专利名称：脂肪酶粉末制剂及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及可适用于各种酯化反应、酯交换反应等的脂肪酶粉末制剂，以及使用这些粉末制剂的酯交换方法等。
背景技术：
脂肪酶可广泛应用于脂肪酸等各种羧酸与一元醇或多元醇等醇类发生的酯化反应、多种羧酸酯间的酯交换反应等。其中，从动植物油脂类的改性，到作为各种脂肪酸的酯、糖酯或留醇酯的制造方法，酯交换反应均是一项重要的技术。在使用作为油脂水解酶的脂肪酶作为这些反应的催化剂时，能够在从室温到70°C左右的温和条件下进行酯交换反应，与常规的化学反应相比，不仅能够抑制副反应和降低能耗，并且由于用作催化剂的脂肪酶是天然物质，因此安全性高。另外，根据其基质特异性和位置特异性，能够以良好的效率生产目的物。但是，即使将粉末脂肪酶直接用于酯交换反应，不仅不能充分发挥其活性，而且原本为水溶性的脂肪酶难以均勻地分散在油性原料中，也难以将其回收。因此，通常将脂肪酶固定在某些载体上之后，再用于酯化或酯交换反应等，所述载体例如阴离子交换树脂(专利文献1)、酚吸附树脂(专利文献2、、疏水性载体(专利文献3)、阳离子交换树脂(专利文献4)、螯合树脂(专利文献幻等。并且，还提出了一种固定化的脂肪酶颗粒的制造方法，所述方法通过制造使溶解了脂肪酶和起到脂肪酶载体作用的物质的水相分散在疏水相中的乳液，然后从该乳液中除去水，使水相变成以脂肪酶包覆的固体颗粒(专利文献6)。由此，虽然通常将脂肪酶固定化之后用于酯交换反应，但这样的固定化脂肪酶不仅会由于固定化处理而损失本来的脂肪酶活性，而且在使用多孔性载体的情况下原料和生成物会填进小孔中，结果导致酯交换率低。并且，在使用常规的固定化脂肪酶的酯交换反应中，载体中保留的水分会带入反应体系中，因此难以避免发生副反应，例如在油脂类的酯交换反应中生成二酸甘油酯或单酸甘油酯。鉴于上述情况，目前正在开发使用粉末脂肪酶的各种技术。例如，提出了一种方法，在存在或不存在惰性有机溶剂的条件下，将粉末脂肪酶分散在含酯的原料中来进行酯交换反应，并且保证在进行酯交换反应时分散的脂肪酶粉末颗粒的90%以上保持1-100 μ m的范围内的粒径(专利文献7)。另外，还提出了使用将含有磷脂质和脂溶性维生素的酶溶液干燥而得到的酶粉末(专利文献8)。但是，目前仍希望获得进一步提高脂肪酶活性的粉末脂肪酶。—方面，提出了一种酶固定制剂的制造方法，其特征在于，向含酶溶液中加入谷物粉或谷物粉和糖类，然后使该含酶溶液干燥(专利文献9)。这里，能够使用的酶可举出脂肪酶、纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶和果胶酶，通过这样的制造方法得到的酶固定制剂，虽然能够在酶活性低的物质的存在下抑制酶的失活，但是没有记载酶活性获得了提高。另外，在这里，实际制造的产品仅有对纤维素酶或蛋白酶适用脂肪含量少的脱脂大豆粉的例子，没有具体记载使用脂肪酶的例子。
在这样的情况下，提出了一种脂肪酶粉末制剂和使用喷雾干燥的制造方法，其特征在于，所述脂肪酶粉末制剂为含有来自米根霉(Miizopus oryzae)和/或来自戴尔根霉(Rhizopus delemar)的脂肪酶与脂肪含量为5质量％以上的大豆粉末的造粒物(专利文献10)，公开了其得到了脂肪酶活性显著提高的脂肪酶粉末制剂。现有技术文献专利文献专利文献1:专利文献2:专利文献3:专利文献4:专利文献5:专利文献6:专利文献7:专利文献8:专利文献9:专利文献10
日本专利申请特开昭60-98984号公报日本专利申请特开昭61-2(^688号公报日本专利申请特开平2-138986号公报日本专利申请特开平3-61485号公报日本专利申请特开平H62795号公报日本专利特许第3403202号公报日本专利特许第沈68187号公报日本专利申请特开2000-106873号公报日本专利申请特开平1H46893号公报日本专利申请特开2008-54448号公报
发明内容
本发明的目的是，提供脂肪酶活性提高的脂肪酶粉末制剂。本发明的目的还有，提供使用上述脂肪酶粉末制剂的酯交换方法和酯化方法。在努力研究了构成脂肪酶粉末制剂的颗粒的物理特性与其脂肪酶活性的关系之后，本发明人发现，颗粒表面存在的小孔的数量与脂肪酶活性存在很大的关系，根据该发现完成了本发明。S卩，本发明提供了一种脂肪酶粉末制剂，其特征在于，构成脂肪酶粉末制剂的颗粒的表面上具有直径为0. 5-6 μ m的小孔3000-40000个/mm2。本发明还提供了上述脂肪酶粉末制剂的制造方法，其特征在于，将含脂肪酶的水性液体在喷雾干燥机的送风温度为40°C以上、且小于70°C的条件下进行喷雾干燥，由此制造所述脂肪酶粉末制剂。本发明还提供了酯合成物的制造方法，其特征在于，使用上述脂肪酶粉末制剂进行酯交换或酯化。发明的效果通过本发明，提供了一种能够高效进行酯交换反应或酯化反应并且酶活性显著提高的脂肪酶粉末制剂。特别地，通过本发明，由于能够提供脂肪酶自身的酶活性显著提高的脂肪酶粉末制剂，因此能够减少酯交换反应或酯化反应的脂肪酶粉末制剂的用量，或者能够大幅缩短反应时间，能够安全且低成本地制造食品或食品添加剂。
图1示出了构成在送风温度为50°C的条件下进行喷雾干燥得到的脂肪粉末制剂的脂肪酶颗粒的2000倍电子显微镜照片。图2示出了构成在送风温度为110°C的条件下进行喷雾干燥得到的脂肪粉末制剂的脂肪酶颗粒的2000倍电子显微镜照片。
具体实施例方式在本发明中，可以使用各种脂肪酶，但优选根霉属的戴尔根霉和米根霉，特别优选1，3_特异性脂肪酶。其中，特别优选米根霉。作为这样的脂肪酶，可举出Robin ( 口匕‘ > )公司的商品=Piccantase (匕。力 > 夕一S )R8000和天野酶制品公司的商品脂肪酶F-AP15等，但最合适的脂肪酶可举出来自米根霉的天野酶制品公司的商品脂肪酶DF “Amano”15-K(也称为脂肪酶D)和脂肪酶D “Amano”浓缩物(U "—七D “ 7 " 7 ” ^ >夕)。这些商品为粉末脂肪酶。并且，所述脂肪酶DF "Amano" 15-K之前是来自戴尔根霉的标记。在本发明中使用的脂肪酶，可以是将含有脂肪酶培养基成分等的含脂肪酶的水溶液干燥得到的，但是优选不含有脂肪酶培养基成分等的脂肪酶，即实质上由脂肪酶本身构成的脂肪酶。本发明的脂肪酶粉末制剂优选通过将使脂肪酶与谷物粉末和/或糖类粉末一并溶解和/或分散所得的含脂肪酶的水性液体进行喷雾干燥来制得。含脂肪酶的水性液体中的水的质量相对于脂肪酶的质量进行调整。具体而言，相对于脂肪酶的质量，水的质量优选为2. 0-1000倍，更优选为2. 0-500倍，最优选3. 0-100倍。这里使用的含脂肪酶的水性液体可举出除去菌体的脂肪酶培养液、精制培养液、将由这些培养液得到的脂肪酶再次溶解、分散在水中得到的水性液体、市售的液状脂肪酶等。并且，为了进一步提高脂肪酶的活性，更优选除去了盐类等小分子成分的水性液体，另外，为了进一步提高粉末性状，更优选除去了糖等小分子成分的水性液体。在脂肪酶的培养过程中，作为脂肪酶培养液，可使用含有大豆粉、蛋白胨、玉米浆、K2HPO4, (NH4)2S04、MgSO4 ·7Η20等的水溶液进行培养。这些成分的浓度大豆粉为0. 1-20质量％，优选1. 0-10质量％ ；蛋白胨为0. 1-30质量％，优选0. 5-10质量％ ；玉米浆为0. 1-30质量％，优选0. 5-10质量％求2朋04为0.01-20质量％，优选0. 1-5质量％ ； (NH4)2SO4为0. 01-20 质量 ％，优选 0. 05-5 质量 ％ ；MgSO4 · 7Η20 为 0. 01-20 质量 ％，优选 0. 05-5 质量％。培养条件可控制为培养温度为10-40°C，优选20-35°C，；通气量为0. 1-2.0VVM，优选 0. 1-1. 5VVM ；搅拌转数为 100_800rpm，优选 200-400rpm, pH 为 3. 0-10. 0，优选 4. 0-9. 5。脂肪酶培养后的菌体分离优选通过离心分离、膜过滤等进行。另外，盐类和糖等小分子成分的去除可通过UF膜处理进行。具体而言，进行UF膜处理，将含脂肪酶的水溶液浓缩到1/2的体积之后，添加与浓缩液等量的磷酸缓冲液，将上述操作重复1-5次，可获得除去了小分子成分的含脂肪酶的水溶液。离心分离优选控制在200-20000Xg的条件下进行，膜过滤时优选将在MF膜、压滤器等中的压力控制在3.0kg/m2以下。若为菌体内酶，则优选通过均化机、高速组织捣碎机(Waring blender)、超声波破碎、高压细胞破碎仪(French press)、球磨机等进行细胞破碎，然后通过离心分离、膜过滤等除去细胞残余物。均化机的搅拌转数为500-30000rpm，优选1000-15000rpm ；高速组织捣碎机的转数为500-10000rpm，优选1000-5000rpm。搅拌时间为0. 5-10分钟，优选1-5分钟。超声波破碎可以在l_50kHz、优选10_20kHz的条件下进行。球磨机可以使用直径0. 1-0. 5mm左右的玻璃球。也可以在干燥步骤之前的中间步骤中浓缩含脂肪酶的水溶液。对浓缩方法没有特别的限定，可举出蒸发器、闪蒸器、UF膜浓缩、MF膜浓缩、使用无机盐类的盐析、使用溶剂的沉淀法、使用离子交换纤维等的吸附法、使用吸水性凝胶的吸水法等。优选的是UF膜浓缩、蒸发器。UF膜浓缩用组件优选截留分子量为3000-100000、优选6000-50000的平板膜或中空纤维膜，材质优选为聚丙烯腈系、聚砜系等。本发明中使用的脂肪酶如上所述，优选除去在菌体和脂肪酶培养液中包含的成分。所述脂肪酶与谷物粉末和/或糖类粉末一并在水中混合，然后通过喷雾干燥进行干燥。对混合的顺序没有特别的限定，但优选先将脂肪酶溶解在水中，然后将谷物粉末和/或糖类粉末分散在得到的水溶液中。另外，谷物粉末、糖类粉末优选为全脂大豆粉末、脱脂大豆粉末等大豆粉末、小麦粉、米粉、糊精等。通过喷雾干燥将含脂肪酶的水性液体干燥的方法例如有使用喷嘴对流式、圆盘对流式、喷嘴并流式、圆盘并流式等喷雾干燥机的方法。在这种情况下，优选将含有脂肪酶和大豆粉末的含脂肪酶的水性液体的温度调整为20-40°C，然后进行喷雾干燥处理(干燥气氛中喷雾)。送风(干燥气氛)的温度为40°C以上、且小于70°C，优选为40-65°C，更优选在40-60°C的送风温度下进行喷雾。另外，优选在干燥前，预先将含脂肪酶的水性液体的PH调整为7. 5-8. 5。脂肪酶对温度敏感，在低温下可抑制酶活性的下降。但是，在本发明中，相较于16-30°C的低温区的送风温度，送风温度在40°C以上、且小于70°C的范围时酶活性更高，因此是优选的。在本发明中，通过上述方法，得到了由颗粒构成的脂肪酶粉末制剂，所述颗粒的表面上具有直径0.5-6 μ m的小孔3000-40000个/mm2。其中，优选在其表面上具有直径0. 5-6 μ m的小孔3000-20000个/mm2，进一步优选3000-10000个/mm2。颗粒表面的小孔数量可以用电子显微镜容易地测得。此时，优选得到水分含量为10质量％以下、特别优选1-8质量％的脂肪酶粉末制剂。本发明的脂肪酶粉末制剂的粒径可为任意的，但优选脂肪酶粉末制剂的90质量％以上的粒径为1_150μπι。平均粒径优选为10-80μπι。另外，脂肪酶粉末制剂的形状优选为球状。脂肪酶粉末制剂的粒径例如可使用堀场(HORIBA)公司的粒度分布测定装置(LA-500)进行测定。接下来，对使用本发明的脂肪酶粉末制剂进行酯交换反应或酯化反应从而得到酯交换产物或酯化物的制造方法进行说明。使用本发明的脂肪酶粉末制剂进行的酯交换反应，为选自脂肪酸酯、脂肪酸和醇中的一种以上的物质与脂肪酸酯之间的酯交换反应，例如可举出通过常规方法进行的油脂与油脂之间的酯交换反应、油脂与脂肪酸酯之间的酯交换反应、醇解或酸解的酯交换反应。另外，使用本发明的脂肪酶粉末制剂进行的酯化反应，为脂肪酸的部分酯与脂肪酸之间的酯化反应，或者为一元或多元醇与脂肪酸之间的酯化反应，例如，可举出甘油与脂肪酸之间的酯化反应等。更详细而言，作为油脂与油脂之间的酯交换反应，例如能够进行菜籽油(长链脂肪酸的三酸甘油酯)与三辛酸甘油酯(植物来源的中链脂肪酸的三酸甘油酯)之间的酯交换反应，能够制造长链和中链混合的三酸甘油酯。另外，作为使用油脂与脂肪酸的酸解的酯交换反应，可大量利用脂肪酶中的1，3-特异性脂肪酶制造构造油脂。该反应是在甘油骨架的2位上保留特定的脂肪酸，而将1、3位的脂肪酸置换成目的脂肪酸。得到的产物可在巧克力等使用的油脂中利用，另外也可以用作具有特定的营养效果的油脂。对于使用本发明的脂肪酶粉末制剂进行酯交换反应或酯化反应的条件没有特别的限定，可使用常规方法进行。一般而言，在避免会导致加水分解的水分混入的同时，在常压或减压下进行。反应温度虽然也取决于使用的油脂等原料以及原料混合物的凝固点，但优选在20-80°C左右下进行，若不受凝固点的限制，则更优选在40-60 V下进行。另外，脂肪酶粉末制剂的向反应原料中的添加量优选为0.05-10质量％，更优选为0.05-5质量％。最合适的量根据反应温度、设定的反应时间、得到的脂肪酶粉末制剂的活性等进行确定。反应结束后，脂肪酶粉末制剂通过过滤、离心分离等除去，可重复使用(稳定性的评价)直到活性下降到无法制造的程度。因此，通常希望能够以尽可能少量的昂贵的脂肪酶对脂肪酶粉末制剂同时赋予高活性和高稳定性，通过使用本发明的脂肪酶粉末制剂实现了这一点。由此得到的酯交换产物或酯化物没有特别的限定，可用作食品领域使用的酯交换油脂或酯化油脂。实施例实施例1天野酶制品公司的商品将商品脂肪酶D "Amano“浓缩物，批号LDD0252201溶解到水中，以形成33600U/ml的酶溶液，边搅拌边向其中加入3倍量的脱臭全脂大豆粉末(脂肪含量为23质量％，商品名AlphaPlUS HS-600，日清奥利友集团制)的10%悬浊液，并用0. 5N的NaOH溶液将pH调整至7. 8，得到含脂肪酶的水性液体。将该含脂肪酶的水性液体导入低温喷雾干燥装置中，在改变不同的送风温度的条件下，进行喷雾干燥。得到的脂肪酶粉末制剂的活性用以下方法测定。脂肪酶活件的测定方法向以1 1的比例混合1，2，3_三油酸甘油酯与1，2，3_三辛酸甘油酯得到的油中添加脂肪酶粉末制剂，使其在60°C下发生反应，在一段时间后进行10 μ 1的取样，用1. 5ml的己烷稀释后，将滤掉脂肪酶粉末制剂的溶液作为气相色谱(GC)样品。用GC(柱DB-Iht)进行分析，通过下式求得反应率。GC的条件为柱温150°C，升温15°C /分钟，最终温度370 "C。反应率(％) = [C34area/ (C24area+C34area) ] X 100式中，CM表示1，2，3-三辛酸甘油酯、C34表示1，2，3_三辛酸甘油酯中的一个脂肪酸被置换成油酸之后的物质，area为它们的区域面积。根据各个时间的反应率，通过分析软件(origin ver. 6. 1)求得了反应速率常数k的值。脂肪酶粉末制剂的活性以送风温度设定为110°C时制造的脂肪酶粉末制剂的活性为100，表示各个温度的相对活性。结果总结在表1中。表1喷雾干燥时的送风温度和脂肪酶的相对活性
权利要求
1.一种脂肪酶粉末制剂，其特征在于，构成所述脂肪酶粉末制剂的颗粒在其表面上具有直径 0. 5-6 μ m 的小孔 3000-40000 个 /mm2。
2.根据权利要求1所述的脂肪酶粉末制剂，其特征在于，所述颗粒在其表面上具有直径 0. 5-6 μ m 的小孔 3000-20000 个 /mm2。
3.根据权利要求1或2所述的脂肪酶粉末制剂，其特征在于，脂肪酶为来自米根霉的脂肪酶。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的脂肪酶粉末制剂，其特征在于，90质量％以上的所述颗粒的粒径为1-150 μ m。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的脂肪酶粉末制剂，其特征在于，所述脂肪酶粉末制剂用于进行酯交换或酯化。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的脂肪酶粉末制剂，其特征在于，所述脂肪酶粉末制剂通过在喷雾干燥的送风温度为40°C以上且小于70°C的条件下进行喷雾干燥来制造。
7.—种权利要求1-5中任一项所述的脂肪酶粉末制剂的制造方法，其特征在于，将含脂肪酶的水性液体在喷雾干燥的送风温度为40°C以上且小于70°C的条件下进行喷雾干燥来制造所述的脂肪酶粉末制剂。
8.—种酯合成物的制造方法，其特征在于，使用根据权利要求1-5中任一项所述的脂肪酶粉末制剂进行酯交换或酯化。
全文摘要
本发明提供了一种脂肪酶粉末制剂，组成粉末脂肪酶的脂肪酶颗粒的表面上具有0.5-6μm的小孔3000-40000个/mm2。所述脂肪酶粉末制剂即使在不使用大豆粉末的情况下仍提高了脂肪酶的活性。
文档编号C12N11/10GK102575238SQ201080040680
公开日2012年7月11日 申请日期2010年11月26日 优先权日2009年12月1日
发明者中村洋介, 外山裕子, 山内良枝, 根岸聪 申请人:日清奥利友集团株式会社