专利名称：形成特异碱基对的人工碱基对的制作方法
技术领域：
本发明涉及双链核酸，在该双链核酸中，至少一条核酸链具有形成自己互补的碱基对的人工碱基，或者具有与任何天然型碱基均以相同程度的热稳定性形成碱基对的人工碱基。本发明还涉及使第一核酸与第二核酸杂交的方法，所述第一核酸具有形成自己互补的碱基对的人工碱基、或者具有与任何天然型碱基均以相同程度的热稳定性形成碱基对的人工碱基。本发明还进一步涉及将下述核酸用于SNP检测、DNA芯片、DNA/RNA计算、适用于体外翻译体系的方法，上述核酸具有形成自己 互补的碱基对的人工碱基、或者具有与任何天然型碱基均以相同程度的热稳定性形成碱基对的人工碱基。另外，本发明还涉及通过向核酸中导入形成自己互补的碱基对的人工碱基、或与任何天然型碱基均以相同程度的热稳定性形成碱基对的人工碱基，来控制该核酸杂交的热力学稳定性的方法。
背景技术：
DNA通过A-T和G-C碱基对形成的双链结构。通过利用该碱基对的互补性的DNA的杂交的双链形成广泛地应用于以DNA的检测为目的的DNA标签、Southern杂交等的DNA探针、DNA阵列、DNA的zip密码、TaqMan等Real time PCR技术、分子信标(MolecularBeacon)、或用于分离特定序列DNA的DNA亲和柱法、以及DNA计算机(DNA computer)等领域。就由A、G、C、T四种碱基构成的序列的组合而言，对于10个碱基链长的DNA也会有约IO6种(=410)巨大的数量。但是，即使在10个碱基的DNA中的一个位点上混入了 A-T和G-C以外的错误碱基对(G-T等错配碱基对)，根据条件的不同有时会形成双链(错误杂交(mishybridization)),从而无法进行正确的DNA检测。尤其是，由于与A-T碱基对相比，G-C碱基对热稳定性更高，因此即使对于相同长度的DNA，由于G-C碱基对含量的不同，这些双链DNA的稳定性也会有所不同。就G-C含量高的双链DNA而言，即使仅在该双链DNA中的一个位点中混入了错配碱基对，很多时候与G-C含量低的双链DNA相比也更为稳定。由于利用了杂交的应用技术全部在相同温度的同样条件下进行，因此非常重要是在使用多个DNA标签或探针时，各自的双链DNA的热稳定性相同。因此，在A-T和G-C碱基对中进一步加入人工制造的新碱基对增加了碱基序列的变化，并且如果通过增加新的碱基对，使得相同长度的不同双链DNA不依赖于各自的G-C含量而显示出相同的热稳定性，可以降低利用多个DNA标签或探针的方法的错误杂交，从而能够提高各种应用技术的精度。另外，如果可以制作如下探针，该探针能够选择性地识别与靶标DNA有I个碱基突变水平的匹配和错配，则可以提高SNP解析等方法的精度。就人工制作新的碱基对进行DNA的遗传信息扩张的技术而言，认为有通用性高的两个应用，人工碱基对的开发研究较为盛行。应用之一为制作发挥复制、转录、翻译功能的人工碱基对，从而制作组入了新的构成成分的DNA、RNA、蛋白质。另一个应用为，通过形成将人工碱基对组入到DNA、RNA中的双链核酸，增加核酸片段的探针的序列种类，从而应用于利用Realtime PCR的多重分析或DNA计算机,另外,可以用作通过翻译向蛋白质中导入人工氨基酸时的新密码子和反密码子。
S. A. Benner等人通过改变天然型碱基对的氢键形式的组合,制作出isoG_isoC碱基对等，并发现这些人工碱基对在双链DNA中选择性地形成碱基对(专利文献1-3、非专利文献I及2)。而且，J. R. Prudent等人使用isoG_isoC碱基对,制作新的DNA探针,设计出了多重PCR法(专利文献4、非专利文献3-6)。但是，由于这些碱基对具有氢键性取代基，因此需要制备在DNA合成时向这些碱基的取代基导入了保护基的DNA合成用亚磷酰胺(Amidite)试剂。本发明人等，为了扩张DNA的遗传信息而开发了第三碱基对(人工碱基对)。到目前为止，已经成功开发了 s_y碱基对(s :2_氨基-6-噻吩基嘌呤、y :吡啶-2-酮)、v-y碱基对(V :2_氨基-6-噻吩基嘌呤)、s_Pa碱基对(Pa :吡咯_2_甲醛),Ds-Pa碱基对(Ds -J- (2-噻吩基)-咪唑并[4，5-b]吡啶)、Ds-Pn碱基对(Pn :2_硝基吡咯)等在复制或转录中发挥功能的数种人工碱基对(专利文献5、非专利文献9及10)。但是，这些人工碱基，为了作为碱基对使用必须准备两种碱基的亚磷酰胺试剂。为了克服上述这些问题，如果不具有形成氢键的取代基的碱基自己互补地形成碱基对，则仅需要制备一种亚磷酰胺试剂，其利用明显变得容易。F. E. Romesberg等人制 作了这样自己互补的碱基对(非专利文献7-8)。他们制作的自己互补的碱基对(7-丙炔基-I-轻基异喹啉(7-propynyl isocarbostyril))比G-C碱基对更为稳定,且与天然型碱基形成的碱基对的稳定性降低了 7-ll°C。但是，该人工碱基无法通过自己互补地复制导入到DNA中，在形成自己互补碱基对时复制终止。此外，就目前为止开发的人工碱基对而言，尚不存在双链DNA中的人工碱基对与邻接的天然型碱基对的组合对DNA热稳定性的影响的详细调查报告。现有技术文献专利文献专利文献I :美国专利第5，432，272号专利文献2 :美国专利第6，140, 496号专利文献3 :美国专利第6，617，106号 专利文献4 :美国专利第6，977，161号专利文献5 :国际公开第W007/66737号小册子非专利文献非专利文献I S. A. Benner, Acc. Chem. Res.，37，784-797 (2004)非专利文献2 P. Sheng, et al.，Chem. Commun, 5128-5130(2008)非专利文献3 F. S. Nolte, et al.，J. Clin. Microbiol.，45，2779-2786 (2007)非专利 文献 4:E.S.Svarovskaia，et a I . , J. Clin.Microbiol. 44，4237-4241 (2006)非专利文献5 J. R. Prudent, Expert. Rev. Mol. Diagn. , 6, 245-252 (2006)非专利文献6 S. C. Johnson, et al.，Clin. Chem.，50，2019-2027 (2004)非专利文献7 :M. Berger, et al. , NucleicAcids Res.，28，2911-2914 (2000)非专利文献8 D. L. McMinn, et al. , J. Am. Chem. Soc. , 121，11585-11586(1999)非专利文献9 :M. Kimoto, et al, NucleicAcids Res. , 37, el4 (2009)非专利文献10 I. Hirao, et al.，Nature Methods, 3，729-735 (2006)
发明内容
发明要解决的问题本发明的目的在于提供一种双链核酸，在该双链核酸中，至少一条核酸链具有形成自己互补的碱基对的人工碱基、或者具有与任何天然型碱基均以相同程度的热稳定性形成碱基对的人工碱基。本发明的目的还在于提供一种使第一核酸与第二核酸杂交的方法，所述第一核酸具有形成自己互补的碱基对的人工碱基，或者具有与任何天然型碱基均以相同程度的热稳定性形成碱基对的人工碱基；本发明的目的还在于提供将下述核酸用于SNP检测、DNA芯片、DNA/RNA计算、适用于体外 翻译体系的方法，上述核酸具有形成自己互补的碱基对的人工碱基、或者具有与任何天然型碱基均以相同程度的热稳定性形成碱基对的人工碱基；另外，本发明的目的还在于通过向核酸中导入形成自己互补的碱基对的人工碱基、或与任何天然型碱基均以相同程度的热稳定性形成碱基对的人工碱基，来控制该核酸杂交的热力学稳定性的方法。解决问题的方法本发明人等为了解决上述问题进行了深入的研究，结果发现人工碱基Ds (7-(2-噻吩基)_咪唑并[4，5-b]吡啶)自己互补地在双链DNA中形成稳定的碱基对(Ds-Ds)(图I)。并且，发现双链DNA中的Ds-Ds碱基对的稳定性依赖于其两侧的天然型碱基对的种类。上述对于邻接碱基对的依存性是具有规律的，另外，本发明人等还发现对于包含Ds-Ds碱基对的双链DNA的稳定性而言，与含有较多G-C碱基对的双链DNA的稳定性高这一现有概念是不同的。此外了解到在Ds与天然型碱基形成碱基对时，与Ds-Ds碱基对相比，稳定性降低，但发现其具有与任何天然型碱基均以相同程度的稳定性形成碱基对的作为通用碱基的性质。此外，发现在Ds的噻吩部分进一步结合了噻吩的人工碱基Dss (7- (2，2 ’ - 二噻吩-5-基)咪唑并[4，5-b]卩比唳)也显示出同样的性质。发现就该Ds与天然型碱基的碱基对而言，如果在双链DNA中与其邻接的位点上存在天然型碱基之间的错配碱基对，则会显著地降低该双链DNA的热稳定性。该自己互补的Ds-Ds碱基对，作为第三碱基对可以用于杂交用新DNA标签的制作、在分子信标等成像技术中的利用、与Ds-Pa或Ds-Pn碱基对组合的复制或转录、在DNA、RNA计算机中的利用、作为用于将非天然型氨基酸导入到蛋白质中的新密码子和反密码子的利用等多方面。另外发现了 Ds和天然型碱基之间的碱基对，可以用于能够选择性识别靶标基因的单碱基突变的DNA探针。此外,还设计了利用简单的最邻近碱基法(Nearest neighbor法)，对作为包含Ds-Ds碱基对的双链DNA的热稳定性的指标的Tm值(Melting temperature)进行预测的方法。由此，可以制造错误杂交减少的DNA标签或探针。另外，发现双链DNA中的Ds和天然型碱基的碱基对(例如Ds-G碱基对)可以降低邻接的错配碱基对的稳定性。 以上，为了理解本发明，对想到本发明的过程进行了说明，但本发明的范围不限定于上述说明,应根据权利要求所述的内容来确定。作为一个例子，本发明提供以下的方式1-20。方式I : 一种双链核酸，其包含第一核酸和第二核酸，其中，所述第一核酸包含具有式I表示的人工碱基或其衍生物作为碱基的核苷酸(单个或多个)，[化学式I]
权利要求
1.一种双链核酸，其包含 第一核酸和第二核酸， 其中，所述第一核酸包含具有式I表示的人工碱基或其衍生物作为碱基的核苷酸(单个或多个)，
2.根据权利要求I所述的双链核酸，其中在式I表示的人工碱基中，A1 为 N;A2 为 CH ; R1为氢；而且 R2选自2-噻吩基、2-噻唑基、2-咪唑基、2，2’ - 二噻吩-5-基、2-(2-噻唑基)噻吩-5-基、5-(2-噻吩基)噻唑-2-基、及2，2’，5’，2”-三联噻吩-5-基。
3.根据权利要求I所述的双链核酸,其中， 式I表示的人工碱基或其衍生物为 7-(2-噻吩基)咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基(Ds);或 7-(2, 2’ - 二噻吩-5-基)咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基(Dss);或 它们的衍生物。
4.根据权利要求I所述的双链核酸,其中， 式I表示的人工碱基的衍生物为式I中R2表示的取代基通过取代基的添加而进一步被修饰的衍生物。
5.根据权利要求1 4中任一项所述的双链核酸，其中， 第一核酸包括多个具有式I表示的人工碱基或其衍生物作为碱基的核苷酸，条件是所述具有人工碱基或其衍生物作为碱基的多个核苷酸在第一核酸的核苷酸链中彼此不邻接。
6.根据权利要求1 5中任一项所述的双链核酸,其中,在第一核酸中， 与具有式I表示的人工碱基或其衍生物作为碱基的核苷酸的5’侧邻接的核苷酸为胞嘧啶(C)或胸腺嘧啶(T)，且/或与所述核苷酸的3’邻接的核苷酸为鸟嘌呤(G)。
7.—种使含人工碱基的核酸杂交的方法,其包括 使第一核酸与第二核酸杂交， 所述第一核酸包含具有式I表示的人工碱基或其衍生物作为碱基的核苷酸，
8.根据权利要求7所述的方法，其中，第一核酸为杂交用探针、标签或引物。
9.根据权利要求7所述的方法，其中，第一核酸及第二核酸为DNA计算机用计算元件。
10.根据权利要求7所述的方法，其中，第一核酸及第二核酸为DNA或RNA折纸用集成元件。
11.根据权利要求疒10中任一项所述的方法，其中，杂交以多重方式进行。
12.一种鉴定单碱基突变的方法，其包括以下步骤 (a)制备与包含靶标核酸中待鉴定的单碱基突变位点的序列互补的探针，其中所述探针含有具有式I表示的人工碱基或其衍生物作为碱基的核苷酸，且所述核苷酸和与所述待鉴定的单碱基突变位点互补的核苷酸邻接，
13.一种鉴定单碱基突变的方法，其包括以下步骤 (a)制备与包含靶标核酸中待鉴定的单碱基突变位点的序列互补的引物，其中所述引物含有具有式I表示的人工碱基或其衍生物作为碱基的核苷酸，且所述核苷酸和与所述待鉴定的单碱基突变位点互补的核苷酸邻接，
14.一种使用含人工碱基的探针来捕获核酸的方法，其包括以下步骤 (a)制备包含具有式I表示的人工碱基或其衍生物作为碱基的核苷酸的探针，并将其固定于固相，
15.根据权利要求14所述的方法，其中，固相为DNA芯片基板或珠。
16.一种进行DNA或RNA计算的方法，其包括以下步骤 (a)制备多个包含具有式I表示的人工碱基或其衍生物作为碱基的核苷酸的核酸作为计算元件，其中一个计算元件的一部分与其它计算元件的一部分是互补的，设置所述具有式I的人工碱基或其衍生物作为碱基的核苷酸，使得在计算元件的互补的部分之间相互形成喊基对；
17.一种形成DNA或RNA折纸的方法，其包括以下步骤 (a)制备多个包含具有式I表示的人工碱基或其衍生物作为碱基的核苷酸的核酸作为集成元件，其中一个集成元件的一部分与其它集成元件的一部分是互补的，设置所述具有式I的人工碱基或其衍生物作为碱基的核苷酸，使得在集成元件的互补的部分之间相互形成喊基对；
18.—种通过体外翻译体系合成肽的方法，其包括以下步骤(a)制备在反密码子位点含有具有式I表示的人工碱基或其衍生物作为碱基的核苷酸的转运RNA ；
19.一种控制核酸杂交的热力学稳定性的方法，其包括 将核酸中的核苷酸取代为具有式I表示的人工碱基或其衍生物作为碱基的核苷酸，
20.根据权利要求19所述的方法，其中，核酸为探针、引物、或分子内杂交的单链核酸。
全文摘要
本发明提供双链核酸，在该双链核酸中，至少一条核酸链具有形成自己互补的碱基对的人工碱基、或者具有与任何天然型碱基均以相同程度的热稳定性形成碱基对的人工碱基。本发明还提供使第一核酸与第二核酸杂交的方法，所述第一核酸具有形成自己互补的碱基对的人工碱基，或者具有与任何天然型碱基均以相同程度的热稳定性形成碱基对的人工碱基。以及本发明还进一步提供将上述核酸用于SNP检测、DNA芯片、DNA/RNA计算、适用于体外翻译体系的方法。另外，本发明还提供通过向核酸中导入人工碱基来控制该核酸杂交的热力学稳定性的方法。
文档编号C12Q1/68GK102741266SQ20108005537
公开日2012年10月17日 申请日期2010年10月6日 优先权日2009年10月6日
发明者平尾一郎, 平尾路子, 横山茂之 申请人:塔古西库斯生物株式会社