用于对模板dna进行复制、扩增和测序的方法

专利名称：用于对模板dna进行复制、扩增和测序的方法
用于对模板DNA进行复制、扩增和测序的方法本发明属于生物技术领域。具体而言,本发明涉及ー种使用Φ 29型DNA聚合酶对脱氧核糖核酸进行复制、扩增或测序的方法和ー种用于实施所述方法的试剂盒。现有抟术水平噬菌体Φ29复制其基因组所需要的唯一酶是其DNA聚合酶，这是既能催化复制起始又能催化合成链延伸的66KDa的単体蛋白。对于起始，该聚合酶与称为“末端”(TP)的蛋白质结合，识别Φ29 ΝΑ的末端并催化TP-dAMP共价复合物形成。在聚合了 10个核苷酸后，DNA聚合酶/TP异ニ聚体解离，并延伸来自DNA的链。复制性DNA聚合酶需要与稳定酶和DNA间的结合的辅助蛋白相互作用(Kuriyan和O' Donnell. J Mol Biol. 1993 ;234 :915-925)。另ー方面，所述DNA聚合酶必须在当时未被复制的DNA链分离时偶联聚合，为此它们需要与解旋酶型蛋白的功能缔合。在这方面，噬菌体Φ29的DNA聚合酶具有以下使其独特的各种内在功能特性a)高持续合成能力(定义为通过结合事件掺入的核苷酸数目)；b)高链分离能力，这使得其可在不存在解旋酶型辅助蛋白时复制所述噬菌体的基因组。持续合成能力和链分离这两个特性使得Φ29 ΝΑ聚合酶能够合成超过70kb长的DNA链(Blanco 等，J Biol Chem. 1989 ；264 :8935-8940)；c)在新链中插入核苷酸的高准确性(Esteban等，J Biol Chem. 1993 ；268 2719-2726)。所有这些特性导致开发各种各样基于使用该聚合酶扩增双链DNA(dsDNA)的等温过程(恒温)方案。在简单构型中，Φ29 ΝΑ聚合酶利用环状单链DNA(ssDNA)的能力使得可通过滚环式方法(或RCA-滚环式扩增)扩增DNA，产生很长的含有不止10个环状模板拷贝 ssDNA 分子(Blanco 等，J Biol Chem. 1989 ；264 :8935-8940 ；US5001050, US5198543 和US5576204) ο在由 Amersham Biosciences/Molecular Staging(Dean%=, Genome Res. 2001 ；
11:1095-1099 ；Dean 等，Proc Natl Acad Sci USA. 2002 ；99 :5261-5266)开发的用于扩增dsDNA的方法中，将使用Φ29 ΝΑ聚合酶与使用六聚物(六-核苷酸)随机序列引物联合，使得能够从皮克级环状质粒DNA[GE Healthcare的Templiphi ]或从10纳克基因组DNA[GE Healthcare 的 Genomiphi 和 Qiagen 的 Repli-G ]开始获得 IO4-IO6 扩增因子。产生的产物具有高质量，并可直接被消化或测序而不需在前纯化，这证明了 Φ 29DNA聚合酶是用于该目的的最強的酶。用于实施使用Φ29 ΝΑ聚合酶的扩增反应的常见缓冲液含有tris-HCl (pH 7. 5)加不同浓度(毫摩尔级)的 NaCl 或 KCl 和 MgCl2 (US20030207267)。然而，尽管这些方案在多种情况下令人满意，但仍日益需要开发允许从更少DNA量开始的其它方案。发明简沭本发明涉及ー种使用Φ 29型DNA聚合酶对脱氧核糖核酸进行复制、扩增或测序的方法和ー种用于实施所述方法的试剂盒。
噬菌体φ 29DNA聚合酶具有非常令人感兴趣的用于扩增DNA的几个特点，例如无需任何辅助蛋白參与的高持续合成能力；和高链分离能力，这使得其可在与DNA单ー结合事件中复制所述噬菌体的基因组；以及在新链中插入核苷酸的高准确性。这些特性导致开发各种各样基于使用该聚合酶的用于等温扩增DNA的方案，该聚合酶使得能够获得不需在前纯化就可被直接消化或测序的高品质产物。然而，仍需要允许从其更小量扩增DNA的方案。本发明通过开发显著改进反应的特异性和产量的用于扩增DNA的方法来响应该需要。在本专利实施例中显示，将聚氧こ烯化单月桂酸山梨坦(Tween 20)和铵盐同时加入通常用于用Φ 29DNA聚合酶来扩增的缓冲液中，一方面防止非特异性DNA扩增，另一方面使得能够从有限量的O. I飞克(fg)的质粒DNA和作为模板的IOfg基因组DNA实现可检测的特异性扩増。
本发明第一方面涉及ー种用于对模板DNA进行复制、扩增或测序的方法，所述方法包括使所述DNA与包含至少以下的反应混合物接触a) Φ 29 型 DNA 聚合酶；b)聚氧こ烯化单月桂酸山梨坦；c)铵盐；d)缓冲液；e)氯化镁；f)引物；和g)核苷三磷酸。本发明该方面的一个优选实施方案涉及ー种用于对模板DNA进行复制、扩增或测序的方法，所述方法包括使所述DNA与反应混合物接触,所述反应混合物包含前述(a)-(g)组分，并还包含钾盐。优选所述钾盐为氯化钾或こ酸钾。本说明书所用术语“DNA聚合酶”涉及能够催化脱氧核苷三磷酸聚合的酶。通常，所述酶在与模板DNA序列杂交的引物3'端起始合成，并向模板DNA链的5'端行进。本发明所用术语“ Φ 29型DNA聚合酶”涉及在其聚合结构域中含有TPRl和TPR2亚域的任何DNA聚合酶，所述聚合结构域为聚合酶提供将向前聚合与链分离偶联的能力。可用于本发明的Φ 29型DNA聚合酶的实例选自分离自以下噬菌体的DNA聚合酶Φ 29,Cp-UPRD-I、Φ 15、<ji21、PZE、PZA、Nf、M2Y、B103、GA-l、SF5、Cp-5、Cp-7、PR4、PR5、PR722、L17 或酸菌属瓶形病毒(Acidianus Bottle-shaped virus, ABV)。在本发明用于复制、扩增或测序的方法的一个优选实施方案中，Φ29型DNA聚合酶选自分离自以下噬菌体的DNA聚合酶Φ 29、Cp-1、PRD-1、Φ 15、Φ 21、PZE、PZA、Nf、M2Y、B103、GA-l、SF5、Cp-5、Cp-7、PR4、PR5、PR722、L17 或酸菌属瓶形病毒(ABV)。在本发明用于复制、扩增或测序的方法的一个优选实施方案中，Φ29型DNA聚合酶具有与SEQ ID NO: I具有至少80%同一性的氨基酸序列。在一个更优选实施方案中，Φ 29型DNA聚合酶具有与SEQ ID NO :1具有至少90%同一性的氨基酸序列。在一个甚至更优选的实施方案中，Φ 29型DNA聚合酶具有氨基酸序列SEQ ID NO :1。Φ29型DNA聚合酶的核酸外切酶结构域为已知的，并可经修饰以降低核酸外切酶活性，但保留高持续合成能力和链分离能力。这些经修饰的DNA聚合酶尤其可用于大分子测序。在本发明用于复制、扩增或测序的一个优选实施方案中，Φ29型DNA聚合酶在核酸外切酶结构域中具有修饰，其中所述经修饰的DNA聚合酶与相应的天然存在的DNA聚合酶或“野生型”相比具有小于10%的核酸外切酶活性。在一个更优选的实施方案中，经修饰的￠29型DNA聚合酶与相应的天然存在的DNA聚合酶相比具有小于I %的核酸外切酶活性。在又一更优选实施方案中，经修饰的￠29型DNA聚合酶相对于相应的天然存在的DNA聚合酶缺乏可检测的核酸外切酶活性。在本发明用于复制、扩增或测序的方法的一个优选实施方案中，￠29型DNA聚合酶(天然的或在核酸外切酶结构域中被修饰的)的浓度为5nM-75nM。 在一个更优选实施方案中，￠29型DNA聚合酶(天然的或在核酸外切酶结构域中被修饰的)的浓度为25nM-60nM。在又一更优选实施方案中，$ 29型DNA聚合酶(天然的或在核酸外切酶结构域中被修饰的)的浓度为大约50nM。在本发明用于复制、扩增或测序的方法的一个优选实施方案中，聚氧乙烯化单月桂酸山梨坦(Tween 20)的浓度为总反应体积的0. 003% -0. 1%。在一个更优选实施方案中，聚氧乙烯化单月桂酸山梨坦的比例为总反应体积的0. 006% -0. 05%。在又一更优选实施方案中，聚氧乙烯化单月桂酸山梨坦的比例为总反应体积的0. 01% -0.03%。在又一更优选实施方案中，聚氧乙烯化单月桂酸山梨坦的比例为总反应体积的大约0. 025%。“总反应体积”应理解为将模板DNA加入到反应混合物中以后得到的体积。在本发明用于复制、扩增或测序的方法的一个优选实施方案中，铵盐选自硫酸铵、氯化铵或乙酸铵。在本发明用于复制、扩增或测序的方法的一个优选实施方案中，铵盐为硫酸铵。在一个更优选实施方案中，硫酸铵的浓度为30mM-60mM。在又一更优选实施方案中，硫酸铵的浓度为40mM-50mM。在又一更优选实施方案中，硫酸铵的浓度为大约45mM。在本发明用于复制、扩增或测序的方法的一个优选实施方案中，铵盐为氯化铵。在一个更优选实施方案中，氯化铵的浓度为60mM-120mM。在又一更优选实施方案中，氯化铵的浓度为80mM-100mM。在又一更优选实施方案中，氯化铵的浓度为大约90mM。在本发明用于复制、扩增或测序的方法的一个优选实施方案中，铵盐为乙酸铵。在一个更优选实施方案中，乙酸铵的浓度为60mM-120mM。在又一更优选实施方案中，乙酸铵的浓度为80mM-100mM。在又一更优选实施方案中，乙酸铵的浓度为大约90mM。在本发明用于复制、扩增或测序的方法的一个优选实施方案中，缓冲液的pH为7.0-8. 5。在一个更优选实施方案中，缓冲液的pH为7. 2-8。在又一更优选实施方案中，缓冲液的pH为大约7. 5。在本发明用于复制、扩增或测序的方法的一个优选实施方案中，缓冲液为tris-盐酸、tris-乙酸或HEPES。在本发明用于复制、扩增或测序的方法的一个更优选实施方案中，缓冲液tris-盐酸、tris-乙酸或HEPES的pH为7. 0-8. 5。在又一更优选实施方案中，缓冲液tris-盐酸、tris-乙酸或HEPES的pH为7. 2_8。在又一更优选实施方案中，缓冲液tris-盐酸、tris-乙酸或HEPES的pH为大约7. 5。在本发明用于复制、扩增或测序的方法该方面的一个优选实施方案中，缓冲液tris-盐酸、tris-乙酸或HEPES的浓度为25mM-50mM。在一个更优选实施方案中，缓冲液tris-盐酸、tris-乙酸或HEPES的浓度为30mM-45mM。在又一更优选实施方案中，缓冲液tris-盐酸、tris-乙酸或HEPES的浓度为大约40mM。在本发明用于复制、扩增或测序的方法的一个优选实施方案中，氯化钾或乙酸钾的浓度为30mM-70mM。在一个更优选实施方案中，氯化钾或乙酸钾的浓度为40mM-60mM。在又一更优选实施方案中，氯化钾或乙酸钾的浓度为大约50禮。在本发明用于复制、扩增或测序的方法的一个优选实施方案中，氯化镁的浓度为2mM-20mM。在一个更优选实施方案中，氯化镁的浓度为5mM-15mM。在又一更优选实施方案中，氯化镁为大约10mM。在本发明用于复制、扩增或测序的方法的一个优选实施方案中，聚氧乙烯化单月桂酸山梨坦的比例为总体积的0. 01 % -0. 03 %，硫酸铵的浓度为40mM-50mM，缓冲液tris-盐酸、tris-乙酸或HEPES的浓度为30mM-45mM和pH为7. 2-8. 0，氯化镁的浓度为5mM-15mM，且氯化钾或乙酸钾的浓度为40mM-60mM。 在本发明用于复制、扩增或测序的方法的一个优选实施方案中，聚氧乙烯化单月桂酸山梨坦的浓度为总体积的0. 025 %，硫酸铵的浓度为45mM，缓冲液tris_盐酸、tris_乙酸或HEPES的浓度为40mM和pH为7. 5，氯化镁的浓度为10禮，且氯化钾或乙酸钾的浓度为50mM。在本发明用于复制、扩增或测序的方法的一个优选实施方案中，聚氧乙烯化单月桂酸山梨坦的比例为总体积的0.01% -0. 03%，氯化铵的浓度为80mM-100mM，缓冲液tris-盐酸、tris-乙酸或HEPES的浓度为30mM-45mM和pH为7. 2-8. 0，氯化镁的浓度为5mM-15mM，且氯化钾或乙酸钾的浓度为40mM-60mM。在本发明用于复制、扩增或测序的方法的一个更优选实施方案中，聚氧乙烯化单月桂酸山梨坦的浓度为总体积的0. 025%，氯化铵的浓度为90mM，缓冲液tris-盐酸、tris-乙酸或HEPES的浓度为40mM和pH为7. 5，氯化镁的浓度为10mM，且氯化钾或乙酸钾的浓度为50mM。在本发明用于复制、扩增或测序的方法的一个优选实施方案中，聚氧乙烯化单月桂酸山梨坦的比例为总体积的0.01% -0. 03%,乙酸铵的浓度为80mM-100mM，缓冲液tris-盐酸、tris-乙酸或HEPES的浓度为30mM-45mM和pH为7. 2-8. 0，氯化镁的浓度为5mM-15mM，且氯化钾或乙酸钾的浓度为40mM-60mM。在本发明用于复制、扩增或测序的方法的一个更优选实施方案中，聚氧乙烯化单月桂酸山梨坦的浓度为总体积的0. 025%,乙酸铵的浓度为90mM，缓冲液tris-盐酸、tris-乙酸或HEPES的浓度为40mM和pH为7. 5，氯化镁的浓度为10mM，且氯化钾或乙酸钾的浓度为50mM。本说明书所用术语“复制”涉及从模板DNA合成互补DNA。本说明书所用术语“扩增”涉及增加模板DNA的拷贝数。本说明书所用术语“测序”涉及测定模板DNA核苷酸的顺序。“接触”应理解为这样的事实，即在引物延伸条件下孵育模板DNA与反应混合物。本文所用术语“引物”涉及当其在引物延伸条件下时能够作为DNA合成起点起作用的寡核苷酸。优选引物为脱氧核糖寡核苷酸。可通过任何合适的方法制备引物，所述方法包括例如但不限于直接化学合成。可将引物设计为与模板DNA的特定脱氧核苷酸序列杂交(特异性引物)，或可随机合成(随意引物)。本说明书所用术语“特异性引物”涉及其序列与待扩增的模板DNA的特定脱氧核苷酸序列互 补的引物。“互补”应理解为这样的事实，即引物可与模板DNA的区域杂交，使得当其在引物延伸条件下时可作为DNA合成起点起作用。优选该区域与模板DNA的区域具有100%互补性。换言之，与引物互补的区域中的各核苷酸可与单链模板中存在的核苷酸形成氢键。然而，具有本领域一般知识的人员将会承认，含相对于模板DNA具有小于100%互补性的区域的引物可发挥作用以实施本发明用于复制、扩增或测序的方法。术语“随意引物”涉及其序列随机合成并用于在模板DNA的随机位置起始DNA合成的引物。通常，在本发明用于复制、扩增或测序的方法中，使用一组随意引物。术语“随意引物”涉及具有随机序列并用于在模板DNA的随机位置起始DNA合成的一系列引物。在本发明用于复制、扩增或测序的方法的一个优选实施方案中，引物为特异性的。在本发明用于复制、扩增或测序的方法的另一优选实施方案中，引物为随意的。优选随意引物受到保护免受3' -5'核酸外切酶的作用。且更优选随意引物为6个核苷酸的寡核苷酸、“六核苷酸”或“六聚物”，其受到保护免受3' -5'核酸外切酶的作用。本说明书所用表述“受到保护免受核酸外切酶的作用”涉及经修饰的引物，使得其抵抗DNA聚合酶中存在的任何3' -5'核酸外切酶活性的核酸降解。在本发明用于复制、扩增或测序的方法中，可使用不止一种引物，能使用特异性引物和/或随意引物。在本发明用于复制、扩增或测序的方法的一个优选实施方案中，引物的浓度为2 u M-100 u M0在一个更优选实施方案中，引物为的浓度20 yM-80 PM。在又一更优选实施方案中，引物的浓度为40 u M-60 u M0在又一更优选实施方案中，引物的浓度为大约50 u M。本说明书所用术语“核苷三磷酸”涉及由戊糖、氮碱基和三个磷酸基团的共价键形成的有机分子。术语核苷三磷酸包括脱氧核苷三磷酸(dNTP)，例如但不限于dATP、dCTP、dITP、dUTP、dGTP、dTTP或其衍生物。优选脱氧核苷三磷酸为dATP、dITP、dGTP和dCTP。甚至更优选这四种dNTP处于等摩尔条件。在本发明该方面的一个优选实施方案中，脱氧核苷三磷酸的浓度为100 ii M-800 ii M。在一个更优选实施方案中，脱氧核苷三磷酸的浓度为200 u M-600 u M0在又一更优选实施方案中，脱氧核苷三磷酸的浓度为大约500 u M。 术语核苷三磷酸亦包括双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)，例如但不限于ddATP、ddCTP、ddlTP、ddUTP、ddGTP、ddTTP 或其衍生物。在本发明用于复制、扩增或测序的方法的一些优选实施方案中，通过本领域现状中熟知的技术标记至少一种核苷三磷酸或一种引物。被标记的核苷酸可为例如脱氧核苷三磷酸或双脱氧核苷三磷酸。可检测的标记包括例如放射性同位素、荧光标记、化学发光标记、生物发光标记或酶标记。本说明书所用术语“模板DNA”涉及可作为用于合成互补DNA链的底物的DNA分子；即其涉及待复制、扩增或测序的DNA分子。在一个优选实施方案中，模板DNA为质粒DNA。在另一优选实施方案中，模板DNA为基因组DNA。在引物延伸条件下实施模板DNA的复制、扩增或测序。表述“引物延伸条件”指其中可发生在引物中起始的依赖模板DNA的合成的条件。按照本发明用于复制、扩增或测序的方法，可通过热循环过程或在基本上恒温下发生模板DNA合成。“等温条件”应理解为基本上恒温。按照本发明用于复制、扩增或测序的方法，优选模板DNA合成在基本上恒温下发生。更优选基本上恒温为25-40°C，甚至更优选为大约30。。。允许DNA扩增的大量方法在本领域现状中众所周知。一些方法需要热循环过程，例如但不限于聚合酶链式反应(PCR)。其它方法不需要热循环过程，而是在基本上恒温下进行，例如但不限于滚环式扩增(RCA)、多重置换扩增(m ultiple detachmentamplification,MDA)、链置换扩增(SDA)或环介导扩增(LAMP)。按照本发明方法可通过热循环过程或在基本上恒温下发生模板DNA扩增。按照本发明扩增方法，优选通过滚环式扩增(RCA)、通过多重置换扩增(MDA)、链置换扩增(SDA)或环介导扩增(LAMPA)来进行模板DNA的扩增。本发明另一方面涉及一种包括适于实施本发明用于复制、扩增或测序的方法的组成部分的试剂盒或装置。本发明另一方面涉及一种用于实施本发明用于复制、扩增或测序的方法的试剂盒，所述试剂盒包括a) 29 型 DNA 聚合酶；b)聚氧乙烯化单月桂酸山梨坦；c)铵盐；d)缓冲液；和e)氯化镁。优选所述铵盐选自硫酸铵、氯化铵或乙酸铵。在本发明该方面的一个优选实施方案中，试剂盒还包括钾盐。优选所述钾盐为氯化钾或乙酸钾。在本发明该方面一个优选实施方案中，试剂盒还包括引物。在一个更优选实施方案中，引物为受到保护免受3' -5'核酸外切酶作用的随意引物。在本发明该方面一个优选实施方案中，试剂盒还包括核苷三磷酸。例如，在本发明该方面一个更优选实施方案中，试剂盒还包括脱氧核苷三磷酸和/或双脱氧核苷三磷酸。在本发明该方面一个优选实施方案中，试剂盒包括至少一种核苷三磷酸或一种标记引物。标记的核苷可为例如脱氧核苷三磷酸或双脱氧核苷三磷酸。试剂盒还可包括但不限于任何形式的缓冲液、防止污染的试剂等。在另一方面，试剂盒可包括用于将其付诸实施及用于其优化所需的所有支持物和容器。优选试剂盒还包括用于实施本发明方法的说明书。贯穿本说明书和权利要求书的术语"包含"及其变体不排除其它技术特征、添加齐U、组分或步骤。对于本领域技术人员而言，可部分地从本说明书和部分地从本发明的实施推知其它目的、优势及特征。通过举例说明提供以下附图及实施例，其不限制本发明。


图I显示Tween 20和(MM)2SO4在小29DNA聚合酶扩增能力方面的作用。如主要的正文所述在所示量的质粒DNA(4. 2kpb)存在下实施测定。在30°C孵育5小时后，如主要的正文所述分析反应物。左边为用作DNA长度标记的在用HindIII消化Φ29 ΝΑ后获得的线性DNA片段。图2显示Φ29 ΝΑ聚合酶在Tween 20和(MM)2SO4存在下对不同量的质粒DNA (飞克数量级)的扩增。如主要的正文所述在O. 025%1'硏^11 20和451111(见14)2304存在下实施测定。DNA长度标记与图I中所用相同。图3显示NH4+离子在Φ29 ΝΑ聚合酶扩增能力方面的作用。如主要的正文所述在O. 025% Tween 20和所示铵盐以及所示量的质粒DNA(4. 2kpb)存在下实施测定。在30°C孵育6小时后，如主要的正文所述分析反应物。DNA长度标记与图I中所用相同。图4显示Φ29 ΝΑ聚合酶在Tween 20和(MM)2SO4存在下对不同量枯草芽孢杆菌基因组DNA的扩增。如主要的正文所述在O. 025% Tween 20和45mM(MM)2SO4存在下实施测定。DNA长度标记与图I中所用相同。 图5显示通过将O. 025 % Tween 20和45mM (NH4) 2S04加入到用于基于029 DNA聚合酶的DNA扩增的商业试剂盒(General Electrics HealthCare的Illustra试剂盒)的目前反应缓冲液中所表示的显著改进。如主要的正文所述实施测定。DNA长度标记与图I中所用相同。实施例用于Φ 29DNA聚合酶扩增多引物DNA的实骀备件的优化本专利文件中提供的以下具体实施例起阐明本发明特性的作用。包括这些实施例仅为了阐明目的，不必理解为对本文主张的本发明的限制。因此，下述实施例阐明本发明而不限制其应用领域。业已显示Φ 29DNA聚合酶从几皮克环状DNA开始扩增IO4-IO6倍。为此目的，使用含有40mM tris-HCl (pH 7. 5)、50mM KCl和IOmM MgCl2 (下文称为缓冲液A)的反应缓冲液。在测试不同去污剂和盐条件对Φ29 ΝΑ聚合酶的DNA扩增能力的影响后，发现将O. 025%Tween 20和45mM(NH4) 2S04同时加入到缓冲液A中，大大改善所提供的有限量的DNA的扩
士豳
>曰ο用于扩增质粒DNA的反应条件。-孵育混合物含有12. 5μ I缓冲液Α、50μΜ受保护免受3' -5'核酸外切酶作用的六聚物、500 μ M的各脱氧核苷三磷酸(dCTP、dGTP、dTTP和dATP)、所示量的质粒DNA (大小为4. 2kbp)，并按所示加入45mM (NH4) 2S04或O. 025 %Tween 20或二者的组合。通过在95°C孵育3分钟和随后在冰中冷却5分钟，使DNA变性。加入50ηΜΦ29 ΝΑ聚合酶后起始反应，通过加热到65°C持续10分钟在30°C孵育后终止反应。为了分析结果，从反应物中取出1μ I样品，用EcoRI限制性核酸内切酶消化扩增的DNA，并在O. 7%琼脂糖凝胶中电泳。通过用溴化乙锭对凝胶染色来检测DNA。用于扩增基因组DNA的反应条件。-孵育混合物含有12.5μ I缓冲液Α、45mM(NH4)2SO4^O. 025% Tween 20、50 μ M受保护免受:V 核酸外切酶作用的六聚物、500 μ M各脱氧核苷三磷酸(dCTP、dGTP、dTTP和dATP)和所示量的枯草芽孢杆菌基因组DNA(大小为4Mpb)。通过在95°C孵育3分钟和随后在冰中冷却5分钟来使DNA变性。加入50ηΜ Φ29 ΝΑ聚合酶后起始反应，通过加热到65°C持续10分钟在30°C孵育后终止反应。为了分析结果，从反应物中取出I μ I样品，并在O. 7%琼脂糖凝胶中电泳。通过用溴化乙锭对凝胶染色来检测DNA。图I显示加入45mM(NH4)2SOJP O. 025% Tween 20在扩增所提供的少量质粒DNA中的作用。如所示，当使用IOOfg所提供的DNA时，Φ 29DNA聚合酶用标准缓冲液A未产生可检测的任何扩增产物。在这些反应条件中，在不存在DNA时加入O. 025 % Tween 20导致出现痕量DNA产物，大部分可能是由于随机六聚物引物的杂交和延伸引起的非特异性DNA扩增。用IOfg所提供的DNA观察到同样的痕量。然而，在IOOfg所提供的DNA存在下，力口入O. 025% Tween 20使得Φ 29DNA聚合酶能够产生可检测量的扩增的质粒。特异性或非特异性扩增的DNA的总产量表明，将O. 025% Tween 20加入到缓冲液A中促进了 Φ 29DNA聚合酶的扩增能力。用NP40去污剂观察到相似的作用。相反，所分析的其它去污剂例如Triton XlOO和Triton X114未促进Φ 29DNA聚合酶的扩增能力(未显示)。将O. 025%Tween 20和45mM(NH4)2S04同时加入到缓冲液A中，在扩增产物的产量及特异性方面具有两种结果1)在不存在所提供的DNA时检测不到DNA扩增；2)即使在所提供的DNA量低至IOfg时，通过扩增也获得若干Ug的单位长度的质粒DNA。作为对照，将45mM(NH4)2SO4W入到缓冲液A中对Φ 29DNA聚合酶扩增能力不产生任何改进。
因此，可得出的结论是，将O. 025% Tween. 20和45mM(NH4)2S04同时加入到缓冲液A中(下文称为缓冲液B)对于实施Φ29 ΝΑ聚合酶对环状DNA的多重引发扩增的实验条件产生明显优化，二者皆为扩增所提供的有限量(IOfg)的DNA所绝对必需的试剂。事实上，如图2所见，使用缓冲液B使得Φ 29DNA聚合酶能够用低至O. Ifg(约24个分子)的所提供的质粒量在6小时反应后合成微克DNA。作为质量控制，用EcoRI消化扩增产物产生了4. 2kb的线性dsDNA片段，这表明扩增产物确实是原始质粒的串联重复。此外，缓冲液B亦防止非特异性DNA扩增(参见图2中对应于未提供DNA所实施的反应的泳道)。图3显示铵离子和O. 025 % Tween 20在改进扩增少量质粒DNA方面的作用。在O. 025% Tween 20和所示铵盐存在下在先前所述条件中实施测定。如图3可观察到的，NH4Cl和NH4CH3COO 二者都在扩增产物的产量和特异性方面具有与(NH4) 2S04相似的作用。该结果表明，前述(NH4)2SO4在扩增有限量质粒DNA中的作用是由于NH4+离子。 为了测定上述优化条件是否亦适用于扩增基因组DNA，在有限浓度的枯草芽孢杆菌基因组DNA(长4Mpb)存在下，进行了所实施的同样类型的测定。如图4所示，在缓冲液B中存在O. 025% Tween 20和45mM (NH4)2SO4, —方面防止非特异性DNA扩增(无所提供的DNA的泳道)，另一方面使得Φ 29DNA聚合酶能够产生可检测的和特异性的基因组DNA扩增，即使在使用IOfg所提供的DNA时，即相比目前商业基因组扩增试剂盒所推荐的量降低至 1/106。为了测定同时加入O. 025% Tween 20和45mM(NH4)2SO4是否提高用于基于029DNA聚合酶的DNA扩增的目前商业试剂盒的扩增效率，进行了如图1、2和3所述相同类型的质粒DNA扩增测定。图5显示通过将O. 025% Tween 20和45mM(NH4)2S04加入到Illustra试剂盒(GE Healthcare)的目前反应缓冲液中所表示的显著改进。如可观察到的，根据供应商的推荐，用Illustra试剂盒只有在所提供的质粒量等于或大于IOpg时，才可以以在琼脂糖凝胶中可检测的方式扩增。与此相反，将O. 025% Tween 20和45mM(NH4)2SO4同时加入到Illustra试剂盒的反应缓冲液中，显著降低所需的可扩增的DNA的量，从所提供的Ifg质粒DNA可观察到扩增产物，这涉及扩增的四个数量级的提高。
权利要求
1.用于对模板DNA进行复制、扩增或测序的方法，所述方法包括使所述DNA与包含至少以下的反应混合物接触 a)Φ 29型DNA聚合酶； b)聚氧こ烯化单月桂酸山梨坦； c)铵盐； d)缓冲液； e)氯化镁； f)引物；和 g)核苷三磷酸。
2.权利要求I的方法，其中所述反应混合物还包含钾盐。
3.权利要求2的方法，其中所述钾盐为氯化钾或こ酸钾。
4.权利要求1-3中任ー项的方法，其中所述聚氧こ烯化单月桂酸山梨坦的比例为总反应体积的O. 003% -O. 1%ο
5.权利要求4的方法，其中所述聚氧こ烯化单月桂酸山梨坦的比例为总反应体积的O. 006% -O. 05%。
6.权利要求5的方法，其中所述聚氧こ烯化单月桂酸山梨坦的比例为总反应体积的O. 01% -O. 03% ο
7.权利要求1-6中任ー项的方法，其中所述铵盐选自硫酸铵、氯化铵或こ酸铵。
8.权利要求7的方法，其中所述铵盐为硫酸铵。
9.权利要求8的方法，其中所述硫酸铵的浓度为30mM-60mM。
10.权利要求9的方法，其中所述硫酸铵的浓度为40mM-50mM。
11.权利要求7的方法，其中所述铵盐为氯化铵或こ酸铵。
12.权利要求11的方法，其中所述氯化铵或こ酸铵的浓度为60mM-120mM。
13.权利要求12的方法，其中所述氯化铵或こ酸铵的浓度为80mM-100mM。
14.权利要求1-13中任ー项的方法,其中所述Φ29型DNA聚合酶选自分离自以下卩遼菌体的 DNA 聚合酶Φ 29、Cp-1、PRD-1、Φ 15、Φ 21、PZE、PZA、Nf、M2Y、B103、GA-1、SF5、Cp_5、Cp-7、PR4、PR5、PR722、L17 或 ABV。
15.权利要求14的方法，其中所述Φ29型DNA聚合酶具有与SEQ ID NO :1具有至少80%同一性的氨基酸序列。
16.权利要求15的方法，其中所述Φ29型DNA聚合酶具有与SEQID NO 1具有至少90%同一性的氨基酸序列。
17.权利要求16的方法，其中所述Φ29型DNA聚合酶具有氨基酸序列SEQ ID NO :1。
18.权利要求1-16中任ー项的方法，其中所述Φ29型DNA聚合酶在核酸外切酶结构域中具有修饰，其中所述经修饰的DNA聚合酶与相应的天然存在的DNA聚合酶相比具有小于10%的核酸外切酶活性。
19.权利要求18的方法，其中所述经修饰的Φ29型DNA聚合酶与相应的天然存在的DNA聚合酶相比具有小于1%的核酸外切酶活性。
20.权利要求19的方法，其中所述经修饰的Φ29型DNA聚合酶相对于相应的天然存在的DNA聚合酶缺乏可检测的核酸外切酶活性。
21.权利要求1-20中任ー项的方法，其中所述缓冲液为tris-盐酸、tris-こ酸或HEPES。
22.权利要求1-21中任ー项的方法，其中所述缓冲液的pH为7-8.5。
23.权利要求1-22中任ー项的方法，其中所述氯化镁的浓度为2mM-20mM。
24.权利要求23的方法，其中所述氯化镁的浓度为5mM-15mM。
25.权利要求2-24中任ー项的方法，其中所述氯化钾或こ酸钾的浓度为30mM-70mM。
26.权利要求25的方法，其中所述氯化钾或こ酸钾的浓度为40mM-60mM。
27.权利要求1-26中任ー项的方法，其中所述核苷三磷酸为dCTP、dGTP、dTTP和dATP。
28.权利要求27的方法，其中所述dCTP、dGTP、dTTP和dATP核苷三磷酸为等摩尔量。
29.权利要求1-28中任ー项的方法，其中所述引物为随意的，并受到保护免受核酸外切酶的作用。
30.权利要求1-29中任ー项的方法，其中所述模板DNA为质粒DNA。
31.权利要求1-29中任ー项的方法，其中所述模板DNA为基因组DNA。
32.权利要求1-31中任ー项的方法，其中所述扩增在25-40°C的基本上恒温下进行。
33.权利要求1-32中任ー项的用于扩增模板DNA的方法，其中所述扩增通过滚环式扩增(RCA)、多重置换扩增(MDA)、链置换扩增(SDA)或环介导扩增(LAMPA)进行。
34.权利要求1-33中任ー项的方法，其中至少ー种核苷三磷酸或一种引物被标记。
35.用于实施权利要求1-34的方法的试剂盒，所述试剂盒包括 a)Φ 29型DNA聚合酶； b)聚氧こ烯化单月桂酸山梨坦； c)铵盐； d)缓冲液；和 e)氯化镁。
36.权利要求35的试剂盒，所述试剂盒还包括钾盐。
37.权利要求35或36的试剂盒，所述试剂盒还包括引物。
38.权利要求35-37中任ー项的试剂盒，所述试剂盒还包括权利要求29的引物。
39.权利要求35-38中任ー项的试剂盒，所述试剂盒还包括核苷三磷酸。
40.权利要求37-39的试剂盒，其中至少ー种核苷三磷酸或一种引物被标记。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种使用φ29DNA聚合酶对脱氧核糖核酸进行复制、扩增或测序的方法。依据所述方法，将所述聚合酶在尤其包含以下组分的反应混合物中孵育浓度为0.003-0.01％的聚氧乙烯化单月桂酸山梨坦，以及可为30-60mM硫酸铵、60-120mM氯化铵或乙酸铵的铵盐。本发明还涉及一种用于实施所述方法的试剂盒。
文档编号C12Q1/68GK102648289SQ201080039738
公开日2012年8月22日 申请日期2010年7月2日 优先权日2009年7月2日
发明者J·M·拉扎罗博罗斯, L·布兰科达维拉, M·德贝加霍斯, M·萨拉斯法尔盖拉斯, M·门西亚卡瓦列罗 申请人:康斯乔最高科学研究公司