36:D368_D371。如本文所述生产的VLP通常不含有神经氨酸酶(NA)。然而，如果期望获得包含HA和NA的VLP，可以将NA与HA共表达。本发明还提供包含从表达嵌合HA的细胞的质膜获得脂质包膜的嵌合HA的VLP。例如，如果嵌合HA在基于植物的系统中表达，那么得到的VLP可从该植物细胞的质膜获得脂质包膜。一般而言，术语“脂质”是指脂溶性的(亲脂性)天然分子。根据本发明的一些方面在植物中生产的嵌合VLP可以与植物来源的脂质形成复合物。植物来源的脂质可以是脂双层的形式，并且还可以包含包裹VLP的包膜。植物来源的脂质可以包含生产VLP之植物的质膜脂质组分，包括磷脂，三、二和单甘油酯，以及脂溶性固醇或包含固醇的代谢物。实例包括磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、鞘糖脂、植物固醇或其组合。植物来源的脂质还可称为“植物脂质”。植物固醇的例子包括菜油留醇、豆留醇、麦角甾醇、菜籽甾醇、Δ-7-豆甾醇、八-7-燕麦甾醇、叔皿0计吐01、谷甾醇，24-甲基胆固醇、胆固醇或β-谷留醇——参见例如，Mongrand等，2004。本领域技术人员应理解细胞质膜的脂质成分可随获得细胞的细胞或生物或物种的培养或生长条件而异。一般而言，谷甾醇是最丰富的植物甾醇。细胞膜通常包含脂双层以及多种功能的蛋白质。在脂双层中可发现局部集中的特定脂质，称为“脂筏(lipidraft)”。鞘酯和固醇中富含这些脂筏微结构域。不希望受理论限制，脂筏可在胞吞和胞吐作用、病毒或其他感染原的进入或逸出、细胞间信号转导、与细胞或生物的其他结构组分(例如细胞内和细胞外基质)的相互作用中起重要作用。本发明包括包含嵌合HA的VLP，其中HA的亚结构域可以从可感染人的任何类型、亚型的流感病毒中获得，包括例如B、HI、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15和H16类型或亚型。在一些实施方案中，流感病毒可以是H1、H3、H5或B类型或亚型。HI、H3、H5或B类型或亚型的非限制性例子包括A/新喀里多尼亚/20/99亚型(HlNl)("H1/NC，，;SEQIDNO:56)、H1A/加利福尼亚/04/09亚型(HlNl)(“Hl/Cal"；SEQIDNO:86)、A/印度尼西亚/5/05亚型(H5N1)("H5/Indo，，)、A/布里斯班/59/2007(“Hl/Bri，，)和B/佛罗里达/4/2006(“B/Flo，，)和H3A/布里斯班/10/2007(“H3/Bri，，)。并且，嵌合HA可以包含分离自一种或更多种现有或新鉴定流感病毒的一种或更多种血凝素亚结构域，。本发明还涉及感染其他哺乳动物或宿主动物的流感病毒，所述动物如人、灵长类、马、猪、鸟类、水禽、候鸟、鹌鹑、鸭、鹅、家禽、鸡、骆驼、犬科动物、狗、猫科动物、猫、虎、豹、麝猫、水貂、石貂、雪貂、宠物、家畜、小鼠、大鼠、海豹、鲸等。一些流感病毒可以感染超过一种宿主动物。对于流感病毒，本文所用术语“血凝素”或“HA”是指流感病毒颗粒的结构糖蛋白。流感血凝素的结构已有深入的研究，并且显示高度保守的二级、三级和四级结构。即使氨基酸序列变化仍观察到此结构保守性(参见例如Skehel和Wiley，2000AnnRevBiochem69:531-69；Vaccaro等2005，通过引用并入本文)。编码HA的核苷酸序列是公知的并且可获得，参见例如BioDefenseandPublicHealthbase(例如URL:biohealthbase.org/GSearch/home.do？decorator=Influenza)或美国国立生物技术信息中心(NCBI；参见URL:ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez？db=nuccore&cmd=search&term=influenza)，两者均通过引用并入本文。HA单体可进一步分为3个功能性结构域——茎结构域或茎结构域簇(SDC)、球状头部结构域或头部结构域簇(HDC)和跨膜结构域簇(TDC)。SDC包含4个亚结构域，融合肽F、F’1和F’2(该亚结构域一般可以称为“骨架”)。TDC包含两个亚结构域，跨膜(TmD)和C端尾部(CT)。HDC包含三个亚结构域，残留酯酶结构域ΕΓ和E2以及受体结合结构域RB0SDC和HDC可以统称为“胞外结构域”。Ha等2002(EMB0J.21:865-875；通过引用并入本文)发表的文献根据X射线结晶结构，阐明了几个流感亚型中SDC和HDC多种亚结构域的相对定位。图IA显示与HAl和HA2多肽N端和C端相关的亚结构域示意图。图IC提供多种流感亚型的标示的结构比对。流感病毒血凝素中允许氨基酸变化。该变化提供不断被鉴定的新毒株。新毒株之间感染性可以有差异。但是，保持了血凝素三聚体的形成，其随后形成VLP。因此本发明提供了包含嵌合HA的血凝素氨基酸序列或编码在植物中形成VLP的嵌合血凝素氨基酸序列的核酸，并且包括已知序列和可产生的变体HA序列。本发明还涉及包含TDC、SDC和HDC的嵌合HA多肽的用途。例如嵌合HA蛋白可以是ΗΑ0，或包含来自两种或更多种流感类型之HAl和HA2亚结构域的经切割嵌合HA。嵌合HA蛋白可以用于使用植物或植物细胞表达系统生产或形成VLP。HAO可以表达并折叠形成三聚体，然后可组装成VLP。HAO的切割产生HAl和HA2多肽，它们通过二硫桥连接(参见图1C、46和47对二硫桥模式的图解)。对于感染性病毒颗粒，需要前体HAO的切割来引发HA2的构象变化，该变化释放融合肽(在HA2多肽的N端)并使其可用于融合细胞和病毒膜。但是，VLP没有感染性，不需要切割HA形成HAl和HA2(例如在疫苗生产中)。未切割的HAO前体也组装成三聚体并从质膜出芽形成VLP纳米颗粒。HAO多肽包含几个结构域。HDC的RB亚结构域在抗原区包含几个环，称为位点A-E。可以中和感染性流感病毒的抗体经常靶向一个或更多个这些位点。残留酯酶亚结构域(El和E2)可在融合中发挥作用，并且可结合Ca++。F、F’1和F’2结构域相互作用并协同形成茎，使得HA三聚体的头部位于膜之上。TmD和CT可参与折叠HA在膜上的锚定。TmD可在HA对脂筏的亲和中发挥作用，而CT可在HA的分泌中发挥作用，并且CT亚结构域中存在的一些半胱氨酸残基可是棕榈酰化的。信号肽(SP)还可存在于HAO多肽的N端。图2以及表4和5提供了一些流感病毒亚型的SP、F，1、F，2、E1、RB、E2和F结构域的氨基酸序列的实例。在流感血凝素的表达和/或分泌过程中对N端信号肽(SP)序列进行加工可在HA折叠中发挥作用。术语“信号肽”一般是指通常见于血凝素多肽N端的短(约5-30个氨基酸)氨基酸序列，其可指导新翻译的多肽转位至特定细胞器，或者辅助多肽链的特定结构域相对于其他结构域的定位。血凝素的信号肽将蛋白质的转位靶向至内质网，已提出该信号肽辅助近N端结构域相对于新生血凝素多肽之膜锚定结构域的定位，以辅助成熟血凝素的切割和折叠。HA在宿主细胞内质网(ER)膜内的插入、信号肽切割和蛋白质糖基化是共翻译事件。HA的正确折叠需要蛋白质糖基化和至少6个链内二硫键的形成(参见图46和47)。在图46中，显示甲亚型HA的每个单体具有6个保守二硫桥。通过比较，BHA的单体(图47)具有7个二硫桥，其中5个在甲型中有对应结构(综述见Skehel和Wiley，2000.AnnRevBiochem69:531-569；在如Gamblin等2004，Science303:1838-1842中描述了阐释分子内和分子间二硫桥和其他保守氨基酸及其相对位置的结构实例；两者均通过引用并入本文)。本领域技术人员应理解，重要的是制备嵌合HA时保证获得类似排列的二硫桥。信号肽可以是血凝素中天然存在的，或者信号肽可与被表达血凝素的初级序列异源。嵌合HA可以包含来自第一流感类型、亚型或毒株的信号肽，而其余的HA来自一种或多于一种的不同流感类型、亚型或毒株。例如HA亚型BHI、H2、H3、H5、H6、H7、H9或乙型流感的天然SP可用于在植物系统中表达HA。在本发明的一些实施方案中，SP可以来自乙型、Hl、H3或H5流感；或来自亚型Hl/Bri、Hl/NC、H5/Indo、H3/Bri或B/Flo。SP还可以是非天然的，例如来自非流感病毒之病毒的结构蛋白或血凝素，或者来自植物、动物或细菌多肽。可以使用的信号肽的非限制性实例是苜蓿蛋白二硫键异构酶(PDISP；登记号Zl1499的32-103位核苷酸；SEQIDNO34；图17)，其具有氨基酸序列MAKNVAIFGLLFSLLLLVPSQIFAEE(32-103位核苷酸；SEQIDNO:34)。因此本发明提供了包含天然或非天然信号肽的嵌合流感血凝素和编码该嵌合血凝素的核酸。血凝素的正确折叠对蛋白质稳定性、多聚体形成、VLP形成和HA的功能(血细胞凝集能力)等流感血凝素特性可以是重要的。蛋白质折叠可受一个或更多个因素影响，包括但不限于蛋白质序列、蛋白质相对丰度、细胞内拥挤程度、可与折叠的、部分折叠的或未折叠的蛋白质结合或瞬时联合的辅因子的可获得性、一种或更多种伴侣蛋白的存在等。热休克蛋白(Hsp)或应激蛋白是伴侣蛋白的实例，其可参与多种细胞过程，包括蛋白质合成、细胞内运输、错误折叠的防止、蛋白质凝集的防止、蛋白质复合物的组装和去组装、蛋白质折叠和蛋白质解聚。这样的伴侣蛋白的实例包括但不限于Hsp60、Hsp65、Hsp70、Hsp90、HsplOO、Hsp20_30、HsplO、Hspl00-200、HsplOO、Hsp90、Lon,TF55、FKBP、亲环蛋白(cyclophilin)、ClpP、GrpE、泛素、钙联蛋白(calnexin)和蛋白质二硫键异构酶(参见例如Macario,A.J.L.,ColdSpringHarborLaboratoryRes.25:59-70.1995；Parsell,D.A.&Lindquist,S.Ann.Rev.Genet.27:437-496(1993)；美国专利No.5，232，833)。如本文所述，伴侣蛋白(例如但不限于Hsp40和Hsp70)可以用于保证嵌合HA的折叠。Hsp70的实例包括来自哺乳动物细胞的Hsp72和Hsc73、来自细菌特别是分枝杆菌(如麻风分枝杆菌(Mycobacteriumleprae)、结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)禾口牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)(例如卡介苗(Bacille-CalmetteGuerin)本文中称为Hsp71))的DnaK。来自大肠杆菌、酵母和其他原核生物的DnaK以及来自真核生物(例如拟南芥(A.thaliana))的BiP和Grp78(Lin等，2001(CellStressandChaperones6:201-208))。Hsp70的具体实例是拟南芥Hsp70(由Genbankref:AY120747.1编码)。Hsp70能够特异性地结合ATP以及未折叠的多肽和肽，从而参与蛋白质折叠和去折叠和蛋白质复合物的组装和去组装。Hsp40的实例包括来自原核生物(例如大肠杆菌和分枝杆菌)的DnaJ和来自真核生物(例如苜蓿)的HSJl、HDJ1和Hsp40(Frugis等，1999.PlantMolecularBiology40:397-408)。Hsp40的具体实例是紫花苜蓿(M.sativa)MsJl(AJ000995.1或SEQIDNO76)。Hsp40在蛋白质折叠、耐热和DNA复制等细胞活动中作为分子伴侣起作用。图41显示编码Msjl的核酸序列(SEQIDNO76)。在Hsp中，Hsp70及其辅伴侣蛋白(co-chaperone)Hsp40参与合成完成前正在翻译的和新合成的多肽的稳定。不希望受理论的限制，Hsp40与未折叠(新生或新转移的)多肽的疏水片区(patch)结合，从而有利于Hsp70-ATP复合物与多肽的相互作用。ATP水解导致多肽、Hsp70和ADP之间形成稳定的复合物并释放Hsp40。Hsp70_ADP复合物与多肽之疏水片区的联合阻止其与其他疏水片区的相互作用，防止不正确折叠和与其他蛋白质的凝集(综述见Hartl，FU.1996.Nature381:571-579)。天然伴侣蛋白可能能够利于低水平的重组蛋白质的正确折叠，然而随着表达水平的增加，天然伴侣蛋白的丰富可成为限制因素。农杆菌浸染叶中血凝素的高水平表达可导致血凝素多肽在胞质溶胶中累积，而共表达一种或更多种伴侣蛋白(例如Hsp70、HSp40或者Hsp70和Hsp40两者)可降低错误折叠或凝集的血凝素多肽的水平，并且增加显示出允许血细胞凝集和/或病毒样颗粒形成之三级和四级结构特性的多肽数。SEQIDN0:77是构建体号R850从HindiII(在多克隆位点中，启动子上游)至EcoRI(紧邻NOS终止子的下游)的部分核酸序列，其编码HSP40(下划线)。SEQIDNO78是构建体号R860从HindIII(在多克隆位点中，启动子上游)至EcoRI(紧邻NOS终止子的下游)的部分核酸序列，其编码HSP70(下划线)。SEQIDNO:79是构建体号R870从HindIII(在多克隆位点中，启动子5，上游)至EcoRI(紧邻NOS终止子的下游)的部分核酸序列，其编码HSP40(下划线，斜体)和HSP70(下划线)。因此，本发明还提供了在植物中生产嵌合流感VLP的方法，其中编码嵌合流感HA的第一核酸与编码伴侣蛋白的第二核酸共表达。第一和第二核酸可以在同一步骤中弓丨入植物，或者可以顺次引入植物。可通过例如血细胞凝集测定、电子显微镜观察或体积排阻色谱来评估VLP的结构和大小。对于体积排阻色谱，可通过以下方法从植物组织中提取全部可溶性蛋白质将冷冻粉碎的植物材料在提取缓冲液中勻浆(Polytron)，通过离心除去不溶性物质。用PEG进行沉淀也可以是有利的。定量可溶性蛋白质，并将提取物通a^phacryl柱。可用蓝葡聚糖2000作为校准标准。在进行色谱后，可通过免疫印迹进一步分析级分以确定级分中的蛋白质成分。本发明还提供了这样的植物，其包含编码一种或更多种嵌合流感血凝素的核酸和编码一种或更多种伴侣蛋白的核酸。本发明包括核苷酸序列SEQIDNO:63(构建体690；包含苜蓿质体蓝素启动子和5，UTR、嵌合血凝素编码序列、苜蓿质体蓝素3，UTR和终止子序列的嵌合H5/H1表达盒)，SEQIDNO63下划线部分编码H5/Indo的SP、F，1、El-Hl/Bri的RB-H5/Indo的E2、F，2、F、TMD/CT；SEQIDNO:64(构建体691；包含苜蓿质体蓝素启动子和5，UTR、嵌合血凝素编码序列、苜蓿质体蓝素3，UTR和终止子序列的嵌合H5/H1表达盒)，SEQIDNO64下划线部分编码H5/lndo的SP、F，Ι-Hl/Bri的El、RB、E2-H5/Indo的F，2、F、TMD/CT；SEQIDNO:65(构建体696；包含苜蓿质体蓝素启动子和5，UTR、嵌合血凝素编码序列、苜蓿质体蓝素3，UTR和终止子序列的嵌合H1/H5表达盒)，SEQIDNO65下划线部分编码PDISP-H1/NC的F，1、El_H5/Indo的RB-H1/NC的E2、F，2、F、TMD/CT；SEQIDNO:68(构建体733；包含CaMV35S启动子、CPMV-HT5，UTR、PDI信号肽编码序列、Hl型A/布里斯班/59/07(HlNl)血凝素编码序列、CPMV-HT3，UTR和NOS终止子序列的SpPDIHl/Bri表达盒)，SEQIDNO68的下划线部分编码PDISP-H1/BRI的F，1、E1、RB、E2、F'2、F、TMD/CT；SEQIDNO:69(构建体734；包含CaMV35S启动子、CPMV-HT5’UTR、嵌合血凝素编码序列、CPMV-HT3，UTR和NOS终止子序列的嵌合H5/H1表达盒)。嵌合HA的编码序列用下划线表示，其编码与SEQIDNO:63相同的嵌合HA；SEQIDNO71(构建体736；包含CaMV35S启动子、CPMV-HT5，UTR、PDI信号肽编码序列、H3型A/布里斯班/10/07(H2N3)血凝素编码序列、CPMV-HT3，UTR和NOS终止子序列的HA表达盒)，SEQIDNO71的下划线部分编码PDISP_H3/Bri的F，1、El、RB、E2、F'2、F、TMD/CT；SEQIDNO:72(构建体737；包含CaMV35S启动子、CPMV-HT5，UTR、嵌合血凝素编码序列、CPMV-HT3，UTR和NOS终止子序列的嵌合H5/H3表达盒)，SEQIDNO72下划线部分编码PDISP-H5/Indo的F，1、El、RB、E2、F，2、F、TMD/CT；SEQIDNO:74(构建体739；包含CaMV35S启动子、CPMV-HT5，UTR、PDI信号肽编码序列、HA型B/佛罗里达/4/06的血凝素编码序列、CPMV-HT3，UTR和NOS终止子序列的HA表达盒)，SEQIDNO74的下划线部分编码PDISP-B/Flo的F，1、El、RB、E2、F，2、F、TMD/CT；SEQIDNO:75(构建体734；包含CaMV35S启动子、CPMV-HT5，UTR、嵌合血凝素编码序列、CPMV-HT3，UTR和NOS终止子序列的嵌合H5/B表达盒)，SEQIDNO75下划线部分编码PDISP-B/Flo的F，1、E1、RB、E2、F’2、F_H5/lndo的TND/CT。本发明还包括在严格杂交条件下与任一SEQIDNO:63_65、68、69和71-75下划线部分杂交的核苷酸序列。本发明还包括在严格杂交条件下与任一SEQIDNO:63-65,68,69和71-75下划线部分的互补序列杂交的核苷酸序列。这些与SEQIDNO:63_65、68、69和71-75下划线部分或SEQIDNO:63_65、68、69和71-75下划线部分的互补序列杂交的核苷酸序列编码嵌合血凝素蛋白，其表达形成嵌合VLP，并且当施用给对象时，嵌合VLP诱导抗体产生。例如，所述核苷酸序列在植物细胞内表达形成嵌合VLP，所述嵌合VLP可用于产生能结合HA(包括一种或更多种流感类型或亚型的成熟HA、HA0、HAl或H/^)的抗体，当施用给对象时，所述VLP诱导免疫应答。严格杂交条件下的杂交是本领域已知的(参见例如CurrentProtocolsinMolecularBiology,Ausubel等编，1995及增干Ij；Maniatis等，MolecularCloning(ALaboratoryManual),ColdSpringHarborLaboratory,1982；Sambrook禾口Russell，MolecularCloning:ALaboratoryManual，第3版，2001；每个均通过引用并入本文)。一种该严格杂交条件的实例可以是在65°C下于4XSSC中杂交约16-20小时，然后在65°C下于0.IXSSC中清洗1小时，或在65°C下于0.IXSSC中清洗两次(每次20或30分钟)。或者，一个示例性严格杂交条件可以是在42°C下于50%甲酰胺，4XSSC中过夜(1620小时)，然后在65°C下于0.IXSSC中清洗1小时，或在65°C下于0.IXSSC中清洗2次(每次20或30分钟)，或者过夜(1620小时)，或者在65°C下于Church水性磷酸盐缓冲液(7%SDS；0.5MNaPO4缓冲液pH7.2；IOmMEDTA)中杂交，在50°C下于0.1XSSC，0.1%SDS中清洗2次(每次20或30分钟)，或者在65°C下于2XSSC，0.1%SDS中清洗2次(每次20或30分钟)。此外，本发明包括这样的核苷酸序列，其特征为与编码任一SEQIDNO:63、SEQIDNO:64、SEQIDNO:65、SEQIDNO:68、SEQIDNO:69、SEQIDNO:71、SEQIDNO:72、SEQIDNO74,SEQIDNO:75下划线部分之嵌合HA的核苷酸序列有约70%、75%、80%、85%、87%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%或其间任意量的序列同一性或序列相似性，其中该核苷酸序列编码血凝素蛋白，其在表达时形成嵌合VLP，该嵌合VLP诱导抗体产生。例如，所述核苷酸序列在植物细胞内表达形成嵌合VLP，该嵌合VLP可用于产生能结合HA(包括成熟HA、HA0、HA1或HA2)的抗体，当施用给对象时，所述VLP诱导免疫应答。“免疫应答”一般是指获得性免疫系统的应答。获得性免疫系统通常包括体液应答和细胞介导的应答。体液应答是由B淋巴细胞谱系的细胞(B细胞)产生的分泌抗体所介导的免疫方面。分泌抗体结合入侵微生物(例如病毒或细菌)表面上的抗原，标示它们以进行破坏。体液免疫一般是指抗体产生和伴随其的过程，以及抗体的效应物功能，包括Th2细胞活化和细胞因子产生、记忆细胞形成、调理素促进胞吞作用、病原体清除等。术语“调节”是指根据通常知晓或使用的任意测定法(其中一些在本文中举例说明)测定的特定应答或参数的升高或降低。细胞介导的应答是这样的免疫应答，其不涉及抗体，而涉及巨噬细胞、自然杀伤细胞(NK)、抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞的活化，以及多种细胞因子应答于抗原的释放。细胞介导的免疫一般指一些Th细胞的活化、Tc细胞的活化和T细胞介导的应答。细胞介导的免疫在对病毒感染的应答中尤为重要。例如，可使用ELISP0T测定来测量对抗原特异性CD8阳性T淋巴细胞的诱导；可使用增殖测定来测量对CD4阳性T淋巴细胞的刺激。可使用ELISA测定来定量抗流感病毒抗体的效价；还可使用抗同种型抗体(例如抗IgG、抗IgA、抗IgE或抗IgM)来测量抗原特异性或交叉反应性抗体的同种型。实施这些测定的方法和技术是本领域公知的。血细胞凝集抑制(HI或HAI)测定也可用于证明由疫苗或疫苗组合物诱导的抗体的效力，所述疫苗或疫苗组合物包含可抑制由重组HA所致之红血细胞(RBC)凝集的嵌合HA或嵌合VLP。血清样品的血细胞凝集抑制性抗体效价可通过微量滴定HAI来评估(Aymard等，1973)。可使用任何来自几个物种的红细胞，例如马、火鸡、鸡等。该测定给出有关HA三聚体在VLP表面上组装的间接信息，证实HA抗原位点的正确展示。交叉反应性HAI滴定还可用于证明免疫应答对与疫苗亚型相关的其他病毒株的效力。例如，可以在HAI测定中将用包含嵌合血凝素(包含第一流感类型或亚型的HDC)之疫苗组合物免疫的对象的血清与第二株全病毒或病毒颗粒一起使用，并且测定HAI效价。不希望受理论限制，HA结合来自不同动物之RBC的能力是由HA对α2，3或α2，6键合唾液酸的亲和力以及这些唾液酸在RBC表面上的存在来驱动的。马和禽类的流感病毒HA使来自所有几个物种(包括火鸡、鸡、鸭、豚鼠、人、绵羊、马和牛)的红细胞凝集；而人HA结合火鸡、鸡、鸭、豚鼠、人和绵羊的红细胞(ItoΤ.等，1997，Virology，卷227，493-499；以及MedeirosR等，2001，Virology，卷289，74-85)。细胞因子的存在或水平也可以被定量。例如，用ELISA(例如BDBiosciencesOptEIA试剂盒)测量IFN-γ和IL-4分泌细胞来表征T辅助细胞应答(Thl/TM)。可培养从对象得到的外周血单核细胞(PBMC)或脾细胞，并分析上清。还可使用标志物特异性荧光标记和本领域已知方法，通过荧光激活细胞分选(fluorescence-activatedcellsorting,FACS)对T淋巴细胞定量。还可进行微量中和测定来表征对象中的免疫应答，参见例如Rowe等，1973的方法。可通过几种方法得到病毒中和效价，包括1)在对细胞进行结晶紫固定/着色之后，计数裂解斑(空斑测定)；幻显微镜观察培养物中的细胞裂解；幻对NP病毒蛋白(与病毒感染宿主细胞有关)进行ELISA和分光光度检测。序列同一性或序列相似性可利用序列比较程序来确定，例如DNASIS所提供的(例如，使用但不限于下述参数空隙罚分5、顶部对角线数(#oftopdiagonal)5、固定的空隙罚分10、k元祖2、游隙10，窗口大小5)。然而，其他用于比较的序列比对方法是本领域熟知的，例如Smith&Waterman算法(1981，Adv.Appl.Math.2:482)、Needleman&ffunsch算法(J.Mol.Biol.48:443,1970)、Pearson&Lipman算法(1988，Proc.Nat，1.Acad.Sci.USA85:2444)，以及这些算法的计算机执行(例如GAP、BESTFIT、FASTA和BLAST(Altschul等，1990.J.MolBiol215:403-410))，或者通过人工比对和目视检查。可以对核酸或氨基酸序列进行比较或比对，并使用任何现有技术已知的几种软件包测定共有序列，例如MULTALIN(CorpetF.，1988，NuclAcidsRes.，16(22)，10881-10890)、BLAST、CLUSTAL等；或者可以人工比对序列并确定序列间的相似度和差异。蛋白质、融合蛋白或多肽的片段或部分包含含有特定蛋白质或多肽之一部分氨基酸组成的肽或多肽，前提是在表达时所述片段可形成嵌合VLP。例如所述片段可以包含抗原性区域、应激应答诱导区域或含有蛋白质或多肽之功能性结构域的区域。所述片段还可包含同一总家族的蛋白质共有的区域或结构域，或者片段可包含足以特异性鉴定其来源全长蛋白质的氨基酸序列。例如，片段或部分可包含蛋白质全长的约60%至约100%或其间任意量，前提是在表达时该片段可形成嵌合VLP。例如，蛋白质全长的约60%至约100%、约70%至约100%、约80%至约100%、约90%至约100%、约95%至约100%，或其间任意量。或者，根据嵌合HA，片段或部分可以为约150至约500个氨基酸或其间任意量，前提是在表达时所述片段可形成嵌合VLP。例如，根据嵌合HA，片段或部分可以为约150至约500个氨基酸或其间任意量、约200至约500个氨基酸或其间任意量、约250至约500个氨基酸或其间任意量、约300至约500个氨基酸或其间任意量、约350至约500个氨基酸或其间任意量、约400至约500个氨基酸或其间任意量、约450至约500个氨基酸或其间任意量，前提是在表达时片段可形成嵌合VLP。例如，可从嵌合HA蛋白的C端、N端或者N和C两端去除约5、10、20、30、40或50个氨基酸或其间任意量，前提是在表达时所述片段可形成嵌合VLP。任意给定序列中的氨基酸编号是相对于该特定序列的，然而，本领域技术人员可根据结构和/或序列容易地确定序列中特定氨基酸的“等同性”。例如，如果去除了6个N端氨基酸，那么这将改变氨基酸的具体编码标识(例如，相对于蛋白质全长而言)，但是不会改变结构中氨基酸的相对位置。本发明描述了(但不限于)在植物、植物部分或植物细胞中编码嵌合HA的核酸的表达，以及适于生产疫苗的植物中生产嵌合流感VLP。这些核酸的实例包括但不限于，例如SEQIDNO63,SEQIDNO64、SEQIDNO65,SEQIDNO68,SEQIDNO69,SEQIDNO:71、SEQIDNO:72,SEQIDNO74,SEQIDNO:75。本发明还提供了在植物、植物部分或植物细胞中表达编码嵌合HA的核酸(例如但不限于SEQIDNO:63、SEQIDNO:64、SEQIDNO:65、SEQIDNO:68、SEQIDNO:69、SEQIDNO71,SEQIDN0:72、SEQIDNO74,SEQIDNO:75)，以及在转化的植物细胞中生产包含重组流感结构蛋白的候选流感疫苗或试剂，所述重组流感结构蛋白自组装成功能性和免疫原性的同型大分子蛋白结构，包括亚病毒流感颗粒和嵌合流感VLP。因此，本发明提供了嵌合VLP，和通过表达单个嵌合包膜蛋白在植物表达系统中生产嵌合VLP的方法。编码流感亚型嵌合HA的核酸(例如SEQIDNO:63、SEQIDNO:64、SEQIDNO65、SEQIDNO:68、SEQIDNO:69、SEQIDNO:71、SEQIDNO:72、SEQIDNO:74、SEQIDNO75)可以通过使用HARNA通过反转录和聚合酶链式反应(PCR)合成。例如，可以从Hl/NC、Hl/Bri、H3/Bri、B/Flo或H5/lndo中或者从感染了这些或其他流感病毒类型或亚型的细胞中分离RNA。对于反转录和PCR，可以使用HARNA特异性寡核苷酸引物。另外，编码嵌合HA的核酸可以使用本领域技术人员已知的方法化学合成。本发明还涉及包含编码嵌合HA之核酸(如上所述，其与在植物中有效的调控元件有效连接)的基因构建体。在植物细胞中有效并可用于本发明的调控元件的实例包括但不限于质体蓝素调控区(US7，125,978；其通过引用并入本文)或核酮糖1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶(RuBisCO;US4，962，028；其通过引用并入本文)、叶绿素a/b结合蛋白(CAB；Leutwiler等；1986；其通过引用并入本文)、ST_LS1(与光系统II的放氧复合物相关，描述于Mocldiaus等1987、1989中；其通过引用并入本文)的调控区。本发明的基因构建体还包含组成型启动子，其指导与启动子有效连接的基因在植物各部分中表达并在整个植物发育过程中持续表达。组成型启动子的一个非限制性的实例是与CaMV35S转录本相关的组成型启动子(例如，Odell等，1985，Nature,313=810-812,通过引用并入本文)。包含质体蓝素调控区的序列的实例是SEQIDNO:58的序列5，端至编码PDI信号肽的下划线序列。调控元件或调控区可增强与其有效连接的核苷酸序列的翻译，其中核苷酸序列可编码蛋白质或多肽。调控区的另一实例是源自豇豆花叶病毒(CowpeaMosaicVirus,CPMV)非翻译区的调控区，其可用于优先翻译与其有效连接的核苷酸序列。这一CPMV调控区用于可过量翻译的CMPV-HT系统中，参见例如&iinsbury等，2008，PlantPhysiology148:1212-1218;Sainsbury等，2008PlantBiotechnologyJournal682-92，两者均通过引用并入本文)。因此，本发明的一方面提供了包含与编码嵌合流感HA之序列有效连接的调控区的核酸。所述调控区可以是质体蓝素调控元件，所述嵌合流感HA可包含来自H5Ando、Hl/Bri、H3/Bri、Hl/NC、B/Flo流感类型、亚型或毒株的亚结构域。包含质体蓝素调控元件和嵌合流感HA的核酸序列在本文中通过SEQIDN0:63和64示例。包含35S调控元件和嵌合流感HA的核酸序列在本文中通过SEQIDNO:68、69和71-75示例。在另一方面，本发明提供包含CPMV调控区和嵌合流感HA(包含来自H5/lndo、Hl/Bri、H3/Bri、Hl/NC、B/Flo流感类型、亚型或毒株的亚结构域)的核酸。包含CPMP调控元件和嵌合HA的核酸序列在本文中通过SEQIDNO:66-69和71-75示例。在植物中产生的嵌合流感VLP从质膜中出芽，因而嵌合VLP的脂质组成反映产生它们的植物细胞或植物组织类型。根据本发明生产的VLP包含两种或多于多种类型或亚型流感的嵌合HA，其与植物来源的脂质复合。植物脂质可刺激特异免疫细胞并增强所诱导的免疫应答。植物脂质如PC(磷脂酰胆碱)和PE(磷脂酰乙醇胺)以及鞘糖脂可结合哺乳动物免疫细胞(例如抗原呈递细胞(APC)，如树突状细胞和巨噬细胞)和其他细胞(包括胸腺和肝脏中的B淋巴细胞和T淋巴细胞)表达的CDl分子。(综述见TsujiM.2006CellMolLifeSci63:1889-98)。⑶1分子在结构上与主要组织相容性复合体(MHC)I类分子相似，其作用是将糖脂抗原呈递给NKT细胞(自然杀伤T细胞)。活化后，NKT细胞激活固有免疫细胞(例如NK细胞和树突状细胞)并且还激活获得性免疫细胞(例如产生抗体的B细胞和T细胞)。存在于与脂双层(例如质膜来源的包膜)复合之流感VLP中的植物固醇可提供有利的疫苗组合物。不希望受理论限制，与脂双层(例如质膜来源的包膜)复合的由植物生产的VLP(包括包含嵌合HA的VLP)比在其他表达系统中制得的VLP可诱导更强的免疫反应，并且可与由活或减毒全病毒疫苗所诱导的免疫反应相似。因此，在一些实施方案中，本发明提供了与植物来源的脂双层复合的VLP(包含嵌合HA)。在一些实施方案中，所述植物来源的脂双层可包括VLP的包膜。在植物内生产的VLP可包含含有植物特异性N-聚糖的嵌合HA。因此，本发明还提供了包含具有植物特异性N-聚糖的嵌合HA的VLP。此外，植物中N-聚糖的修饰是已知的(参见例如WO2008/151440；其通过引用并入本文)，并且可产生含有经修饰N-聚糖的嵌合HA。可得到包含经修饰糖基化模式(例如岩藻糖基化减少、木糖基化减少、或岩藻糖基化和木糖基化二者均减少)之N-聚糖的HA，或者可得到含有经修饰糖基化模式的嵌合HA，其中蛋白质缺少岩藻糖基化、木糖基化或两者皆缺少，并包含增加的半乳糖基化。此外，与表达嵌合HA的野生型植物相比，翻译后修饰的调节(例如末端添加半乳糖)可导致所表达嵌合HA的岩藻糖基化和木糖基化降低。例如(但不视为限制)，合成具有经修饰糖基化模式的嵌合HA可通过使目的蛋白质与编码β-1，4-半乳糖基转移酶(GalT)(例如但不限于哺乳动物(ialT或人(ialT，然而也可以使用其他来源的(ialT)的核苷酸序列共表达来实现。还可将felT的催化结构域与N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶(GNTl)的CTS结构域(即胞质尾、跨膜结构域、茎区)融合以产生GNTl-GalT杂合酶，并且该杂合酶可与HA共表达。HA还可与编码N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶111(GnT-III)(例如但不限于哺乳动物GnT-111或人GnT-111，还可使用其他来源的&1T-III)的核苷酸序列共表达。另外，还可使用包含与&1T-III融合的GNTl之CTS的GNTl-GnT-III杂合酶。因此，本发明还包括含有嵌合HA的VLP，所述嵌合HA具有经修饰的N-聚糖。不希望受理论限制，嵌合HA上存在的植物N-聚糖可通过促进抗原呈递细胞与HA的结合来刺激免疫应答。Saint-jore-Dupas等(TrendsBiotechnol25:317-23,2007)已提出使用植物N聚糖来刺激免疫应答。此外，VLP的构象对于抗原呈递可以是有利的，并且当与植物来源的脂质层复合时增强VLP的佐剂作用。“调控区”、“调控元件”或“启动子”是指通常(但不总是)位于基因的蛋白质编码区上游的一部分核酸，其可由DNA或RNA或者DNA和RNA两者构成。当调控区有活性并与目的基因有效相连或有效连接时，可导致目的基因的表达。调控元件可以介导器官特异性，或控制发育基因或时序基因的活化。“调控区”包括启动子元件、显示启动子基础活性的核心启动子元件、可响应于外部刺激而被诱导的元件、介导启动子活性的元件(例如负调控元件或转录增强子)。本文所用的“调控区”还包括在转录后具有活性的元件，例如调节基因表达的调控元件，例如翻译增强子和转录增强子、翻译抑制子和转录抑制子、上游激活序列和mRNA不稳定性决定子(mRNAinstabilitydeterminant)。这后几种元件中有几种可位于编码区附近。在本公开内容中，术语“调控元件”或“调控区”一般是指通常(但不总是)位于结构基因编码序列上游(5，)的DNA序列，其通过提供转录在特定位点起始所需的RNA聚合酶和/或其他因子的识别来控制编码区表达。然而，应当理解的是，位于内含子中或序列3’的其他核苷酸序列也可对调控目的编码区的表达有贡献。为确保在特定位点起始而为RNA聚合酶或其他转录因子提供识别的调控元件的一个实例是启动子元件。大多数(但不是全部)真核生物启动子元件包含TATA盒，其是由腺苷和胸苷核苷酸碱基对组成的保守核酸序列，通常位于转录起始位点上游约25个碱基对处。启动子元件包含负责起始转录的基础启动子元件以及调节基因表达的其他调控元件(如上文所述)。存在几种类型的调控区，包括受发育调节的、诱导型的或组成型的调控区。受发育调节的调控区或对所控制基因的差异性表达进行控制的调控区在特定器官或器官之组织中、在该器官或组织发育过程的特定时间被活化。然而，受发育调节的一些调控区也可偏好性地在某些器官或组织的特定发育阶段具有活性，它们还可以以受发育调节的方式具有活性，或在植物的其他器官或组织内为基础水平。组织特异性调控区(例如参见特异性调控区)的实例包括napin启动子和cruciferin启动子(Rask等，1998，J.PlantPhysiol.152595-599;Bilodeau等，1994，PlantCell14:125-130)。叶特异性启动子的实例包括质体蓝素启动子(参见例如SEQIDNO58)；US7，125，978，其通过引用并入本文。诱导型调控区是能够响应于诱导物而直接或间接激活一种或更多种DNA序列或基因之转录的调控区。当不存在诱导物时，DNA序列或基因不会被转录。通常，特异性结合诱导型调控区以激活转录的蛋白因子可以以无活性形式存在，然后被诱导物直接或间接转化成活性形式。然而，也可以不存在蛋白因子。诱导物可以是化学剂，例如蛋白质、代谢物、生长调节剂、除草剂或酚类化合物，或通过热、冷、盐或毒性元素直接施加的生理压力，或通过病原体或致病剂(例如病毒)的作用间接施加的生理压力。可通过向细胞或植物外部施加诱导物(例如通过喷洒、浇水、加热或类似方法)使含有诱导型调控区的植物细胞暴露于诱导物。诱导型调控元件可来源于植物基因或非植物基因(例如fettz，C.和Lenk，I.R.P.，1998,TrendsPlantki.3，352-358，其通过引用并入本文)。可用的诱导型启动子的实例包括但不限于四环素诱导型启动子(Gatz,C.，1997，Ann.Rev.PlantPhysiol.PlantMol.Biol.48，89-108，其通过引用并入本文)、类固醇诱导型启动子(Aoyama,T.和Chua，N.H.，1997，PlantJ.2，397-404，其通过引用并入本文)和乙醇诱导型启动子(Salter,Μ.G等，1998，PlantJournal16,127-132；Caddick,Μ.X.等，1998，NatureBiotech.16，177-180，其通过引用并入本文)、细胞分裂素诱导型IB6和CKIl基因(Brandstatter，I.和Kieber，J.J.，1998，PlantCell10，1009-1019;Kakimoto，Τ·，1996，Science274,982-985,其通过引用并入本文)以及生长素诱导型元件DR5(UlmaS0V，T.等，1997，PlantCell9，1963-1971，其通过引用并入本文)。组成型调控区指导基因在植物各部分表达并在整个植物发育过程中持续表达。已知的组成型调控元件的实例包括与以下相关的启动子CaMV35S转录本(Odell等，1985，Nature，313:810-812)、水稻肌动蛋白1(Zhang等，1991，PlantCell，3:1155-1165)、肌动蛋白2(An等，1996，PlantJ.，10107-121)或tms2(U.S.5，428，147，其通过引用并入本文)以及磷酸丙糖异构酶1基因(Xu等，1994，PlantPhysiol.106:459-467)、玉米泛素1基因(Cornejo等，1993，PlantMol.Biol.29:637-646)、拟南芥泛素1和6基因(Holtorf等，1995，PlantMol.Biol.29:637-646)、烟草翻译起始因子4A基因(Mandel等，1995，PlantMol.Biol.29:995-1004)。本文所用的术语“组成型”不一定指受所述组成型调控区控制的基因在所有细胞类型中以相同水平表达，而是指基因在多种细胞类型中表达，尽管常常观察到不同的丰度。组成型调控元件可与其他序列偶联以进一步增强与其有效连接之核苷酸序列的转录和/或翻译。例如，CMPV-HT系统源自豇豆花叶病毒(CPMV)的非翻译区，并显示增强相关编码序列的翻译。“天然”是指核酸或氨基酸序列是天然存在的，或“野生型”。“有效连接”是指特定序列(例如调控元件与目的编码区)直接或间接地相互作用以实现预定功能(例如介导或调节基因表达)。例如有效连接的序列之间的相互作用可通过与所述有效连接之序列相互作用的蛋白质来介导。本发明的一种或更多种核苷酸序列可在被本发明核苷酸序列、或构建体或载体转化的任意合适的植物宿主中表达。合适宿主的实例包括但不限于农作物，包括苜蓿、油菜、芸苔属(Brassicaspp.)、玉米、烟草属(Nicotianaspp.)、苜蓿、马铃薯、人参、豌豆、燕麦、水稻、大豆、小麦、大麦、向日葵、棉花等。本发明的一种或更多种嵌合基因构建体还可包含3’非翻译区。3’非翻译区是指这样的基因部分，其包含含有多腺苷酸化信号和能够影响mRNA加工或基因表达之任意其他调控信号的DNA区段。多腺苷酸化信号的特征一般在于向mRNA前体的3’端添加多腺苷酸链。多腺苷酸化信号常通过存在经典形式5’AATAAA-3’的同源物来鉴定，但是也会出现变体。合适的3’区的非限制性实例是含有以下基因的多腺苷酸化信号的3’转录的非翻译区农杆菌致瘤(Ti)质粒基因(例如胭脂氨酸合酶(Nos基因))以及植物基因(例如大豆贮藏蛋白基因)、核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶的小亚基基因(ssRUBISCO；US4，962，028，其通过引用并入本文)、用于调节质体蓝素表达的启动子(描述于US7，125，978(其通过引用并入本文))。本发明的一种或更多种嵌合基因构建体还可以进一步包括增强子，根据需要可以是翻译或转录增强子。增强子可以位于被转录序列的5’或3’。增强子区域是本领域技术人员公知的，并且可包括ATG起始密码子、邻近序列等。如果存在起始密码子，则其可在编码序列的读码框的相(Phase)中(“框内”(“inframe”))，以提供转录序列的正确翻译。为了帮助鉴定转化的植物细胞，可进一步处理本发明的构建体使其包含植物选择标记。可用的选择标记包括提供针对化学品(例如抗生素，如庆大霉素、潮霉素、卡那霉素；或除草剂，如膦丝菌素(phosphinothrycin)、草甘膦、氯磺隆等)的抗性的酶。类似地，可使用产生可通过颜色变化进行鉴定之化合物的酶(例如GUS(β-葡萄糖醛酸酶))或提供发光的酶(如萤光素酶或GFP)。认为是本发明一部分的还有包含本发明嵌合基因构建体的转基因植物、植物细胞或种子。由植物细胞再生完整植物的方法也是本领域已知的。一般而言，将转化植物细胞培养在合适的培养基中，所述培养基可包含选择剂(例如抗生素)，其中使用选择标记以帮助鉴定转化的植物细胞。愈伤组织形成后，可根据已知方法应用合适的植物激素来促进芽的形成，将芽移至生根培养基中以再生植物。然后，通过种子或利用植物无性繁殖技术，植物可用于建立可重复的世代。还可以不使用组织培养物来形成转基因植物。认为是本发明一部分的还有包含嵌合基因构建体的转基因植物、树木、酵母、细菌、真菌、昆虫和动物细胞，所述嵌合基因构建体含有编码本发明之用于产生VLP的重组嵌合HA或HAO的核酸。为了在多种可用于转化或瞬时表达的宿主生物中表达，还可以将本发明的调控元件与目的编码区相组合。这样的生物包括但不限于植物(单子叶植物和双子叶植物)，例如但不限于玉米、谷类植物、小麦、大麦、燕麦、烟草属、芸苔属、大豆、菜豆、豌豆、苜蓿、马铃薯、番茄、人参和拟南芥。用于这些生物的稳定转化和再生的方法已在本领域中建立并且是本领域技术人员已知的。获得转化植物和再生植物的方法对本发明来说不是关键的。“转化”是指表现为基因型、表型或二者兼有的遗传信息(核苷酸序列)在种间转移。遗传信息从嵌合构建体向宿主的种间转移可以是可遗传的并且认为遗传信息的转移是稳定的，或者转移可以是瞬时的并且遗传信息的转移是不可遗传的。术语“植物物质”是指来源于植物的任何材料。植物物质可包括完整植物、组织、细胞或其任意部分。此外，植物物质可包括细胞内植物组分、细胞外植物组分、植物的液体或固体提取物或者其组合。此外，植物物质可包括来自植物叶、茎、果实、根或其组合的植物、植物细胞、组织、液体提取物或其组合。植物物质可包括未进行任何处理步骤的植物或其部分。植物的一部分可包含植物物质。然而，还考虑可对所述植物材料施加下定义的最少处理步骤或更严格的处理，包括使用本领域公知的技术(包括但不限于色谱、电泳等)进行部分或大量蛋白质纯化。术语“最少处理”是指部分纯化包含目的蛋白的植物物质(例如植物或其部分)以得到植物提取物、勻浆、植物勻浆的级分等(即最少处理)。部分纯化可包括但不限于破坏植物细胞结构从而产生含有可溶性植物组分和不溶性植物组分的组合物，不溶性植物组分可通过例如但不限于离心、过滤或其组合进行分离。在此方面，可使用真空或离心提取容易地获得叶或其他组织的细胞外间隙中分泌的蛋白质，或可以通过穿过滚轴或研磨等在压力下进行组织提取，从而将蛋白从细胞外间隙中挤压或释放。最少处理还可包括制备可溶性蛋白质的粗提物，因为这些制备物中将具有可忽略的来自次级植物产物的污染。另外，最少处理可包括从叶中水性提取可溶性蛋白质，然后用任意合适的盐进行沉淀。其他方法可包括大规模的浸渍和汁液提取，以允许直接使用提取物。可将植物物质(形式为植物材料或组织)经口递送给对象。植物物质可作为膳食补充剂的一部分与其他食物一起施用，或者被装入胶囊中。植物物质或组织还可以被浓缩以改善或增进适口性，或者按照需要与其他材料、成分或药物赋形剂一起提供。可施用本发明VLP的对象或目标生物的实例包括但不限于人、灵长类、鸟类、水禽、候鸟、鹌鹑、鸭、鹅、家禽、鸡、猪、绵羊、马科动物、马、骆驼、犬科动物、狗、猫科动物、猫、虎、豹、麝猫、水貂、石貂、雪貂、宠物、家畜、兔、小鼠、大鼠、豚鼠或其他啮齿动物、海豹、鲸等。这些目标生物是示例性的，并且不视为限制本发明的应用和用途。考虑根据需要和情形，以多种方式将含有本发明一些实施方式的嵌合HA或表达含有本发明一些实施方式之嵌合HA的VLP的植物施用给对象或目标生物。例如，可在使用之前将得自植物的嵌合HA以粗提物、部分纯化或纯化的形式被提取。如果嵌合HA是至少部分纯化的，那么其可以在可食用植物或不可食用植物中产生。此外，如果经口施用嵌合HA，则可以收集植物组织并直接给对象食用，或者可在食用之前干燥收集的组织，或者可以不预先收集而使动物在植物上进食。认为在本发明范围内的还有将收集的植物组织作为动物饲料的食物补充剂。如果向动物饲喂的植物组织不进行或几乎不进行进一步处理，则优选所施用的植物组织是可食用的。转录后基因沉默(PTGS)可参与限制转基因在植物中的表达，来自马铃薯Y病毒的沉默抑制子(HcPro)的共表达可用于抵抗转基因mRNA的特异性降解(Brigneti等，1998)。可替代的沉默抑制子是本领域熟知的，并且可如本文所述使用(Chiki等，2006，Virology346:7-14,其通过引用并入本文)，例如但不限于TEV-pl/HC-Pro(烟草蚀纹病毒-pl/HC-Pro)、BYV-p21、番茄丛矮病毒的pl9(TBSVpl9)、番茄皱缩病毒的衣壳蛋白(TCV-CP)、黄瓜花叶病毒的2b(CMV-2b)、马铃薯X病毒的p25(PVX-p25)、马铃薯M病毒的pll(PVM-pll)、马铃薯S病毒的pll(PVS-pll)、蓝莓枯黄病毒的pl6(BScV-pl6)、柑橘衰退病毒(Citrustristexavirus)的p23(CTV_p23)、葡萄卷叶相关病毒_2的p24(GLRaV-2pM)、葡萄病毒A的plO(GVA-plO)、葡萄病毒B的pl4(GVB-pl4)、白芷潜伏性病毒(Heracleumlatentvirus)的plO(HLV-plO)或大蒜普通潜伏性病毒的pl6(GCLV_pl6)。因此，沉默抑制子(例如但不限于HcPro、TEV-p1/HC-Pro、BYV-p21、TBSVρ19、TCV-CP、CMV_2b、PVX_p25、PVM-p11、PVS-pll,BScV-p16,CTV_p23、GLRaV_2p24、GBV_pl4、HLV-plO、GCLV-pl6或GVA-plO)可与编码目的蛋白的核酸序列共表达以进一步确保在植物中生产高水平的蛋白质。此外，如本文所述生产的VLP不包含神经氨酸酶(NA)。然而，如期望包含HA和NA的VLP，可以将NA与HA共表达。因此，本发明还包括合适的载体，其含有适用于稳定或瞬时表达系统中的嵌合HA序列。还可在一种或多于一种的构建体中提供遗传信息。例如，可将编码目的蛋白的核苷酸序列引入一种构建体，将编码修饰目的蛋白糖基化之蛋白质的第二核苷酸序列引入单独的构建体中。然后，可将这些核苷酸序列在植物中共表达。然而，也可使用这样的构建体，其包含编码目的蛋白和修饰目的蛋白糖基化之蛋白质两者的核苷酸序列。在此情形中，核苷酸序列将包含第一序列和第二序列，所述第一序列包含与启动子或调控区有效连接的编码目的蛋白的第一核酸序列，所述第二序列包含编码修饰目的蛋白糖基化模式之蛋白质的第二核酸序列，该第二核酸序列与启动子或调控区有效连接。“共表达”是指两种或两种以上核苷酸序列大致同时在植物中以及在植物的同一组织中表达。然而，核苷酸序列不必严格地同时表达。而是两种或更多种核苷酸序列的表达方式使得所编码产物有机会相互作用。例如，修饰目的蛋白糖基化的蛋白质可在目的蛋白表达前或表达期间表达，使得发生对目的蛋白的糖基化修饰。可使用瞬时表达系统共表达两种或两种以上的核苷酸序列，其中所述两种或更多种序列大致同时在适于这两种序列表达的条件下被引入植物中。或者，可以用编码目的蛋白的额外序列以瞬时或稳定方式转化含有核苷酸序列之一(例如编码修饰目的蛋白糖基化模式的蛋白质的序列)的平台植物(platformplant)。在此情形中，编码修饰目的蛋白糖基化模式之蛋白质的序列可在期望的发育阶段表达在期望的组织内表达，或者可使用诱导型启动子诱导其表达，而编码目的蛋白的额外序列可在相似条件下在同一组织内表达，以确保核苷酸序列的共表达。可使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电穿孔、侵染等将本发明的构建体引入植物细胞中。这些技术的综述参见例如WeiSSl3ach*WieiSSbach，MethodsforPlantMolecularBiology,AcademyPress,纽约VIII，421-463页(1988)；Geierson和Corey，PlantMolecularBiology,第2版(1988)以及Miki和Iyer，FundamentalsofGeneTransferinPlants.PlantMetabolism,第2版，DT.Dennis,DHTurpin,DDLefebrve,DBLayzell(编)，Addisonffesly,LangmansLtd.London,561-579页(1997)。其他方法包括直接DNA摄取、使用脂质体、电穿孔(例如使用原生质体)、显微注射、微弹(microprojectile)或whisker以及真空侵染。参见例如Bilang等(Gene100:247-250(1991)),Scheid^(Mol.Gen.Genet.228:104-112,1991),Guerche等(PlantScience52:111-116，1987)、Neuhause等(Theor.ApplGenet.75:30-36,1987)>Klein等，Nature327:70-73(1987)、Howell等(Science208:1265,1980)、Horsch等(Science227:1229_1231，1985)、DeBlock等，PlantPhysiology91:694-701,1989)、Liu和Lomonossoff(J·VirolMeth,105:343-348,2002)；美国专利No.4，945，050；5，036，006；5，100，792；6,403,865；5,625,136(所有这些文献均通过引用并入本文)。可使用瞬时表达法表达本发明的构建体(参见Liu和Lomonossoff，2002，JournalofVirologicalMethods，105:；343-；348，其通过引用并入本文)。或者，可使用基于真空的瞬时表达法，如Kapila等1997PlantScience122:101-108(其通过引用并入本文)所述。这些方法可包括，例如但不限于农杆菌接种法或农杆菌侵染法，然而，也可使用如上文所述的其他瞬时方法。使用农杆菌接种法或农杆菌侵染时，含有期望核酸的农杆菌混合物进入组织(例如叶、植物的地上部分(包括茎、叶和花)、植物的其他部分(茎、根、花)或整个植株)的细胞间隙中。穿过表皮后，农杆菌感染细胞并将t-DNA拷贝移至细胞中。t-DNA以附加体形式转录并且mRNA被翻译，使目的蛋白在感染细胞中产生，然而，t-DNA在核内的传代是瞬时的。本发明提供的包含嵌合HA的VLP可与现有流感疫苗组合使用，以补充所述疫苗使其更加有效，或降低所需的施用剂量。如本领域技术人员所已知的，疫苗可针对一种或更多种流感病毒。合适的疫苗的实例包括但不限于从Sanofi-Pasteur、IDBiomedicaUMerial,Sinovac>Chiron、Roche、MedImmune>GlaxoSmithKline>Novartis、Sanofi-Ayentis>Serono>ShirePharmaceuticals白勺贞。如期望，可将本发明的VLP与本领域技术人员已知的合适佐剂混合。此外，VLP可用于疫苗组合物，其含有用于治疗上述靶标生物的有效剂量VLP。此外，根据本发明生产的VLP可与使用不同流感蛋白质(例如神经氨酸酶(NA))得到的VLP相组合。因此，本发明提供了用于诱导动物或靶标生物中针对流感病毒感染的免疫的方法，其包括施用有效剂量的疫苗，所述疫苗含有一种或多于一种VLP。疫苗可经口、皮内、鼻内、肌内、腹腔内、静脉内或皮下施用。本发明多个实施方案的组合物可包含两种或更多种流感毒株或亚型的VLP。“两种或更多种”是指两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种毒株或亚型。所示毒株或亚型可以是单一亚型(例如，所有都为Hmi，或所有都为Η5Ν1)，或者可以是亚型的组合。示例性亚型和毒株包括H5/Indo、Hl/Bri、Hl/NC、H3/Bri、B/Flo。对毒株和亚型之组合的选择可取决于对象可能暴露于流感的地区，动物物种(例如水禽类、农业动物(例如猪)等)与待免疫人群的接近程度以及所述动物物种携带、暴露于或可能暴露于的毒株，对亚型或毒株内抗原漂移的预测，或者这些因素的组合。过去几年所使用的组合的实例可见于世界卫生组织(WHO)保存的数据库(见URL:who.int/csr/dieease/influenza/vaccinerecommendationsl/en)。两种或更多种VLP可单独表达，随后将纯化的或半纯化的VLP相组合。或者，VLP可在同一宿主(例如植物、植物部分或植物细胞)中共表达。VLP可以期望的比例(例如大致相等的比例)组合或生产，或者可以组合以使一种亚型或毒株占组合物中VLP的大部分。因此，本发明提供了包含两种或更多种毒株或亚型的VLP的组合物。还提供了包含包装材料和包含含有嵌合HA之VLP的组合物的产品。该组合物包含生理上或药理上可接受的赋形剂，包装材料可以包含标明组合物活性成分(例如VLP)的标签。还提供了包含组合物的试剂盒，所述组合物包含编码本文所述嵌合HA之核酸以及使用该核酸生产嵌合HA或包含嵌合HA的VLP的说明书。该试剂盒可用于生产包含嵌合HA的VLP，说明书可以包括，例如在植物或植物细胞中表达核酸的信息，从植物或植物组织中收获和获得VLP的说明。在另一个实施方案中，提供了用于制备药物的试剂盒，其包含含有嵌合HA的VLP及其使用说明书。说明书可以包含制备药物的一系列步骤，药物可用于在施用对象中诱导治疗性或预防性免疫应答。该试剂盒还可包含说明剂量浓度、剂量间隔、优选施用方法等的说明书。本发明将通过下面的实施例更详细的说明。但是应当理解，这些实施例仅用于说明的目的，不应以任何方式用于限制本发明的范围。本文描述的序列汇总如下。权利要求1.包含嵌合流感HA的多肽，所述嵌合流感HA包含茎结构域簇(SDC)、头部结构域簇(HDC)和跨膜结构域簇(TDC)，其中a)所述SDC包含F，1、F，2和F亚结构域；b)所述HDC包含RB、El和E2亚结构域；c)所述TDC包含TmD和Ctail亚结构域；而且其中至少一个亚结构域来自第一流感HA，并且其他亚结构域来自一种或更多种第二流感HA。2.权利要求1的多肽，其中所述第一和第二流感HA独立地选自包含H1、H3、H5*B的组。3.权利要求2的多肽，其还包含信号肽。4.编码权利要求1所述多肽的核酸。5.编码权利要求3所述多肽的核酸。6.在植物中生产嵌合流感病毒样颗粒(VLP)的方法，其包括a)向所述植物或其部分中引入权利要求5的核酸，和b)在允许所述核酸表达的条件下孵育所述植物或其部分，从而生产所述VLP。7.权利要求6的方法，其中在所述引入步骤(步骤a)中，以瞬时方式将所述核酸引入所述植物中。8.权利要求6的方法，其中在所述引入步骤(步骤a)中，将所述核酸引入所述植物中以使所述核酸稳定。9.权利要求6的方法，其还包括步骤c)收获宿主和纯化所述VLP。10.包含权利要求1所述多肽的病毒样颗粒(VLP)。11.权利要求10的VLP，其还包含植物特异性N-聚糖或修饰的N-聚糖。12.组合物，其包含有效剂量的权利要求10所述VLP和可药用载体。13.在对象中诱导针对流感病毒感染之免疫的方法，其包括施用权利要求20的病毒样颗粒。14.权利要求13的方法，其中所述病毒样颗粒经口、皮内、鼻内、肌内、腹腔内、静脉内或皮下施用给对象。15.植物或其部分，其包含权利要求1的多肽。全文摘要提供了在植物或植物部分中合成嵌合流感病毒样颗粒(virus-likeparticle，VLP)的方法。该方法涉及在植物或植物部分中表达嵌合流感HA。本发明还涉及包含嵌合流感HA蛋白和植物脂质的VLP。本发明还涉及编码嵌合流感HA的核酸以及载体。VLP可用于配制流感疫苗，或者可用于加强现有的疫苗。文档编号C12N7/01GK102482328SQ201080035066公开日2012年5月30日申请日期2010年6月25日优先权日2009年6月24日发明者皮埃尔-奥列弗·拉瓦,米凯莱·达吉斯,路易斯-菲利普·韦齐纳,马克-安德烈·德奥斯特,马农·科图雷申请人:麦迪卡格公司