专利名称：甄别乳制品的方法
技术领域：
本发明涉及确定乳制品真伪和来源的新方法，更特别地涉及具有独特定位插入序列元件之乳酸菌菌株作为标记和鉴定乳制品(例如乳酪)的工具的用途。本发明还涵盖新的乳酸菌分离株、其在乳制品生产中的用途以及包含这些细菌菌株的乳制品。背景保护有价值的货物、产品和品牌是当今市场的重要要求。有鉴于持续增多的假冒和未授权销售的食品，需要有效的方法来甄别产品和货物的真伪。假冒产品的成分可能与真正产品的不同，但也可能相同(但采用掺假的形式或者质量低劣)，这使它们难以区分。甄别产品真伪的现有方法包括例如添加外源小分子标志物，例如维生素(例如US 2006/0035288)、糖类(例如WO 2008/002987)、可视觉检测的标志物(例如通过荧光、使用染料(例如 US 6，312，958、US 2004/0029295、EP O 327 163、US 4，764，290)、基于含氮和/或含硫杂环的示踪剂(例如WO 2009/040563))或核酸(例如WO 96/17954)。另一些方法包括鉴定地理依赖性指示物(例如同位素分布)和受处理过程影响的指示物(例如铜含量)(Pillonel 等，Mitt. Lebensm. Hyg. 95，503 (2004)及其参考文献)，或者使用 PCR 法鉴定遗传标志物(如可移动遗传元件，包括插入序列元件(或IS(insertion sequence)元件))。在大肠杆菌和λ噬菌体基因表达的早期研究中发现了细菌IS元件。它们的长度为800至2500bp，并且可在多种不同细菌的基因组中发现，数目为每基因组几个至几百个拷贝。IS元件之结构的典型特征为在其末端存在反向重复序列和编码转座酶的基因。它们能够插入基因组中的多个位点或者插入质粒中(Mahillon等，1998)。已显示，IS促进宿主的进化适应(Nicoloff 等人，2003 和 2007 ；Papadopoulos 等人，1999, Schneider 等人，2004)。然而,不同的IS元件已显示具有不同的转座活性(Papadopoulos等人，1999 ；Polzin等人，1993)。已证实，将限制性片段长度多态性与多个IS元件之存在相联合适于在同物种水平对乳酸菌菌株进行分型(Petrovic等人,2006 ；Ricci等人,2006)。本申请人发现，在单个乳酸菌菌株的独特位置出现的高变性IS元件可用作菌株特异性标志物，以作为甄别乳制品真伪的快速有效的工具来标记乳制品。发明概述因此，本发明一般性地涉及确定乳制品真伪和来源的新方法，更特别地涉及使用具有独特定位IS元件之乳酸菌菌株作为标记和鉴定乳制品的工具。因此，本发明的第一方面涉及鉴定乳制品中是否存在包含独特定位之IS元件的乳酸菌菌株的方法，其包括检测基因组上特定基因座处是否存在所述IS元件。更特别地，本发明的方法包括以下步骤(a)从乳制品获得核酸样品(nucleicsample), (b)提供如下引物对，其特异性针对所述独特定位之IS元件的区域以及与所述独特定位之IS元件相邻的核酸序列区域，(c)当所述独特定位之IS元件存在于所述核酸样品中时在适于产生扩增产物的条件下，用步骤(b)所述引物对进行PCR扩增反应，以及(d)通过检测是否存在所述扩增产物来鉴定是否存在乳酸菌菌株。在一些具体的实施方案中，包含独特定位之IS元件的乳酸菌菌株(下文中也称为“(本发明的)标志菌株”)选自片球菌属(Pediococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus),优选片球菌属(如于2009年9月25日以保藏号DSM 22981保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlungvon Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ)的细菌)和德氏乳杆菌乳酸亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis)(如于 2010 年 9 月 28 日以保藏号 DSM 24025保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心的细菌)。在另一方面中，本发明还涉及适用于本发明方法的特定引物对，其中每个引物对由10 100个(优选18 35个)核苷酸长的第一和第二引物组成,它们分别对存在于上述特定乳酸菌菌株中之IS元件的片段和与所述IS元件相邻之序列的片段具有足够的特异性以允许进行PCR扩增。
在另一方面中，本发明还涉及本发明的这些引物或引物对的用途。在又一方面中，本发明还涉及乳酸菌的新分离株，如乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)(由以保藏号DSM 22981保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ)的分离株代表)和德氏乳杆菌乳酸亚种(由2010年9月28日以保藏号DSM 24025保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ)的分离株代表)。还包括它们的突变体或变体，或者与上述每个菌株具有至少93%的16S rRNA序列相似性的细菌(下文中也称为“本发明的(乳酸菌)菌株”)。在另一方面中，本发明还涉及如下乳制品(优选乳酪)，其包含本发明的乳酸菌菌株或本发明的乳酸菌菌株组合。在另一方面中，本发明还涉及包含独特定位之IS元件的乳酸菌菌株用于鉴定和证明乳制品来源的用途，其中来源的证明由所述乳酸菌菌株的存在来指示。在另一方面中，本发明还涉及特异性检测包含独特定位之IS元件的乳酸菌菌株的试剂盒，其包含上文所述的引物对，用以鉴定和证明乳制品的来源，其中来源的证明由所述乳酸菌菌株的存在来指示。发明详述应理解,涉及菌株和IS元件时,无数量词修饰表示包括一种或更多种菌株或者一种或更多种IS元件。因此，还包括具有一种或更多种标志序列的一种乳酸菌菌株，各具有一种标志序列的两种或更多种乳酸菌菌株，各具有两种或更多种标志序列的两种或更多种乳酸菌菌株的组合。本文中讨论了特定的组合。本文所用的菌株“变体”或“衍生物”的表述是指以指定或非指定方式与本发明之另一(相关)菌株不同但具有同样的标志序列的菌株。变体可通过自发突变产生，或者通过基因操作或常规手段人为产生(包括通过紫外光源、使用化学物质(如亚硝基胍等)来突变)。涉及核苷酸标志序列时，表述“变体”或“衍生物”包括通过对一些核苷酸进行替换、缺失、添加而不同的所有核苷酸序列，但是其用本发明引物得到类似大小(差异少于15% bp)的 PCR 产物。术语“引物”是指能在适当条件下(即，存在4种不同的核苷三磷酸和DNA聚合酶时)、在适当的缓冲液中和适当的温度下作为模板指导DNA合成之起始点的单链寡核苷酸。合适的引物长度取决于引物的用途，但其通常足以提供期望条件下的杂交，并且通常为18 35个核苷酸长。短引物分子一般需要较低的温度以与模板形成足够稳定的杂交复合物。引物不需要反映模板的确切序列，但必须具有足够的互补性以与模板杂交。术语“引物位点”是指与引物杂交的靶DNA区域。术语“引物对”是指包含5’ “上游引物”和3’ “下游引物”的引物组，所述5’ “上游引物”与待扩增DNA序列的5’端杂交，所述3’ “下游引物”与待扩增序列的3’端杂交。适用于本发明的引物对被特别地设计用于检测独特定位的IS元件，并包含与IS元件内之片段杂交的第一引物和与IS元件两侧之片段杂交的第二引物。在本发明上下文中，所述第一和第二引物跨越的序列也称为“标志序列”。涉及多核苷酸(即核苷酸序列，如寡核苷酸或靶核酸)时，本文所用术语“互补”、“互补的”或“互补性”涉及标准Watson/Crick配对原则。核酸序列互补以使一个序列的5’端与另一序列的3’端配对采用“反平行结合(antiparallel association)”。
术语“基本互补”是指序列(本文中为引物或探针)不需要与其靶序列完全互补；取而代之地，引物或探针仅需要具有足以在期望的退火位点与其相应链选择性杂交的互补性。本领域技术人员应理解，基本互补的序列不需要在其全长上杂交。引物或探针中可包含一个或更多个非互补碱基，只要该引物或探针保持足以与其多核苷酸结合位点形成稳定双链体的互补性即可。引物的“特异性杂交”是指退火至互补序列形成双链多核苷酸，其为引物延伸和DNA合成提供起始位点。术语“扩增子”或“扩增产物”是指通过本发明引物对的延伸产生的扩增反应产物。如果所使用的两个引物均与靶序列杂交，则扩增子可包含指数扩增的核酸。或者，如果所使用的引物之一不与靶序列杂交，则扩增子可通过线性扩增产生。一种优选的扩增方法采用PCR(参见Saiki等人(1988) ,Science 239 :487-4391)。所述方法使用上文所述的引物对。在常规PCR中，将引物与含Mg2+的合适缓冲液、所有4种脱氧核苷酸(dNTP)、热稳定的DNA聚合酶和靶DNA(模板)混合。然后将混合物加热至足以使两条DNA互补链分离的温度。然后将混合物冷却到足以使引物与互补序列发生特异性退火的温度。然后，任选地将反应混合物的温度重新设置为热稳定DNA聚合酶的最佳温度以允许DNA合成(延伸)。然后重复该温度方案以进行每个扩增循环。因此，PCR由DNA解链、退火和延伸的多个循环组成。用于本发明方法中的PCR方法使用标准方法进行(参见例如McPherson等人，PCR (Basics From Background to Bench)(2000)Springer Verlag ;Dieffenbach 和 Dveksler 编，PCRPrimer A Laboratory Manual(1995)Cold Spring Harbor Laboratory Press ；Erlich,PCR Technology, Stockton Press, New York, 1989 ；Innis 等人，PCR Protocols A Guideto Methods and Applications,Academic Press,Harcourt Brace Javanovich,New York,1990 ；Barnes,ff. M. (1994) Proc Natl Acad Sci USA，91，2216-2220)。用于本发明方法中的引物或寡核苷酸优选为DNA。在本发明上下文中，通过使用本发明引物对进行PCR扩增反应来获得扩增产物或扩增子，从而扩增标志序列(即第一和第二引物跨越的序列)并获得相应的扩增产物或扩增子。在检测是否存在靶核酸序列以指示样品中是否存在特定菌株等的上下文中，本文使用的术语“检测”不需要方法提供100%的灵敏度和/或100%的特异性。众所周知地，“灵敏度”是在样品具有靶核酸序列的情况下测定为阳性的几率，而“特异性”是在样品不具有靶核酸序列的情况下测定为阴性的几率。优选地，灵敏度为至少50%，但显然更优选至少60%、至少70%、至少80%、至少90%和至少99%的灵敏度。优选地，特异性为至少50%，但显然更优选至少60%、至少70%、至少80%、至少90%和至少99%的特异性。检测还涵盖具有假阳性和假阴性的测定。假阴性率可以为或甚至更高。假阳性率可以为1%、5%、10%、15%、20%或甚至更高。涉及核酸序列(例如IS元件内的片段或IS元件两侧核酸序列内的片段，其作为本发明引物对的杂交位点)时，“片段”是指15 2000bp的核苷酸残基序列，优选15 500个、更优选50 400个、最优选100 300个核苷酸长。本发明一般地涉及甄别乳制品真伪和证明乳制品来源的方法，其通过在生产期间用具有独特定位之IS元件的乳酸菌菌株(下文中也称为“(本发明的)标志菌株”)标记乳制品来实现。筛选这些具有独特定位之IS元件的菌株使得能够证明乳制品的来源。
因此，本发明涉及鉴定乳制品中是否存在包含独特定位之IS元件的乳酸菌菌株的方法，其包括检测特定基因座处是否存在所述IS元件，其中，存在所述IS元件指示在所述乳制品中存在乳酸菌菌株。更特别地，所述方法包括如下步骤(a)从乳制品获得核酸样品，(b)提供如下引物对，所述引物对特异性针对所述独特定位之IS元件的区域以及与所述独特定位之IS元件相邻的核酸序列区域，(c)当所述独特定位之IS元件存在于所述核酸样品中时在适于产生扩增产物的条件下，用步骤(b)所述引物对进行PCR扩增反应，以及(d)通过检测是否存在所述扩增产物来鉴定是否存在乳酸菌菌株。在一些具体实施方案中，用于本发明方法的乳酸菌菌株可以是乳制品中存在的或乳制品工业中使用的任意类型的乳酸菌，例如乳球菌属(Lactococci),如乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp. Iactis)、乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcuslactis subsp. cremoris)和乳酸乳球菌乳亚种丁二丽变种(Lactococcus lactis subsp.lactic biovar diacetylactis);片球菌属(Pediococci),如戍糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)和乳酸片球菌；链球菌属(Streptococci),如嗜热链球菌；乳杆菌属(Lactobacilli),如德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、干酪乳杆菌、德氏乳杆菌乳酸亚种、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)。一个优选的菌株是于2009年9月25日以保藏号DSM 22981保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心的菌株。另一优选的菌株是于2010年9月28日以保藏号DSM 24025保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心的菌株。在另一些具体的实施方案中，所述独特定位的IS元件与选自以下的IS元件具有至少75%的同一性可容易地从乳酸菌嗜热链球菌、干酪乳杆菌、德氏乳杆菌乳酸亚种、瑞士乳杆菌、乳酸乳球菌、乳明串珠菌(Leuconostoc lactis)、戍糖片球菌、有害片球菌(Pediococcus damnosus)和鼠李糖乳杆菌获得的IS元件,包括但不限于IS30、IS153、ISSU IS981、IS1076、ISLU ISLplU IS904 和 IS946 序列或其部分。
在另一些实施方案中，乳制品的核酸样品(根据上述方法的步骤(a))可通过本领域已知方法提取。本发明 方法包括筛选各自包含独特定位之IS元件的一种或更多种乳酸菌菌株。所述筛选包括将核酸样品与针对每个菌株的本发明一对引物杂交，使得发生扩增并获得针对每个菌株的扩增产物。在一些具体的实施方案中，本发明的方法包括筛选一个菌株或者2或3种菌株的组合。或者，本发明的方法包括筛选包含多达一种或更多种独特定位之IS元件的一种乳酸菌菌株，其可以如下实现即将核酸样品与针对每个IS元件的本发明一对引物杂交，使得发生扩增并获得针对每个IS元件的扩增产物。在一些具体的实施方案中，本发明的方法包括筛选1、2或3个IS元件。如下鉴定特定菌株中的一种或更多种独特定位之IS元件(i)首先使用适当引物筛选特定菌株中的一种或更多种IS元件，(ii)然后使用特别设计的引物单独地或以不同组合地扩增特定菌株以及同一物种之其它菌株中检测到的一种或更多种不同IS之间的DNA，以及(iii)检测特定菌株独特的PCR产物。对经鉴定的独特PCR产物测序，设计引物并评价菌株特异性。可使用本发明的引物对采用本领域技术人员已知的不同方法来扩增乳制品的核酸样品。优选地，使用PCR扩增目的核酸。简言之，购买与本文所述相对互补链上的区域互补的两个引物序列，即第一引物与独特定位之IS元件的片段杂交，第二引物与所述IS元件相邻之核酸序列的片段杂交。向反应混合物中添加过量的寡核苷酸以及DNA聚合酶(例如Taq聚合酶)和脱氧核苷酸三磷酸。如果样品中存在独特定位的IS元件，则引物将与IS元件及其两侧序列内的互补序列相结合，聚合酶将通过添加核苷酸使引物沿标志序列延伸。通过升高和降低反应混合物的温度，延伸的弓I物将从标志物上解离并形成反应产物，过量的弓I物将与靶序列和反应产物结合，并重复该过程，从而产生指数扩增的产物。循环参数可根据待延伸之扩增产物的长度而异。可在样品中包含利用特定引物的内部阳性扩增对照(internal positiveamplification control, IPC),例如用以监测DNA提取和任何后续扩增。在一个合适的实施方案中，使用能检测PCR扩增产物累积的任何合适仪器进行实时PCR。最常见地，所述仪器能检测来自一种或更多种荧光标记的荧光。例如，利用仪器(例如Rotorgene)的实时检测来监测每个PCR循环期间的荧光。阈值循环(或Ct值)是荧光与阈值相交的循环数。阈值通过软件确定或手动确定。可通过本领域公知的多种方法中的任一种来检测核酸序列的扩增，例如凝胶电泳、毛细管电泳或“实时”检测。在一个实施方案中，在同一反应管中扩增来自两个或更多个目的片段的序列(即“多重PCR” )。可通过测量反应的终点或采用“实时”方式进行检测。对于实时检测来说，可以对引物和/或探针进行可检测标记，从而例如在引物整合或探针杂交时产生荧光差异，并且在能够在反应期间监测荧光变化的仪器中进行扩增。核酸扩增的实时检测法是公知的，其包括例如TaqMan 系统、Scorpion 引物系统以及使用针对双链核酸的嵌入染料。可用的标记包括例如荧光染料(例如，得克萨斯红、FAM、JOE、HEX)。
在终点检测中，可如下检测扩增子首先根据大小分离扩增子，然后检测经大小分离的扩增子。分离不同大小的扩增子可通过例如凝胶电泳或毛细管电泳来进行。这些和其它分离法是本领域公知的。在一个实例中，可用例如4% 5%的琼脂糖凝胶(针对约150至约300个碱基对的扩增子，用2 % 3 %的琼脂糖凝胶)或者6 % 11 %的聚丙烯酰胺凝胶分离约10至约150个碱基对的扩增子(其大小差异10个或更多个碱基对)。然后，可以用染料(例如GelRed)对分离的核酸进行染色，所得染色条带的大小可以与DNA分子量标准进行比较。因此，在本发明方法的一个具体实施方案中，扩增产物的存在通过使用凝胶电泳鉴定扩增序列的大小(DNA长度)来指示，其通过用于所述聚合酶链式反应的经标记引物(其整合入扩增序列中)或者通过与扩增序列独特部分退火的经标记DNA探·针随后利用Southern印迹分析来实现。本发明的另一方面还涉及用于根据本发明方法进行杂交和扩增的引物对，更特别地涉及包含第一引物和第二引物的引物对，所述第一引物和第二引物各自包含至少15个连续核苷酸，其中所述第一引物足以特异性针对独特定位的插入元件内的序列，第二引物足以特异性针对插入元件两侧区域内的序列。更优选地，引物对包含SEQ ID NO :1的第一引物和SEQ ID NO :2的第二引物用以鉴定乳制品中是否存在片球菌属菌株，或者SEQ ID NO6的第六引物和SEQ ID NO :7的第七引物用以鉴定乳制品中是否存在乳杆菌属菌株，或其组合。因此，在另一实施方案中，用于鉴定乳制品中是否存在乳酸片球菌菌株的方法包括以下步骤(a)从乳制品获得核酸样品，(b)提供如下引物对，其特异性针对ISSlSC (GenBank登录号X94934)区域以及与所述独特定位之IS元件相邻的核酸序列区域，优选这样的引物对，其中引物对的第一引物包含SEQ ID NO 1的序列，引物对的第二引物包含SEQ ID NO 2的序列，(c)在适合所述第一和第二引物发生杂交的条件下，用步骤(b)的引物对进行PCR扩增反应，以及(d)检测是否存在扩增产物，以作为是否存在所述片球菌菌株的指示。在又一实施方案中，用于鉴定乳制品中是否存在德氏乳杆菌乳酸亚种的方法包括以下步骤(a)从乳制品获得核酸样品，(b)提供如下引物对，其特异性针对IS30 (GenBank登录号NC_008529)区域以及与所述独特定位之IS元件相邻的核酸序列区域，优选这样的引物对，其中引物对的第六引物包含SEQ ID NO 6的序列，引物对的第七引物包含SEQ ID NO 7的序列，(c)在适合所述第六和第七引物发生杂交的条件下，用步骤(b)的引物对进行PCR扩增反应，以及(d)检测是否存在扩增产物，以作为是否存在所述乳杆菌菌株的指示。应理解，在又一实施方案中，可以组合上述方法以鉴定乳制品中是否存在片球菌菌株和乳杆菌菌株。在又一方面中，本发明涉及分离的乳酸菌菌株，优选地涉及分离的乳酸菌菌株乳酸片球菌(由2009年9月25号以保藏号DSM 22981保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心的分离株代表)或其突变体或变体或者与所述菌株具有相同标志序列的细菌；或分离的乳酸菌菌株德氏乳杆菌乳酸亚种(由2010年9月28日以保藏号DSM 24025保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心的分离株代表)或其突变体或变体或者与所述菌株具有相同标志序列的细菌。本发明还公开了具有上述特性的乳酸菌菌株的分离的纯培养物。本文所用表述“纯培养物”表示包含本发明乳酸菌菌株单个分离株之生物质的培养物，即理论上源于一个细胞的克隆。这样的纯培养物可以作为液体细胞悬液或者作为冷冻、喷雾干燥的(或冻干的)制剂来提供。优选地，纯培养物是通过分离细胞(例如通过使用常规技术离心或过滤)而获得的细胞浓缩物。在又一方面中，本发明涉及培养物组合物，其包含一种上述纯培养物或乳酸菌菌 株以及微生物可接受的载体。根据本发明，组合物可包含两种或更多种上述纯培养物或乳酸菌菌株，并且可以任选地包含另外的乳酸菌菌株，例如除上述定义以外的选自乳球菌属菌种、乳杆菌属菌种、明串珠菌属菌种、魏斯氏菌属(Weissella)菌种、酒球菌属(Oenococcus)菌种、链球菌属菌种、双歧杆菌属(Bifidobacterium)菌种、丙酸杆菌属(Propionibacterium)菌种或片球菌属菌种。优选的菌株组合包括乳杆菌属和/或片球菌属和/或链球菌属菌种的组合。在一些可用的实施方案中，本发明的培养物组合物可以是发酵剂(starter)培养物或辅助非发酵剂培养物，优选辅助非发酵剂培养物。可优选地，这样的培养物组合物包含浓度为100 1000cfu/ml乳(针对乳酪生产)的至少一种本发明标志菌株。合适的载体物质包括营养物(如可吸收的碳水化合物或氮源)，其可被乳酸菌菌株容易地利用。通常，以冷冻或冻干组合物的形式提供这样的组合物。在后一情形中，组合物可以包含防冻化合物。因此，在另一方面中，本发明涉及上述乳酸菌菌株或纯培养物在乳制品(优选乳酪)生产中作为发酵剂培养物或辅助非发酵剂培养物或灭活培养物的用途。因此，本发明还涉及生产乳制品(如乳酪)的方法，其通过向乳中添加有效量的本发明乳酸菌菌株或组合物来实现。选择合适的细菌菌株以使其不影响乳酪制作过程和/或不影响乳酪质量，和/或使其在乳酪制作过程的条件下存活和/或使得能够在完整乳酪、碎乳酪和/或乳酪皮中对其进行检测以证实包含所述菌株之乳酪的来源。本文所用术语“乳”是指任何类型的鲜乳、复原乳、脱脂乳、半脱脂乳或全乳、巴氏消毒乳或乳组分，包括例如干物质含量为10 20 (重量的牛乳、水牛乳、山羊乳、母羊乳。使用常规方法步骤进行乳加工以获得乳制品(如乳酪)。通常，添加到乳中的乳酸菌菌株浓度为活细胞至少IO3CFU/克乳，优选为IO3 IO13CFU/克乳，如IO5 IO9CFU/克乳，例如IO6 IO8CFU/克乳。在另一方面中，本发明还涉及包含本发明乳酸菌菌株或纯培养物或其培养物组合物的乳制品(优选乳酪)。
因此，本发明还涉及本发明乳酸菌菌株或其纯培养物或其培养物组合物用于鉴定乳制品(优选乳酪)的用途以及因此标记用于鉴定和证明来源之乳制品的方法(其包括向乳酪发酵剂组合物中添加本发明的乳酸菌菌株或其纯培养物或其培养物组合物)的用途。在另一方面中，本发明还涉及用于特异性检测本发明之乳酸菌菌株或其纯培养物或其培养物组合物的试剂盒，其包含特异性针对所述乳酸菌菌株或其纯培养物或培养物组合物内独特定位之IS元件的区域以及所述独特定位之IS元件相邻的核酸序列区域的引物对。所述试剂盒可用于鉴定和证明乳制品的来源，其中来源的证明通过存在包含本发明引物对的上述乳酸菌菌株来指示。通过阅读仅以举例说明方式给出的以下描述和非限制性实施例，本发明的其它优点和特征将更加明显。从以上描述中，本领域技术人员显而易见除本文所述之外的多种改变。本文引用的多篇出版物的公开内容通过引用并以理解本发明所需的程度整体并入本文中。
实施例MM :所用细菌菌株/培养物包括市售菌株以及依照并满足国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约、以保藏号DSM 22981于2009年9月25日保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ)的乳酸片球菌菌株和以保藏号DSM 24025于2010年9月28日保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ)的德氏乳杆菌乳酸亚种。方法通过将IOg碎乳酪悬浮在P印ton水(I %蛋白胨、O. 5% NaCl和2%柠檬酸钠)中并在stomacher装置中在室温下混合3分钟来从乳酪中提取DNA。将IOml乳酪提取物与50ml SDS 10%混合，并以4000 Xg离心30分钟。弃去上清仅保留约1ml，并将其与沉淀一起转移到I. 5ml管中。离心(5分钟，IOOOOXg)后弃去上清液，将沉淀悬浮在950mlTES (O. Imol L~-lTris-HCl, IOmmol L~-1EDTA,25% (重量 / 体积)蔗糖，ρΗ8·0)和溶菌酶中。按照制造商的说明在用蛋白酶K孵育后用EZ DNATissue Kit(Qiagen)分离DNA。用包含2.5 μ L 10X 缓冲液(含 15mmol *L_1 MgCl2) (Applied Biosystems,FosterCity, CA)、0. 5 μ L 10mmol · L MNTP (Promega Corp. , Madison, WN)、0. 2 25 μ L 各引物(100 μ mo I *L_1) (Operon Technologies,Alameda,CA 或Microsynth Laboratory,Balgach,CH)和 0. 2 0. 25 μ L Taq DNA聚合酶(5U · μ L-1 AmpliTaq Gold) (Applied Biosystems)的 25 μ L反应混合物进行扩增。用GeneAmp PCR System (Applied Biosystems)进行扩增。根据制造商(Agilent Technologies,Palo Alto,CA)的说明利用Agilent 2100 Bioanalyser中的DNA 7500或DNA 1000 LabChip分离扩增产物。实施例I :菌株特异性PCR的开发为了寻找独特定位的插入序列，使用上游和下游的外向引物(outward facingprimer)组合来扩增IS之间的DNA区段。针对来自乳酸菌的几种不同IS设计这些引物(a)乳酸片球菌扩增程序包括95°C 10分钟的起始变性步骤；35个循环的95°C 30秒、54°C 30秒和72°C 8分钟，以及72°C 10分钟的最终延伸步骤。示例性引物对Z32771F0UT(5 ' -CGTTCGGAATAGGTTATACT ；SEQ ID NO :3)(针对戊糖片球菌(登录号Z32771)的蔗糖和棉子糖操纵子的9519-10424区设计)和ISSlPpR0UT(5/ -AGGCTGCTTGCGTATC ；SEQ ID NO :1)(针对嗜热链球菌(登录号 X94934)的ISSlSC转座酶基因设计)仅对本发明的乳酸片球菌菌株(保藏号DSM 22981)显示1700bp的PCR产物。用上述IS外向引物进行扩增子测序，针对IS邻近基因序列设计新引物。ISSlPpROUT(SEQ ID NO :I)和新设计的 G27 引物(5' -ATCGTCGAACGCCGCAAGAAAC ;SEQ IDNO 2)之间的PCR仅对本发明的乳酸片球菌菌株(保藏号DSM 22981)显示220bp的PCR产物。(b)德氏乳杆菌乳酸亚种扩增程序包括95°C 10分钟的起始变性步骤；35个循环的95°C I分钟、59°C I分钟和72°C 3分钟，以及72°C 7分钟的最终延伸步骤。示例性引物对c355a-3(5 ' -GGTGCAACTCTCTTCCTCGAA ；SEQ ID NO :4)(针对德氏乳杆菌保加利亚亚种(登录号NC_008529)的IS30家族转座酶设计)和c370-3(5/ -GGAAGGGCAAGCAGGATT ；SEQ ID NO :5)(针对瑞士乳杆菌(登录号 NC_010080)的转座酶基因设计)仅对本发明的德氏乳杆菌乳酸亚种菌株(保藏号DSM 24025)显示1210bp 的 PCR 产物。用上述IS外向引物进行扩增子测序，针对IS邻近基因序列设计新引物。新设计的针对德氏乳杆菌保加利亚亚种(登录号NC_008529)的IS30家族转座酶的Lbl02_F引物(5' -CTTAAACTACAAGACTCCAGAAGAA ；SEQ ID NO :6)和新设计的 19108/2010-17 引物 (5' -GGCATCAATTTATAGACGCCAAT ；SEQ ID NO :7)之间的PCR仅对本发明的德氏乳杆菌乳酸亚种菌株(保藏号DSM 24025)显示136bp的PCR产物。实施例2 :菌株特异性测试(a)乳酸片球菌使用针对嗜热链球菌ISSlSC的外向引物与引物G27 —起扩增本发明乳酸片球菌菌株(保藏号DSM 22981)的标志序列。为了确定标志序列仅存在于标志菌株中，对50种相关菌株、36种不用标志培养物生产的乳酪以及20种用标志培养物生产的乳酪检测标志序列。结果显示，所有菌株以及所有不带标志序列生产的全部乳酪均呈阴性，而所有用标志培养物生产的乳酪均呈阳性。(b)德氏乳杆菌乳酸亚种同样地，测试了 50种以上不同的德氏乳杆菌乳酸亚种菌株。结果显示，如所预期地，所有测试菌株均呈阴性。只有所测试的用标志培养物生产的乳酪呈阳性。
权利要求
1.鉴定乳制品中是否存在包含独特定位之IS元件的乳酸菌菌株的方法，所述方法包括 (a)从乳制品获得核酸样品， (b)提供如下引物对，其特异性针对所述独特定位之IS元件的区域以及与所述独特定位之IS元件相邻的核酸序列区域， (c)当所述独特定位之IS元件存在于所述核酸样品中时在适于产生扩增产物的条件下，用步骤(a)所述引物对进行PCR扩增反应，以及 (d)通过检测是否存在所述扩增产物来鉴定是否存在乳酸菌菌株。
2.权利要求I的方法，其中所述菌株选自片球菌属(Pediococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、乳球菌属(Lactococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus),优选乳杆菌属和片球菌属，以及它们的组合。
3.权利要求I或2的方法，其中所述乳酸菌菌株是于2009年9月25日以保藏号DSM 22981保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ)的乳酸片球菌(Pediococcusacidilactii)菌株和/或于2010年9月28日以保藏号DSM 24025保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心的德氏乳杆菌乳酸亚种(Lactobacillus delbmeckii subsp. lactis)菌株。
4.前述权利要求中任一项的方法，其中所述独特定位的IS元件与选自以下的IS元件具有至少 95%的同一性IS30、IS153、ISSU IS981、IS1076、ISLU ISLplU IS904 和 IS946序列或其部分。
5.前述权利要求中任一项的方法，其中所述引物对包含第一引物和第二引物，所述第一引物足以特异性针对IS元件的至少10个核苷酸、优选10 35个核苷酸，所述IS元件与选自以下的IS元件具有至少95%的同一性:IS30、IS153、ISSU IS981、IS1076、ISLUISLplI、IS904和IS946序列或其部分，所述第二引物足以特异性针对与所述IS元件相邻之核酸序列的至少10个核苷酸、优选10 35个核苷酸。
6.权利要求5的方法，其中所述乳酸菌菌株是于2009年9月25日以保藏号DSM22981保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ)的乳酸片球菌菌株，并且所述引物对包含SEQ ID NO 1的第一引物和SEQ ID NO 2的第二引物。
7.权利要求5的方法，其中所述乳酸菌菌株是于2010年9月28日以保藏号DSM24025保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ)的德氏乳杆菌乳酸亚种菌株，并且所述引物对包含SEQ ID NO 6的第六引物和SEQ ID NO 7的第七引物。
8.权利要求I的方法，其用于鉴定乳制品中是否存在乳酸片球菌，其包括以下步骤 (a)从乳制品获得核酸样品， (b)提供如下引物对，其中第一引物为SEQID NO :1，第二引物为SEQ ID NO :2， (c)在适合所述第一和第二引物发生杂交的条件下，用步骤(b)的所述引物对进行PCR扩增反应，以及 (d)检测是否存在扩增产物，以作为是否存在所述乳酸片球菌菌株的指示。
9.权利要求I的方法，其用于鉴定乳制品中是否存在德氏乳杆菌乳酸亚种，其包括以下步骤 (a)从乳制品获得核酸样品，(b)提供如下引物对，其中第六引物为SEQID NO :6，第七引物为SEQ ID NO :7， (c)在适合所述第六和第七引物发生杂交的条件下，用步骤(b)的所述引物对进行PCR扩增反应，以及 (d)检测是否存在扩增产物，以作为是否存在所述德氏乳杆菌乳酸亚种菌株的指示。
10.乳酸菌菌株乳酸片球菌或其突变体或变体或者与所述菌株具有至少93%的16SrRNA序列相似性的细菌，或者其纯培养物或其培养物组合物，所述菌株由2009年9月25日以保藏号DSM 22981保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ)的分离株代表。
11.乳酸菌菌株德氏乳杆菌乳酸亚种或其突变体或变体或者与所述菌株具有至少.93%的16S rRNA序列相似性的细菌，或者其纯培养物或其培养物组合物，所述菌株由2010年9月28日以保藏号DSM 24025保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ)的分离株代表。
12.权利要求10或11的乳酸菌菌株或其纯培养物或其培养物组合物作为发酵剂培养物或辅助培养物的用途。
13.权利要求12的用途，其用于生产乳制品、优选乳酪。
14.制备乳制品的方法，其包括向乳中添加有效量的权利要求10或11之乳酸菌菌株或其纯培养物或其培养物组合物或者它们的组合。
15.乳制品，其包含权利要求10或11的乳酸菌菌株或其纯培养物或其培养物组合物或者它们的组合。
16.权利要求10或11的乳酸菌菌株或其纯培养物或其培养物组合物或者其组合用于鉴定乳制品、优选乳酪的用途。
17.标记用于鉴定和证明来源之乳制品的方法，其包括向乳酪发酵剂组合物中添加权利要求10或11的乳酸菌菌株或其纯培养物或其培养物组合物或者它们的组合。
18.特异性检测权利要求10或11的乳酸菌菌株或其纯培养物或其培养物组合物或者他们的组合的试剂盒，其包含特异性针对所述乳酸菌菌株或其纯培养物或培养物组合物内独特定位之IS元件的区域以及与所述独特定位之IS元件相邻的核酸序列区域的引物对。
全文摘要
本发明涉及确定乳制品真伪和来源的新方法，更特别地涉及具有菌株特异性插入序列元件之乳酸菌菌株作为标记和鉴定乳制品(例如乳酪)的工具的用途。本发明还涵盖新的乳酸菌菌株、其在乳制品生产中的用途以及包含这些细菌菌株的乳制品。
文档编号C12Q1/68GK102884202SQ201080044442
公开日2013年1月16日 申请日期2010年10月1日 优先权日2009年10月1日
发明者海伦妮·贝尔图 申请人:农业领域利博菲尔德-波瑟Alp机构