制备植物来源的vlp的方法

专利名称：制备植物来源的vlp的方法
技术领域：
本发明涉及制备植物来源的病毒样颗粒(virus like particle, VLP)的方法。
背景技术：
目前宿主细胞(如大肠杆菌、昆虫细胞培养物和哺乳动物细胞培养物)中的重组表达策略在培养基中以非常高的水平表达和分泌蛋白质。使用这些系统获得了高水平表达、正确蛋白质折叠和蛋白质翻译后修饰。此外，由于可以容易地将细胞内蛋白质与其他组分(DNA、囊泡、膜、色素等)分离，所表达蛋白质的纯化得以简化。对于植物或酵母表达系统，细胞壁阻止表达的蛋白质分泌到培养基中。对抗病毒感染的一种主要方法是通过免疫接种。应对流行爆发或满足季节性需求(例如，每年秋季发生的“流感季”或最近全球爆发的“猪流感”)的疫苗生产需要在获知后短时间内生产足量的疫苗。在面对全球流感大流行时，目前全球的流感疫苗产量可能不足。此外，主导(dominant)流感毒株每年变化，因此在一年中的低需求时间中储备是不实际的。经济、大规模地生产有效的流感疫苗有显著价值。病毒样颗粒(VLP)可用于制备流感疫苗。超结构(suprastructure)(如VLP)模拟病毒衣壳结构，但缺少基因组，从而不能复制或提供再次感染。VLP刺激强免疫应答，为分离(可溶)的重组抗原提供了替代方法。VLP在特定病毒蛋白表达后进行组装并具有类似于其同类病毒的外表面，但不同于真的病毒颗粒，遗传物质不会整合到其中。与天然病毒类似的颗粒状多价结构抗原的呈递引发具有均衡的体液和细胞成分的增强的免疫应答刺激。 认为优于分离抗原产生之刺激的这种改进对于包膜病毒尤其适用，因为包膜VLP以其天然膜结合状态呈递表面抗原(Grgacic和Anderson，2006年，Methods 40，60-65)。此外，已证明与重组血凝素(HA)(即单体HA，或组成花环的HA;3-8个三聚体的HA组装物)相比， 拥有纳米颗粒组织结构的流感VLP是更佳的候选疫苗，并且他们能激活体液和细胞免疫应答。(Bright，R.A.，等，2007，Vaccine 25,3871-3878)。目前市场上的绝大部分流感疫苗由从蛋中培养之病毒粒获得的病毒颗粒或病毒抗原构成。来源于蛋的疫苗的生产依赖于在具有胚胎的鸡蛋中培养活病毒。在用去污剂化学灭活和破坏纯化的病毒粒后获得裂解流感疫苗。作为大流行性疫苗产品，重组流感抗原是病毒来源抗原的有效替代品。一旦可获得新毒株的遗传构成信息，可以使用该信息生产重组抗原，并且其允许快速启动生产过程。但是，与灭活的裂解流感疫苗相比，纯化的重组HA亚基表现出更低的效力，并且需要更高的抗原含量来产生强免疫应答(Treanor等， 2007，J. Am. Med. Assoc. 297，1577-1582)。已通过在培养的哺乳动物细胞中共表达全部10种流感病毒蛋白获得流感 VLP (Mena等，1996年，J. Viro 1. 70，5016-5024)。几种病毒蛋白对于VLP的生产是可缺省的， 而且在疫苗发展中已通过共表达2种主要抗原性包膜蛋白(HA和NA)以及Ml或者仅共表达 HA 和 Ml 生产流感 VLP (Kang 等，2009 年，Virus Res. 143，140-146)。Chen 等(2007 年， J. Virol. 81,7111-7123)证实单独的HA可以驱动VLP形成和出芽，在他们的系统中可以省去Ml共表达。但是，由于发现HA与产生VLP的哺乳动物细胞表面的唾液酸化糖蛋白结合，所以共表达了病毒唾液酸酶以使VLP在出芽后从生产细胞中释放。期望有更简单的VLP生产系统(例如依赖于表达仅一种或几种病毒蛋白质而不需要表达非结构病毒蛋白的生产系统)以加快疫苗的开发。在植物系统中生产病毒抗原(包括VLP)提供了这样的生产优势，既它们可以在温室或田间培养，不需要无菌组织培养法和处理。PCT公开WO 2006/119516 (Williamson和Rybicki)公开了在植物中表达流感病毒A/越南/1194/2004的全长和截短的人密码子优化H5HA。截短的构建体缺少膜锚定结构域。通过靶向ER的构建体获得最高的HA蛋白积累。缺少膜靶向结构域的构建体没有产生可检测的HA。没有报道VLP的生产情况。之前WO 2009/009876和WO 2009/076778的发明人已描述了包含脂质包膜的流感 HAVLP的生产(D’ Aoust等；两者均通过引用并入本文)。对于包膜病毒，病毒保留脂质层或膜可以是有利的。不同系统的脂质构成可以有所不同(例如植物生成的包膜病毒会在包膜中包含植物脂质或植物留醇)，这可有助于增强免疫应答。Mason等描述了表达HBV表面抗原(HBsAg)的转基因烟草中包膜VLP的组装 (1992 年，Proc. Natl. Acad. ki. USA 89,11745-11749)。已证明植物生成的 HBV VLP 在肠胃外施用时在小鼠中显示出诱导强B和T细胞免疫应答((Huang等，2005年，Vaccine 23， 1851-1858)，但饲喂实验的口服免疫仅诱导了中度的免疫应答(Smith等，2003年，Vaccine 21,4011-4021)。Greco (2007 年，Vaccine 25,8228-8240)证明与 HBsAg 融合的人免疫缺陷病毒(HIV)表位在转基因烟草和拟南芥(Arabidopsis)中表达时累积为VLP，产生了二价 VLP疫苗。在转基因烟草和马铃薯植株中表达病毒衣壳蛋白(NVCP)导致无包膜VLP的组装 (Mason 等，1996 年，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93，5335-5340)。已在农杆菌浸润的本塞姆氏烟草(N. benthamiana)叶中产生了 NVCP VLP (Huang等 2009年，Biotechnol. Bioeng. 103， 706-714)，并且在小鼠中证实了其口服施用后的免疫原性(Santi等，2008年，Vaccine26, 1846-1854)。给健康成人志愿者施用含有215-751 μ gVLP形式的NVCP的2或3剂量生马铃薯在95%的免疫志愿者中产生免疫应答(Tacket等2000年，J. Infect. Dis. 182，302-305)。 还由 HBV 核心抗原(HBcAg ；Huang 等，2009 年，Biotechnol. Bioeng. 103，706-714)、人乳头状瘤病毒(HPV)主要衣壳蛋白 Ll (Varsani 等，2003 年，Arch. Virol. 148，1771-1786)的表达获得了无包膜VLP。可期望在将VLP用于疫苗制备之前从植物或植物物质中存在的一些或全部蛋白质、碳水化合物等中分离VLP。PCT公开WO 00/09725 (Turpen等)描述了一种从植物的细胞间隙提取蛋白质的方法，包括真空和离心处理以提供包含目的蛋白质的间质液 (interstitial fluid)提取物。该方法适于能在真空和离心条件下通过孔的小蛋白质 (50kDa或更小)，但不适于较大超级结构蛋白(superstructure protein)或蛋白复合物如 VLP。1999 年 McCormick 等(Proc Natl Acad Sci USA 96:703-708)公开了使用与单链Fv(scFV)表位融合的大米淀粉酶信号肽将表达的蛋白质靶向到细胞外部分 (compartment)，随后通过对叶和茎组织进行真空过滤来回收scFv多肽。2008年Moehnke 等(Biotechnol Lett 30 =1259-1264)描述了使用McCormick的真空过滤法通过质外体提取从烟草中获得重组植物过敏原。PCT公开WO 2003/025124 Oiang等)公开了在植物中表达scFv免疫球蛋白，其通过鼠信号序列靶向质外体空间。考虑到VLP和生产它们的植物组织的复杂性，期望有这样的VLP制备方法，其中 VLP基本上不含植物蛋白质或容易与其分离，但仍保留包膜病毒的结构和免疫原特性。发明概述本发明涉及制备植物来源的病毒样颗粒(VLP)的方法。更具体地，本发明涉及制备包含流感抗原的VLP的方法。本发明的一个目的是提供制备植物来源的病毒样颗粒的改进方法。本发明提供了制备植物来源之VLP的方法(A)，包括获取定位于质外体 (apoplast)中的包含植物来源之VLP的植物或植物物质；产生原生质体(protoplast)和质外体级分，质外体级分包含植物来源的VLP ；回收质外体级分。该方法还可包括从质外体级分纯化植物来源之VLP的步骤。植物来源之VLP可以是嵌合的植物来源VLP。植物来源的VLP可选自以下组病毒包膜蛋白(viral envelope protein)、病毒结构蛋白、病毒衣壳蛋白和病毒外壳蛋白(viral coat protein) 0植物来源的VLP可以包含流感血凝素。质外体和原生质体级分可以通过用酶组合物处理植物或植物物质来产生。酶组合物可以包括一种或多于一种果胶酶、一种或多于一种纤维素酶，或者一种或多于一种果胶酶和一种或多于一种纤维素酶。此外，如期望，酶组合物不包括脂肪酶或蛋白酶，或该组合物不包括添加的脂肪酶或蛋白酶。植物或植物物质可以通过种植、收集或者种植并收集植物来获得。植物物质可以包括一部分或整株植物、植物细胞、叶、茎、根或培养的植物细胞中的一种或多于一种。本发明提供了如上所述(方法A)制备植物来源之VLP的方法，其中编码VLP的核酸以瞬时方式引入植物，所述VLP选自病毒包膜蛋白、病毒结构蛋白、病毒衣壳蛋白和病毒外壳蛋白的组。或者，核酸稳定地整合进植物基因组。本发明提供如上所述(方法A)制备植物来源的VLP的方法，其还包括从质外体级分纯化植物来源的VLP的步骤。纯化步骤可以包括通过深层过滤(cbpth filtration)来过滤所述质外体级分以产生澄清的提取物，然后用阳离子交换树脂来层析所述澄清的提取物。不希望被理论所约束，从质外体获取的蛋白质较为均一，因为翻译后修饰蛋白的中间形式或包含在多种细胞内部分进行之其他类型的加工的蛋白质没有被共提取。重组蛋白均一性水平更高通常使得包含该蛋白质的制剂的质量更高，并可生成具有更高的效力、 更长的半衰期或更好的免疫力的有益特性的产品。例如，与含有复合糖基化的蛋白质相比， 含有高度甘露糖糖基化的血液蛋白在血液循环中被更快地被清除。产生于质外体级分的糖基化蛋白表现出更复合类型的糖基化。因此，使用本文所述方法(其涉及细胞壁消化)制备的质外体来源蛋白表现出，例如在循环中更长的半衰期。本发明还提供了制备包含植物来源之脂质包膜的植物来源VLP的方法(B)，所述方法包括获取包含位于质外体之VLP的植物或植物物质；用酶组合物处理植物或植物物质以产生原生质体级分和一种或多于一种质外体蛋白组合物；将所述一种或多于一种质外体蛋白复合物与所述原生质体级分分离，其中所述一种或多于一种质外体蛋白复合物包含 VLP。所述酶组合物可以包含一种或多于一种果胶酶、一种或多于一种纤维素酶，或者一种或多于一种果胶酶和一种或多于一种纤维素酶。此外，如期望，酶组合物不包含脂肪酶或蛋白酶，或该组合物不包含添加的脂肪酶或蛋白酶。植物来源的VLP可以是嵌合的植物来源 VLP。植物来源的VLP可以选自病毒包膜蛋白、病毒结构蛋白、病毒衣壳蛋白和病毒外壳蛋白的组。植物来源的VLP可以包含流感血凝素。本发明提供了如上所述(方法B)制备植物来源之VLP的方法，其中编码VLP(选自病毒包膜蛋白、病毒结构蛋白、病毒衣壳蛋白和病毒外壳蛋白的组)的核酸以瞬时方式引入植物。或者，核酸稳定地整合进植物基因组。本发明提供如上所述(方法B)的制备植物来源的VLP的方法，其还包括从质外体级分中纯化植物来源的VLP的步骤。所述纯化步骤可以包括使用深层过滤来过滤质外体级分以产生澄清的提取物，然后用阳离子交换树脂层析所述澄清的提取物。植物来源VLP可以包含一种或更多种流感HA多肽。流感HA多肽还可以是嵌合HA 多肽。植物来源的VLP还可以包含凝血活性。植物或植物物质可以通过培养、收集或者培养并收集植物来获得。所述植物物质可以包括部分或全部植物或者植物细胞、叶、茎、根或培养的细胞中的一种或多于一种。本发明还提供了制备植物来源的VLP的方法(C)，包括获取包含植物来源的VLP的植物或植物物质，用细胞壁降解酶组合物消化所述植物物质以产生消化级分，过滤所述消化级分以产生过滤级分，从所述过滤级分中回收植物来源的VLP。所述酶组合物可以包含一种或多于一种果胶酶，一种或多于一种纤维素酶，或者一种或多于一种果胶酶和一种或多于一种纤维素酶。此外，如期望，酶组合物不包含脂肪酶或蛋白酶，或该组合物不包含添加的脂肪酶或蛋白酶。植物来源的VLP可以是嵌合的植物来源VLP。植物来源的VLP可以选自病毒包膜蛋白、病毒结构蛋白、病毒衣壳蛋白和病毒外壳蛋白的组。植物来源的VLP可以包含流感血凝素。本发明提供了如上所述(方法C)制备植物来源之VLP的方法，其中编码VLP(选自病毒包膜蛋白、病毒结构蛋白、病毒衣壳蛋白和病毒外壳蛋白的组)的核酸以瞬时方式引入植物。或者，核酸稳定地整合进植物基因组。本发明提供如上所述(方法C)的制备植物来源的VLP的方法，其还包括将过滤级分中的VLP与细胞碎片和不溶物质分离的步骤。分离步骤可以通过离心、深层过滤或者离心并深层过滤来进行以产生澄清的级分。植物来源的VLP可以通过层析来进一步纯化，例如，澄清的提取物可以使用阳离子交换树脂来纯化。植物来源VLP可以包括包含一种或更多种流感HA多肽的VLP。流感HA多肽还可以是嵌合HA多肽。植物来源的VLP还可以包含凝血活性。植物或植物物质可以通过培养、 收集或者培养并收集植物来获得。所述植物物质可以包括部分或全部植物或者植物细胞、 叶、茎、根或培养的细胞中的一种或多于一种。不希望被理论所约束，包含植物来源脂质的植物制得的VLP可以诱导比用其他生产系统制得的VLP更强的免疫反应，并且这些植物制得的VLP诱导的该免疫反应比活或减毒全病毒疫苗所诱导的免疫反应更强。从宿主细胞获得的蛋白提取物成分是复杂的，并且往往包含与待分离的目的蛋白质或超结构一起的细胞外和细胞内成分。制备质外体级分随后进行分离细胞内蛋白质和成分的步骤是有利的，因为目的蛋白质或超结构可以在制造过程中被富集和提高效力。包括更少有效步骤的更简单过程可以显著增加产量并且降低成本。还发现用细胞壁降解酶消化细胞壁的过程提高VLP蛋白的产量，即使在原生质体在提取过程中不保持完整的情况下也是如此。不希望被理论所约束，细胞壁消化步骤可松动细胞壁的多聚成分，并有助于使VLP 释放而非结合在细胞壁中。该方案还可以将细胞内成分对VLP的污染降到最低。消化植物细胞壁的方法是已知的，并且消化细胞壁的酶混合物(enzyme cocktail mixture)可以有所不同。本发明并不受所用的细胞壁消化方法限制。与使用勻浆、搅拌(blending)或研磨来制备植物来源之VLP的方法相比，本文所述方法使植物来源的VLP提取物受到更少的破坏和污染。本文所述方法提供植物组织的质外体级分并且可以保持原生质体及其成分的完整性。本文所述方法即使在原生质体或原生质体的一部分失去其完整性而不再完整的情况下也能有效纯化VLP。与涉及标准组织破碎技术(例如，勻浆、搅拌或研磨)的VLP提取方法相比，这些方法提供更高的VLP产量。更高的产量可以部分归因于破坏VLP和/或脂质包膜之结构完整性的剪切力的减少。从质外体级分制备VLP可以是有利的，因为质外体级分具有显著降低的细胞质蛋白或不含细胞质蛋白。因此，在质外体级分中将其他蛋白质和物质(包括HA 单体、三聚体或HA片段)与VLP分离可以被容易地实施。但是，即使原生质体制备物或部分原生质体制备物是不完整的，VLP的产量增加也可以通过本文所述方法来实现。与通过标准组织破碎技术获得的VLP相比，本发明的VLP的特征还在于显示出更高的凝血活性。这种改进的凝血活性可归因于完整VLP产量更高(溶液中游离的HA单体或三聚体更少)、具有完整脂质包膜的完整VLP产量更高，或其组合。与用全病毒制成的疫苗相比，用VLP制成的疫苗的优势在于它们是无感染性的。 因此，不用考虑生物防护并且这在生产中也是不需要的。植物制备的VLP提供的另外一个优势是允许在温室或田间培养表达系统，从而显著地更加经济并适于扩大规模。 此外，植物不包含参与向蛋白质合成或添加唾液酸残基的酶。VLP可以在没有神经氨酸酶(NA)的情况下产生，并且不需要共表达NA或用唾液酸酶(神经氨酸酶)处理生产细胞或提取以确保植物中的VLP生产。本发明的该概述并不必然描述本发明的所有特征。附图简述本发明的这些和其他特征将从以下描述中显而易见，其中参照了以下附图

图1显示了表达H5A/印度尼西亚/5/05血凝素的基于CPMVHT的表达盒(构建体 685)。图2显示了 A)表达H5/lndo (构建体编号685)的构建体的部分(从I^acI (35S启动子上游)到AscI (紧邻NOS终止子的下游))核酸序列(SEQ ID NO. 1)。来自A/印度尼西亚/5/2005的H5的编码序列以下划线表示。图2B显示了构建体编号685编码的H5A/ 印度尼西亚/5/05的氨基酸序列(SEQ ID NO. 2)。图3显示了用体积排阻层析(SEC)表征的包含血凝素(HA)的结构。离心经消化的植物提取物之后，重悬沉淀并通过SEC分离。图3A显示了每个级分的总可溶性蛋白质含量(实心三角形；左侧Y-轴，最大值用Bradford法测定)。还显示了所收集级分(实心柱；右侧Y-轴)的凝血活性。图3B显示了 SEC洗脱级分的SDS-PAGE分析结果。通过丙酮沉淀级分并在分析前用1/40体积的还原性样品上样缓冲液重悬。用0. 的考马斯R-250溶液对凝胶染色。纯化的VLP用作跑胶对照。对应于HAO单体的带用箭头表示。MW-分子量标准(kDa) ；C-纯化的VLP(对照)；泳道7至10和14至16对应于图3A所示的SEC分析洗脱的级分编号。图4显示了酶消化和通过Comitrol 勻浆器机械勻浆所获得的蛋白谱对比。用变性样品上样缓冲液处理样品，通过洗脱级分的SDS-PAGE分析分离蛋白质。用0. 的考马斯R-250溶液对凝胶染色。MW-分子量标准(kDa)；泳道1_25 μ 1酶混合物；泳道2_25 μ 1 植物组织酶消化物，泳道3-通过Comitrol勻浆器获得的5 μ 1提取物。图5显示了 HA表达盒的核酸序列(SEQ ID NO :9)，其包括苜蓿质体蓝素启动子和5’ UTR、A/印度尼西亚/5/2005(构建体号660)的H5的血凝素编码序列、苜蓿质体蓝素 3’ UTR和终止子序列。图6显示了阳离子交换树脂捕获的直接来自质外体级分的HA-VLP分离物的 HA-VLP。样品用非还原变性样品上样缓冲液处理，通过SDS-PAGE分离蛋白质。用0.1%考马斯R-250溶液对凝胶染色。泳道1 离心后的质外体级分；泳道2-3 连续微过滤后的质外体级分；泳道4 阳离子交换的上样物；泳道5 阳离子交换的流出级分。泳道6 ；阳离子交换的洗脱物，浓缩10倍；泳道7 分子量标准(kDa)。图7显示了 H5/lndo VLP(A)、澄清之后没有向消化缓冲液中添加NaCl的Hl/Cal VLP (B)和进行了该添加的Hl/Cal VLP(C)的纳米颗粒跟踪分析(Nanoparticle Tracking analysis，NTA)谱。NTA 实验是用 NanoSight LM20 (NanoSight, Amesbury, UK)进行的。该装置配备了蓝激光G05nm)、样品室和Viton氟橡胶0型圈。室温下记录视频并用NTA2. O 软件分析。样品记录60秒。手动选择快门和增益(gain)以获得最优粒子分辨率。图8显示了用不同缓冲液酶消化产生的H3/布里斯班VLP提取物的Western印迹结果。泳道 1)纯重组 HA 标准(5 μ g，Immune Technology Corp. IT-003_0042p)，泳道 2-5包含7 μ 1如下缓冲液中进行的离心酶提取物泳道2~) 600mM甘露糖醇+125m柠檬酸盐 +75mM NaP04+25mMEDTA+0. 04% 亚硫酸氢盐(pH6. 2)，泳道 3) 600mM 甘露糖醇+125mM 柠檬酸盐 +75mM NaP04+50mM EDTA+0. 04% 亚硫酸氢盐(pH6. 2)，泳道 4) 200mM 甘露糖醇 +125mM 柠檬酸盐 +75mM NaP04+25mMEDTA+0. 03% 亚硫酸氢盐(pH6. 2)，泳道 5) 200mM 甘露糖醇 +125mM 柠檬酸盐+75mM NaP04+50mM EDTA+0. 03%亚硫酸氢盐(pH6. 2)。箭头代表HAO的免疫检测信号。详细描述本发明涉及制备植物来源的病毒样颗粒(VLP)的方法。更具体地，本发明涉及制备包含流感血凝素(HA)的VLP的方法。以下描述是一个优选的实施方案。本发明提供了获取目的蛋白质或蛋白超结构的方法。目的蛋白质可以存在于质外体或细胞外部分(compartment)中(对应于除原生质体/原生质球(spheroplast)部分之外的植物细胞部分)。该方法包括去除、消化或者消化并去除包围植物细胞的纤维素植物细胞壁。通过消化细胞壁，细胞壁的聚合成分松动，目的蛋白质或蛋白超结构可以更容易地释放。通过使用该方法，目的蛋白质或蛋白质超结构被富集，这是由于包含的主要宿主细胞蛋白和成分的原生质体/原生质球部分与质外体分离。如下所述，如果在过程中原生质体/ 原生质球部分失去完整性，如果原生质体/原生质球部分是不完整的，如果来自原生质体/原生质球部分的部分宿主细胞蛋白和成分存在于质外体级分中，本文提供的方法在获得目的蛋白质或蛋白超结构方面仍然有效。蛋白超结构的实例是由2个或更多个多肽构成的结构；所述多肽可以是相同或不同的；如果是不同的，它们的存在比例可以为约1 1至约10 1或更高。蛋白超结构还可以包含一种或更多种脂质、磷脂、核酸、膜等。2个或更多个多肽可以通过共价键、二硫键、电荷相互作用、疏水吸引力、范德华力、氢键等连接。蛋白超结构的例子是病毒样颗粒(VLP)， 其可以是包膜或非包膜的，例如病毒包膜蛋白、病毒结构蛋白、病毒衣壳蛋白或病毒外壳蛋白。本发明还提供了制备植物来源的病毒样颗粒(VLP)的方法。该方法包括获取包含定位于质外体中的植物来源VLP的植物或植物物质；由植物物质产生原生质体/原生质球级分和质外体级分，质外体级分包含植物来源的VLP，以及回收质外体级分。如期望的话，可从质外体级分中纯化植物来源的VLP。本发明还提供了制备包含植物来源的脂质包膜的VLP的方法。该方法包括获取包含VLP的植物或植物物质，用酶组合物处理植物或植物物质以产生一种或多于一种质外体蛋白复合物和原生质体/原生质球级分，将一种或多于一种质外体蛋白复合物与原生质体级分分离。所述一种或多于一种质外体蛋白复合物包含含有植物来源的脂质包膜的VLP。本发明还提供了制备植物来源的VLP的方法，其包括获取包含植物来源的VLP的植物或植物物质，用细胞壁降解酶组合物消化植物物质以产生消化级分，过滤消化级分以产生过滤级分，和从过滤级分回收植物来源的VLP。在这个方法中，原生质体的完整性可以不是必需的。原生质体是完全或部分去除细胞壁的植物细胞。原生质球可以部分去除细胞壁。 原生质体、原生质球或原生质体和原生质球(原生质体/原生质球)均如本文所述使用，并且本文使用的这些术语是可以互换的。可以通过机械方式(例如通过勻浆、搅拌)破碎和去除细胞壁，可全部或部分地酶消化细胞壁，或可以通过机械和酶联合的方法去除细胞壁， 例如勻浆之后用酶处理以消化细胞壁。原生质体也可以从培养的植物细胞获取，例如从液体培养的植物细胞或固体培养的植物细胞。给出植物组织培养物、培养的植物细胞和原生质体、原生质球生产等的一般原则的标准参考文献包括 introduction to Plant Tissue Culture, MK Razdan 著， 第二版(Science Publishers，2003年；通过引用并入本文)，或例如参见下述URL : molecular-plant-biotechnology, info/plant-tissue-culture/protoplast-isolation, htm。与原生质体(或原生质球)的生产和操作相关的方法和技术综述于，例如，Davey MR等，2005 (Biotechnology Advances 23 :131-171 ；通过引用并入本文)。给出蛋白生物化学、分子生物学等的一般方法与原则的标准参考文献包括，例如Ausubel等，Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley & Sons，New York(1998 年禾口 2001 年的增干1J ；通过弓I用并入本文)；Sambrook 等，Molecular Cloning :A Laboratory Manual,第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York, 1989 (通过弓|用并入本文)；Kaufman 等编· ,Handbook Of Molecular And Cellular Methods In Biology And Medicine, CRC Press, Boca Raton，1995 (ilil弓入*t) ；McPherson H, Directed Mutagenesis :A Practical Approach, IRL Press, Oxford, 1991 (通过弓|用并入本文)。
消化或降解细胞壁以释放原生质体或原生质球的酶是本领域技术人员已知的，可以包括纤维素酶(EC 3. 2. 1.4)、果胶酶(EC 3. 2. 1. 15)、木聚糖酶(EC 3. 2. 1.8)、几丁质酶(EC 3.2. 1.14)、半纤维素酶或其组合。合适的酶的非限制性实例包括多组分酶的混合物，其包含纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶，例如MACER0ZYME (约含纤维素酶0. lU/mg, 半纤维素酶0. 25U/mg，和果胶酶0. 5U/mg)。另一些商业化酶、酶混合物的例子和供应商列于表1 (参见Jntroduction to Plant Tissue Culture, MK Razdan 第二版，Science Publishers,2003 年)。替代性的纤维素酶的名称和种类包括内-I，4_i3-D-葡聚糖酶；β-1，4_葡聚糖酶；β -1，4-葡聚糖内切水解酶；纤维素酶A ;cellulosin AP ；葡聚糖内切酶D，碱性纤维素酶；纤维素酶A3;纤维素糊精酶(celludextrinase) ；9. 5纤维素酶；微晶纤维素酶; pancellase SS和1，4_ (1，3 ； 1，4) - β-D-葡聚糖4_葡聚糖水解酶。替代性的果胶酶(多聚半乳糖醛酸酶)的名称和种类包括果胶去聚合酶；果胶酶；多聚半乳糖醛酸内切酶； 果胶酶(pectolase)；果胶水解酶；果胶多聚半乳糖醛酸酶；多聚半乳糖醛酸内切酶；多聚- α -1，4-半乳糖醛酸聚糖水解酶；半乳糖醛酸内切酶；内-D-半乳糖醛酸酶和多聚(1， 4-a-D-半乳糖醛酸)聚糖水解酶。替代性的木聚糖酶的名称和种类包括半纤维素酶， 内-(1 — 4) - β -木聚糖4-木聚糖水解酶；内-1，4-木聚糖酶；木聚糖酶；β -1，4-木聚糖酶；内-1，4-木聚糖酶；内-β -1，4-木聚糖酶；内-1，4- β -D-木聚糖酶；1，4- β -木聚糖木聚糖水解酶；β -木聚糖酶；β -1，4-木聚糖木聚糖水解酶；内-1，4-β -木聚糖酶；β -D-木聚糖酶。替代性的几丁质酶的名称和种类包括几丁质糊精酶；1，4-β -多聚-N-乙酰氨基葡糖苷酶；多聚-β -氨基葡糖苷酶；β -1,4-多聚-N-乙酰氨基葡糖苷酶 ’多聚[1，4-(Ν-乙酰-β -D-氨基葡糖苷酶)]聚糖水解酶。表1 用于原生质体分离的市售酶的非限制性实例
权利要求
1.制备植物来源的VLP的方法，其包括a.获取包含定位于质外体的VLP的植物或植物物质，b.产生原生质体/原生质球级分和质外体级分；和，c.回收所述质外体级分，所述质外体级分包含所述植物来源的VLP。
2.权利要求1的方法，其中在所述产生步骤(步骤b)中，通过用细胞壁降解酶组合物处理所述植物或植物物质来产生所述质外体级分和原生质体级分。
3.权利要求2的方法，其中所述细胞壁降解酶组合物包含一种或多于一种果胶酶、一种或多于一种纤维素酶，或者一种或多于一种果胶酶和一种或多于一种纤维素酶。
4.权利要求3的方法，其中所述细胞壁降解酶组合物不包含脂肪酶、蛋白酶或果胶酶中的一种或更多种。
5.权利要求1的方法，其中在所述获取步骤(步骤a)中，用编码选自以下组的蛋白质的核酸序列转化所述植物病毒包膜蛋白、病毒结构蛋白、病毒衣壳蛋白和病毒外壳蛋白， 以及收集所述植物或植物物质。
6.权利要求5的方法，其中所述核酸以瞬时方式引入所述植物中。
7.权利要求5的方法，其中所述核酸稳定整合进所述植物的基因组。
8.权利要求1的方法，其中在所述获取步骤(步骤a)中，培养所述植物并收集所述植物或植物物质。
9.权利要求5的方法，其中所述核酸编码流感血凝素。
10.权利要求1的方法，其中所述植物来源的VLP不包含神经氨酸酶或M蛋白。
11.权利要求1的方法，其中所述植物物质选自叶和培养的植物细胞的组。
12.权利要求1的方法，其还包括步骤d)从所述质外体级分中纯化所述植物来源的VLP。
13.权利要求12的方法，其中所述纯化步骤包括利用深层过滤来过滤所述质外体级分以产生澄清的提取物，然后用阳离子交换树脂来层析所述澄清的提取物。
14.制备包含植物来源之脂质包膜的植物来源VLP的方法，其包括a.获取包含定位于质外体的VLP的植物或植物物质，b.用酶组合物处理所述植物或植物物质，以产生原生质体/原生质球级分和一种或多于一种包含所述VLP的质外体蛋白复合物；以及c.将所述一种或多于一种质外体蛋白复合物与所述原生质体级分分离。
15.权利要求14的方法，其中所述酶组合物包含一种或多于一种果胶酶、一种或多于一种纤维素酶，或者一种或多于一种果胶酶和一种或多于一种纤维素酶。
16.权利要求14的方法，其中所述酶组合物不包含脂肪酶、蛋白酶或果胶酶中的一种或更多种。
17.权利要求14的方法，其还包括步骤d)从所述质外体级分中纯化所述植物来源的VLP。
18.权利要求17的方法，其中所述纯化步骤包括利用深层过滤来过滤所述质外体级分以产生澄清的提取物，然后用阳离子交换树脂来层析所述澄清的提取物。
19.权利要求14的方法，其中在所述获取步骤(步骤a)中，用编码选自以下组的蛋白质的核酸序列转化所述植物病毒包膜蛋白、病毒结构蛋白、病毒衣壳蛋白和病毒外壳蛋白，以及收集所述植物或植物物质。
20.权利要求19的方法，其中所述核酸以瞬时方式引入所述植物中。
21.权利要求19的方法，其中所述核酸稳定整合进所述植物的基因组。
22.权利要求14的方法，其中在所述获取步骤(步骤a)中，培养所述植物并收集所述植物或植物物质。
23.权利要求19的方法，其中所述VLP包含流感血凝素。
24.权利要求14的方法，其中所述植物物质选自叶和培养的植物细胞的组。
25.权利要求14的方法，其中所述VLP不包含神经氨酸酶或M蛋白。
26.制备植物来源的VLP的方法，其包括a.获取包含植物来源的VLP的植物或植物物质；b.用细胞壁降解酶组合物消化所述植物物质以产生消化级分；c.过滤所述消化级分以产生过滤级分，从所述过滤级分中回收所述植物来源的VLP。
27.权利要求沈的方法，其中所述细胞壁降解酶组合物包含一种或多于一种果胶酶、 一种或多于一种纤维素酶，或者一种或多于一种果胶酶和一种或多于一种纤维素酶。
28.权利要求27的方法，其中所述细胞壁降解酶组合物包含一种或多于一种果胶酶、 一种或多于一种纤维素酶，或者一种或多于一种果胶酶和一种或多于一种纤维素酶。
29.权利要求27的方法，其中在所述获取步骤(步骤a)中，用编码选自以下组的蛋白质的核酸序列转化所述植物病毒包膜蛋白、病毒结构蛋白、病毒衣壳蛋白和病毒外壳蛋白，以及收集所述植物或植物物质。
30.权利要求四的方法，其中所述核酸以瞬时方式引入所述植物中。
31.权利要求四的方法，其中所述核酸稳定整合进所述植物的基因组。
32.权利要求四的方法，其中所述植物来源的VLP包含流感血凝素。
33.权利要求27的方法，其中所述植物物质选自叶和培养的植物细胞的组。
34.权利要求沈的方法，其还包括步骤d)将所述过滤级分中的VLP与细胞碎片和不溶物质分离开。
35.权利要求34的方法，其中所述分离步骤通过离心进行。
36.权利要求34的方法，其中所述分离步骤通过深层过滤进行。
37.权利要求27的方法，其还包括步骤d)从所述过滤级分中纯化所述植物来源的VLP。
38.权利要求34的方法，其中所述纯化步骤包括深层过滤所述过滤级分以产生澄清的提取物，然后用阳离子交换树脂来层析所述澄清的提取物。
全文摘要
提供了制备植物来源之病毒样颗粒(virus like particle，VLP)的方法。该方法可包括获取包含定位于质外体(apoplast)之VLP的植物或植物物质，从所述植物或植物物质产生原生质体(protoplast)/原生质球(spheroplast)级分和质外体级分，以及回收质外体级分。质外体级分包含植物来源的VLP。或者，可以通过用细胞壁降解酶组合物消化植物物质来产生消化级分，从而从包含植物来源之VLP的植物或植物物质获得VLP。过滤消化级分以产生过滤级分，从过滤级分中回收植物来源的VLP。
文档编号C12N7/00GK102549148SQ201080042333
公开日2012年7月4日 申请日期2010年9月21日 优先权日2009年9月22日
发明者米凯莱·达吉斯, 路易斯-菲利普·韦齐纳, 达尼·帕克特, 马克-安德烈·德奥斯特, 马农·科图雷 申请人:麦迪卡格公司