专利名称：用于处理纤维素材料的方法和适用于该方法的cbhii/cel6a酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种采用真菌CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶或含有所述酶的酶制剂来处理纤维素材料的方法。所述酶适用于 各种工业用途，特别适用于生物燃料的生产，其中可有利地在中到高温的范围内从木质纤维材料中生产可发酵糖。本发明还涉及真菌CBHII/Cel6A多肽以及编码所述酶的独立的核酸分子、重组载体、生产所述酶的宿主细胞、含有所述酶的酶组合物，以及这些组合物的制备方法。本发明还涉及所述酶或酶组合物的各种应用，其中需要对纤维素或木质纤维材料进行酶转化。
背景技术：
有限的化石燃料资源、由其释放出的越来越多的二氧化碳以及所引起的温室现象提出了使用生物质作为可再生和清洁能源的需求。一种有希望的替代技术是生物燃料的生产，如从纤维素材料中制备乙醇、丁醇或丙醇。在运输领域中，生物燃料暂时是唯一的选择，其能够将二氧化碳排放量减少一个数量级。乙醇可以用于现有的车辆和分布系统，因此不需要昂贵的基础设施投资。源自纤维素和木质纤维可再生原料的糖还可以用作用于可取代石油基化学品的各种化学产品的原料。植物中的大多数碳水化合物以木质纤维素的形式存在，其实质上是由纤维素、半纤维素和木质素组成。在传统的由木质纤维素生产乙醇的方法中，木质纤维材料首先进行化学或物理的预处理，使用酸水解、蒸汽爆破、氨纤维膨胀、碱性湿态氧化或臭氧预处理，以使纤维素成分更易于酶解。然后，纤维素成分被水解后，获得可以通过酵母发酵成乙醇再蒸馏而获得纯乙醇的糖。木质素是作为可以用作固体燃料的主要副产品而获得的。在这种单独的水解和发酵(SHF)过程中，酶水解温度一般高于发酵温度。水解过程中使用耐热酶提供了潜在优点，如在高温体下的较高反应速率，由于较高的比活和酶寿命而减少酶的用量，增大了流程配置和更好的卫生方面的灵活性。为使生物乙醇生产过程更加经济而进行了持续的研究。其中一种选择是同步糖化和发酵(SSF)法。其主要优点是降低酶水解的终产物抑制，并减少了投资成本。其挑战是寻找酶水解和发酵的有利条件，例如温度和PH值。在综合生物过程(CBP)中，外部添加的酶量可以通过利用能够产生一组木质纤维素酶的发酵生物质或生物乙醇而大大减少。近年来，用于乙醇生产的微生物代谢工程已取得重大进展。除了酿酒酵母外，微生物如细菌属发酵单胞菌和大肠杆菌以及酵母如树干毕赤酵母、脆壁克鲁维酵母已经被确定可用于从纤维素中制备乙醇。在SSF法中，抑制剂和耐热性以及利用多种糖的能力都是发酵微生物的重要特性。已经开发的工程酵母菌除葡萄糖外还能够发酵戊糖、木糖和阿拉伯糖。嗜热微生物如解糖热厌氧杆菌或热纤梭菌已经用于在50 60°C的高温条件下将糖、包括木糖发酵成乙醇(嗜热SSF或TSSF)。这种发酵生物质也有用于CBP的潜力(Shaw等人，2008)。酶水解被认为是用于将纤维素生物质转化为可发酵糖的最有前途的技术。然而，酶水解仅用于有限数量的工业规模，尤其是在使用高度木质化的材料如木材或农业废弃物时，该技术并不令人满意。已经进行了提高纤维素材料的酶水解效率的工作(Badger，2002 ；Kurabi 等人，2005)。W02001060752 (丹麦Forskningscenter R丨so)公开了一种将固体木质纤维素生物质转化为可燃性燃料产品的连续式方法。在用湿法氧化或蒸汽爆破进行预处理后，生物质被部分地分为纤维素、半纤维素和木质素，然后再使用一种或多种糖酶进行部分水解(EC3. 2)。W02002024882 (加拿大Iogen Bio-Products公司)涉及一种通过采用含有纤维素酶和利用灭活其纤维素接合域(CBD)获得的改性纤维二糖水解酶I (CBHI)的酶混合物对经预处理的木质纤维基质进行处理来将纤维素转化为葡萄糖的方法。US2004/0005674 (美国Athenix公司)公开了可以直接用于木质纤维素基质的新型的酶混合物。协同酶混合物包含纤维素酶，以及诸如纤维素酶、木聚糖酶、木质酶、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶或葡萄糖苷酸酶或其任何组合的辅助酶。纤维素酶被视为包括内切葡聚糖酶(EG)、β-葡萄糖苷酶(BG) 和纤维二糖水解酶(CBH)。US20050164355 (美国Novozymes Biotech公司)公开了一种采用一种或多种选自EG、BG和CBH的纤维素分解酶在至少一种表面活性剂存在的条件下降解纤维素材料的方法。也可以使用其他的酶，如半纤维素酶、酯酶、过氧化物酶、蛋白酶、漆酶或其混合物。研究最多、应用最广泛的真菌来源的纤维素分解酶源自里氏木霉(无性型红褐肉座菌)。已有源自更不为人所知的真菌的纤维素酶被公开。Hong等人(2003a和2003b)表征了耐热子囊菌的EG和CBHI及其用于酵母的生产。Tuohy等人(2002)公开了三种类型的纤维二糖水解酶，包括来自埃默森篮状菌的CBHI和 CBHII。将纤维二糖水解酶I (CBHI)、即糖基水解酶家族7中的成员用于纤维素材料的酶转化是公知的，例如见W003/000941(丹麦Novozymes公司)，其涉及从不同真菌获得的CBHI酶。W02005074656 (美国Novozymes公司)披露了源自如耐热子囊菌的具有纤维素分解活性的多肽。W02007071818 (芬兰Roal公司)公开了通过酶转化以及含有所述酶的酶制剂从纤维素材料中制备糖水解产物的方法。所述方法中使用的酶包括耐热纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶、β -葡萄糖苷酶，以及可选的源自耐热子囊菌、嗜热枝顶孢霉或嗜热毛壳菌的木聚糖酶。在几种应用中已公开了纤维二糖水解酶II。W02004056981 (丹麦Novozymes公司)披露了具有纤维二糖水解酶II活性的多肽，编码该多肽的多聚核苷酸，以及用于制备多肽并将多肽用于实际应用、如生产乙醇的方法。所公开的全长DNA序列来自塔宾曲霉、嗜热毛壳菌、嗜热毁丝霉，以及梭孢壳属菌、嗜热枝顶包酶、囊状长毛盘菌、环纹束梗孢菌和樟绒枝霉。专利EP 1578964Β1 (丹麦Novozymes公司)披露了嗜热毛壳菌CBHII和多肽的全长氨基酸序列，该多肽由核苷酸序列编码，并在严谨的条件下与编码所述酶的核苷酸序列的片段杂交。CN1757709 (中国山东农业大学)披露了嗜热毛壳酶CT2的嗜热CBHII酶的核苷酸序列及其在毕赤氏酵母菌菌体中的表达。这种酶能够转化废弃纤维材料。
W02006074005 (美国Genencor Int.公司)披露了红褐肉座菌(里氏木霉)CBHII/Ce 16A酶的变异体。变异体酶是有用的，例如用于乙醇生产。W02007094852(美国Diversa公司和美国Verenium公司)披露了纤维素分解酶、编码该酶的核酸及其生产和使用方法。所述酶可以是内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β -葡萄糖苷酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、β -木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶或寡聚酶。所述酶及酶混合物例如可用于制备燃料或生物乙醇。
W02008095033 (瑞士 Syngenta公司和美国Verenium公司)披露了具有木质纤维素分解活性的酶，包括纤维二糖水解酶，其例如可用在制备燃料和加工生物质材料中。W02009045627 (美国Verenium公司)披露了采用具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性并且在提高PH值和温度条件下活性提高且稳定的酶类来分解半纤维素的方法。W02009089630 (加拿大Logen Energy公司)披露了通过葡萄糖减少抑制并含有一个或多个氨基酸取代基的纤维素酶家族6的变异体。W02009059234 (美国Novozymes公司)披露了生产在氧化还原活性金属离子中还原的纤维素材料的方法，其可用于降解或转化纤维素材料并制备发酵产物。实际应用披露了例如嗜热毛壳酶的CBHII的多肽。W02009085868 (丹麦Novozymes公司)披露了编码酶的多肽、多聚核苷酸，以及用于制备发酵产品的方法，包括采用包含有所述多肽的纤维素分解酶组合物来糖化纤维素材料。这种纤维二糖水解酶可以来自里氏木霉、特异腐质霉、嗜热毁丝霉、太瑞斯梭壳孢霉和嗜热毛壳菌。W02006074435和US2006218671 (美国Novozymes公司)披露了太瑞斯梭壳孢霉Cel6A纤维二糖水解酶的核苷酸及氨基酸序列。US7220565 (美国Novozymes公司)披露了具有提高的纤维素分解活性以及与嗜热毁丝霉CBHII的成熟氨基酸序列的一致性的多肽。US2OO7O238I55 和 US20090280105 (美国 Genencor Int.公司)披露了含有来自Chrysosporium Iucknowense的新型酶的酶组合物，例如含有属于糖基水解酶家族6的CBHIIa和CBHIIb酶。该酶组合物对于木质纤维材料的水解很有效。Galagan等人(2003)披露了粗糙链孢菌0R74A的基因组序列，包括外切葡聚糖酶2前体的序列。Collins等人(2003)披露了埃默森篮状菌CBHII/Cel6A的编码序列。生物燃料如可再生的运输燃料的市场预计在不久的将来将大大增涨。结果，人们对于使用替代性原料来生产生物燃料的兴趣日渐迅速增长。利用存在于植物和森林或市政垃圾中的纤维素生物质来发酵制备乙醇和其他醇成为补充化石燃料的燃料的一种有吸引力的途径。由纤维素和木质纤维素生物质制备生物燃料的一个障碍是细胞壁的坚固性和无法以聚合物的形式存在的糖单体，其需要大量的加工来使糖单体成为通常用来通过发酵生产酒精的微生物。因此，存在对于提高纤维素和木质纤维基质的降解效率的新方法，以及新酶和酶混合物的持续需求。特别是，需要那种能够攻击结晶纤维素材料的不同糖苷键并由此对不同的待处理材料进行几乎完全的水解的酶和酶混合物。亦即，需要这样的酶，其在高的处理温度下稳定，由此能够利用生物量的高度一致性，产生较高的糖和乙醇浓度。这种方法可以致使能源和投资成本大大节省。高温也减少了水解过程中污染的危险。本发明的目的是至少解决这些需求中的一部分。
发明内容
本发明的目的是提供用于提高纤维素水解效率的新型的酶和酶组合物。可以从嗜热枝顶孢霉、黑果白丝菌(Melanocarpus albomyces)、嗜热毛壳菌或埃默森篮状菌中获得的纤维二糖水解酶以及特别是纤维二糖水解酶II可用于水解和降解纤维素材料。所述酶在广泛的温度范围内在动力学上非常有效，并且尽管它们在高温下具有高活性，然而它们在标准水解温度下也非常高效。这使得它们极其适合于在常温和高温下进行的不同的纤维素基质水解过程。本发明涉及一种采用CBHII/Cel6A多肽或含有所述多肽的酶制剂或产生所述多肽的发酵微生物来处理纤维素材料的方法，所述方法包括以下步骤i)制备本发明的
CBHII/Ce16A多肽或者含有所述多肽的酶制剂或者产生所述多肽的发酵微生物；ii)将纤维素材料与本发明的CBHII/Cel6A多肽或者含有所述多肽的酶制剂或者产生所述多肽的发酵微生物反应；以及iii)获得部分或完全水解的纤维素材料。在所述方法中使用的CBHII/Cel6A多肽具有纤维二糖水解酶活性，并且含有这样的氨基酸序列，其与SEQIDNO: 12的全长多肽具有至少76%的一致性，与SEQ ID NO: 14的全长多肽具有至少76%的一致性，与SEQ ID NO: 15的全长多肽具有至少95%的一致性，或者与SEQ ID NO: 16的全长多肽具有至少91%的一致性。所述CBHII/Cel6A多肽也可以是具有类似特性如类似的底物特异性以及PH值和温度的依赖性或稳定性的片段或变异体。在所述方法中使用的CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶是糖基水解酶家族6中的纤维二糖水解酶II酶,其兼具水解反应的保守折叠和立体化学结构。适用于所述方法的CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶可从枝顶孢霉属、黑果属、毛壳菌属或篮状菌属中获得，更优选地源自于嗜热枝顶孢霉、黑果白丝菌、嗜热毛壳菌或埃默森篮状菌，最优选地源自于保藏菌株嗜热枝顶孢霉CBS 116240、黑果白丝菌CBS 685. 95、嗜热毛壳菌CBS 730. 95或埃默森篮状菌DSM 2432。适用于所述方法的CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶能够在中到高温条件下水解不同的纤维素材料，特别是与另外的酶相结合而用于水解各种纤维素或木质纤维材料。本发明的CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶适用于各种用途，特别是用于生物燃料的生产。本发明还涉及新型的CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶，其具有纤维二糖水解酶活性，并且含有如下的氨基酸序列，其与SEQ ID NO: 12的全长多肽具有至少76%的一致性，与SEQ ID NO: 14的全长多肽具有至少76%的一致性，与SEQ ID NO: 15的全长多肽具有至少95%的一致性，或者与SEQ ID NO: 16的全长多肽具有至少91%的一致性。所述CBHII/Cel6A多肽也可以是具有类似特性如类似的底物特异性以及pH值和温度的依赖性或稳定性的片段或变异体。所述CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶能够在中到高温的条件下水解纤维素材料。所述酶由独立的核酸分子编码，该核酸分子含有编码本发明的多肽的多聚核苷酸序列。优选地，所述核酸含有如 SEQ IDNO: IUSEQ IDNO:13,SEQ IDN0:9 或 SEQ IDNO: 10 PJf定义的多聚核苷酸序列或其子序列。本发明的CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶可以由独立的核酸分子编码，所述核酸分子在严谨的条件下杂交到 SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 10、SEQID N0:7或SEQ ID NO:8所含的多聚核苷酸序列或其子序列。所述酶由保存于在登记号为DSM 22946的大肠杆菌中的质粒pALK2582、保存于在登记号为DSM 22945的大肠杆菌中的质粒pALK2581、保存于在登记号为DSM 22947的大肠杆菌中的质粒PALK2904或保存于在登记号为DSM23185的大肠杆菌中的质粒pALK3006中所包含的独立的多聚核苷酸来编码。本发明中的CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶可以从含有编码所述纤维二糖水解酶的核酸分子或核苷酸序列的重组表达载体中制备。所述纤维二糖水解酶多肽可以在异源宿主、优选微生物宿主内制备。本发明还涉及一种独立的核酸分子，其包括编码真菌CBHII/Cel6A多肽的多聚核苷酸序列，其选自 (a) 一种编码多肽的核酸分子或多聚核苷酸序列，该多肽具有纤维二糖水解酶活性，并含有如 SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15 或 SEQ ID NO: 16 所列的全长氨基酸序列，或者是具有类似特性的其片段或变异体；(b) 一种编码多肽的核酸分子或多聚核苷酸序列，该多肽具有纤维二糖水解酶活性，并且与SEQ ID NO: 12的全长氨基酸序列具有至少76%的一致性，与SEQ ID NO: 14的全长氨基酸序列具有至少76%的一致性，与SEQ ID NO: 15的全长氨基酸序列具有至少95%的一致性，或者与SEQ ID NO: 16的全长氨基酸序列具有至少91%的一致性，或者是具有类似特性的其片段或变异体；(c) 一种核酸分子，其含有如 SEQ ID NO: IUSEQ ID NO: 13,SEQ ID N0:9 或 SEQIDNO: 10所列的多聚核苷酸序列的编码序列；(d) 一种核酸分子,其含有 DSM 22946、DSM 22945、DSM 22947 或 DSM 23185 所包含的多聚核苷酸序列的编码序列；(e) 一种核酸分子，其编码序列由于遗传密码的降解而与(C) (d)中任一种核酸分子的编码序列不同；以及(f) 一种在严谨条件下杂交到 DSM 22946,DSM 22945,DSM 22947 或 DSM 23185 所包含的核酸分子上且编码多肽的核酸分子，该多肽具有纤维二糖水解酶活性，并且具有与SEQ ID NO: 12的全长氨基酸序列具有至少76%的一致性，与SEQ ID NO: 14的全长氨基酸序列具有至少76%的一致性，与SEQ ID NO: 15的全长氨基酸序列具有至少95%的一致性，或者与SEQ ID NO: 16的全长氨基酸序列具有至少91%的一致性的氨基酸序列，或者是具有类似特性的其片段或变异体。本发明进一步涉及一种重组表达载体，其含有可操作地连接到能够在合适宿主中直接表达编码本发明的CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶的基因以及产生所述CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶的调控序列上的本发明的核酸分子或多聚核苷酸序列。本发明还涉及含有上述重组表达载体的宿主细胞。优选地，所述宿主为微生物宿主,例如丝状真菌宿主。优选的宿主为木霉属、曲霉属、镰刀霉属、腐质霉属、金孢霉属、脉孢菌属、根霉属、青霉属和被孢酶属。更优选地是，所述宿主为木霉属或曲霉属，最为优选地是丝状真菌里氏木霉。本发明涉及一种制备具有纤维二糖水解酶活性的本发明的多肽的方法，所述方法包括培养本发明的宿主细胞以及收集所述多肽的步骤。在本发明中还包括一种由本发明的核酸分子编码的具有纤维二糖水解酶活性的多肽，其通过上述方法获得。本发明还涉及一种用于获得酶制剂的方法，其包括培养本发明的宿主细胞，以及制备全培养肉汤，或者从用过的培养基中分离细胞并获得上清液的步骤。在本发明中还包括一种通过上述方法获得的酶制剂。本发明还涉及一种酶制剂，其包括本发明的CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶。所述酶制剂可以进一步包括选自如下集合中的其它的酶纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶、葡萄糖苷酶、葡聚糖酶、木葡聚糖酶、木聚糖酶、木糖苷酶、甘露聚糖酶、β -甘露糖苷酶、α -葡萄糖苷酸酶、乙酰基木聚糖酯酶、α -阿拉伯呋喃糖苷酶、α -半乳糖苷酶、果胶酶、内切a-L-阿拉伯糖酶和外切a-L-阿拉伯糖酶、α-半乳糖苷酶、内切半乳糖醛酸酶和外切半乳糖醛酸酶、内切果胶裂解酶、果胶酸盐裂解酶和果胶(甲)酯酶、苯酚酯酶、包括过木质素过氧化物酶的木质酶、锰过氧化物酶、H2O2-生成酶以及有介体或无介体的漆酶。所述酶制剂以全培养肉汤或用过的培养基的形式存在。它也可以液体、粉末或者 颗粒的形式存在。在本发明中还包括了本发明的CBHII/Cel6A多肽或酶制剂在制备生物燃料、洗涤齐IJ、处理纤维、处理食物或饲料、纸浆和纸、饮料或任何涉及纤维素材料水解或改性用途中的应用。特别是，所述CBHII/Cel6A多肽或含有所述多肽的酶制剂可用于制备生物燃料。
图I示意性显示了在用于高效制备重组CBHII/Cel6A蛋白质的里氏木霉原生质体的转化过程中所使用的表达框。cbh2/cel6A基因在里氏木霉cbhl/cel7A启动子(p cbhl)的调控下，并且通过使用里氏木霉cbhl/cel7A终止子序列(t cbhl)来确保转录的终止。还包括作为转化标记的amdS基因。图2显示了含有嗜热枝顶孢霉CBS 116240、黑果白丝菌CBS 685.95、嗜热毛壳菌CBS 730. 95和埃默森篮状菌DSM 2432的重组CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶的酶组合物(100 μ g蛋白的反应)的pH值依赖性的测定。在3-10的pH值范围内在50°C下对AvicelPh101纤维素进行21h的水解。利用纤维二糖标准曲线通过对羟基苯甲酸酰肼(PAHBAH)法(Lever, 1972)来测定还原性糖的生成。图3显示了含有嗜热枝顶孢霉CBS 116240、黑果白丝菌CBS 685.95、嗜热毛壳菌CBS 730. 95和埃默森篮状菌DSM 2432的重组CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶的酶组合物(100 μ g蛋白的反应)的热稳定性的测定。在40-80°C的温度范围内在酶组合物的最佳pH值下对Avicel Ph 101纤维素进行21h的水解。利用纤维二糖标准曲线通过对羟基苯甲酸酰肼(PAHBAH)法(Lever，1972)来测定还原性糖的生成。图4显示了采用含有本发明的CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶的酶混合物对蒸汽爆破的硬木材料进行水解的结果。硬木底物在55°C和37°C下以每克总干物质5mg蛋白质的剂量采用不同的酶混合物进行水解。含有At_ALK04245_Cel6A、Ma_ALK04237_Cel6A或Ct_ALK04265_Cel6A的嗜热酶混合物(混合物2)和嗜温酶混合物(混合物里氏木霉酶和混合物ACC)的组合物的详细说明见实施例4。水解72小时后从平行试验的摇瓶中取样，并用HPLC定量，测定葡萄糖和木糖的含量。从采用酶混合物所得的结果中减去以缓冲溶液替代酶样品的底物空白样的结果。就得 到木糖和葡萄糖的总含量。图4A 显示了采用补加有 At_ALK04245_Cel6A (混合物 2_AT)、Ma_ALK04237_Cel6A(混合物2_MA)或Ct_ALK04265_Cel6A (混合物2_CT)的嗜热酶混合物(混合物2)在55°C下对蒸汽爆破的硬木进行水解的结果。图4B 显示了采用补加有 At_ALK04245_Cel6A(混合物 TR_AT)、Ma_ALK04237_Cel6A(混合物TR_MA)或Ct_ALK04265_Cel6A (混合物TR_CT)的嗜温酶混合物(混合物里氏木霉酶)在37°C下对蒸汽爆破的硬木进行水解的结果。图4C 显示了采用补加有 At_ALK04245_Cel6A (混合物 ACC_AT)、Ma_ALK04237_Cel6A (混合物ACC_MA)或Ct_ALK04265_Cel6A (混合物ACC_CT)的嗜温酶混合物(混合物ACC)在37 °C下对蒸汽爆破的硬木进行水解的结果。图5显示了采用含有本发明的CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶的酶混合物对蒸汽爆破的玉米棒材料进行水解的结果。玉米棒底物在55°C下以每克总干物质5mg蛋白质的剂量采用不同的酶混合物进行水解。含有本发明的At_ALK04245_Cel6A多肽(混合物2_AT)的嗜热酶混合物(混合物2)的组合物的详细说明见实施例5。水解72小时后从平行试验的摇瓶中取样，并用HPLC定量，测定葡萄糖和木糖含量。从采用酶混合物所获得的结果中减去以缓冲溶液替代酶样品的底物空白样的结果。得到葡萄糖和木糖的总含量。序列表SEQ ID NO: I低聚核苷酸引物CBH_1S的序列SEQ ID NO:2低聚核苷酸引物CBH_1AS的序列SEQ ID N0:3低聚核苷酸引物CBH_8的序列SEQ ID NO:4低聚核苷酸引物CBH_9的序列SEQ ID NO:5低聚核苷酸引物Te_CBH_A的序列SEQ ID NO:6低聚核苷酸引物Te_CBH_B的序列SEQ ID NO: 7采用引物CBH_1S和 CBH_1AS从嗜热枝顶孢霉ALK04245 (CBS 116240)中获得的PCR片段的序列SEQ ID N0:8 采用引物 CBH_1S 和 CBH_1AS 从黑果白丝菌 ALK04237 (CBS 685.95)中获得的PCR片段的序列。SEQ ID NO: 9 嗜热毛壳菌 ALK04265 (CBS 730. 95) cbh2/cel6A 基因的核苷酸序列。SEQ ID NO: 10埃默森篮状菌RF8069 (DSM 2432) cbh2/cel6A基因的核苷酸序列。SEQ ID NO: 11 嗜热枝顶孢霉 ALK04245 (CBS 116240) cbh2/cel6A 基因的核苷酸序列。SEQ ID NO: 12 嗜热枝顶孢霉 ALK04245 (CBS 116240) CBHII/Cel6A 的推导氨基酸序列。SEQ ID勵13黑果白丝菌么1^04237(085 685. 95) cbh2/cel6A基因的核苷酸序列。SEQ ID N0:14 黑果白丝菌 ALK04237(CBS 685. 95) CBHII/Cel6A 的推导氨基酸序列。SEQ ID NO: 15 嗜热毛壳菌 ALK04265 (CBS 730. 95) CBHII/Cel6A 的推导氨基酸序列。
SEQ ID NO: 16 埃默森篮状菌 RF8069 (DSM 2432) CBHII/Cel6A 的推导氨基酸序列。菌种保藏嗜热枝顶孢霉ALK04245于2004年9月20日保存于位于荷兰Upsalalaan8，3584CT, Utrecht的荷兰微生物菌种保藏中心(CBS)，登记号为CBS 116240。嗜热毛壳菌ALK04265于1995年11月8日保存于位于荷兰Oosterstraat1，3742SKBAARN的荷兰微生物菌种保藏中心(CBS)，登记号为CBS 730. 95。在当前的保存期终止后，样本将根据协议保存，以便在超过专利保护期限后仍可获得菌株。黑果白丝菌ALK04237于1995年10月11日保存于位于荷兰Oosterstraat I, 3740AG BAARN的荷兰微生物菌种保藏中心(CBS)，登记号为CBS 685.95。在当前的保存期终止后，样本将根据协议保存，以便在超过专利保护期限后仍可获得菌株。包含质粒pALK2582的大肠杆菌菌株RF8175于2009年9月9日保存于位于德国Inhoffenstrasse 7B, D_38124Braunschweig的德国微生物菌种保藏中心(DSMZ),登记号为 DSM 22946。包含质粒pALK2581的大肠杆菌菌株RF8174于2009年9月9日保存于位于德国Inhoffenstrasse 7B, D_38124Braunschweig的德国微生物菌种保藏中心(DSMZ),登记号为 DSM 22945。包含质粒pALK2904的大肠杆菌菌株RF8214于2009年9月9日保存于位于德国Inhoffenstrasse 7B, D_38124Braunschweig的德国微生物菌种保藏中心(DSMZ),登记号为 DSM 22947。包含质粒pAL 3006的大肠杆菌菌株RF8333于2009年12月10日保放于位于德国Inhoffenstrasse 7B, D_38124Braunschweig的德国微生物菌种保藏中心(DSMZ),登记号为 DSM 23185。
具体实施例方式本发明提供了一种利用CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶多肽或含有所述多肽的酶组合物来处理纤维素材料的方法。本发明还提供了一种真菌CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶多肽或含有所述CBHII/Cel6A多肽的酶组合物，所述多肽显示出广泛的底物特异性，并且能够在广泛的PH值和温度范围内稳定。其在中温和高温下均具有良好的性能。特别是，CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶多肽在高达70°C的条件下、优选在40_60°C的温度范围内至少能够稳定21小时。多肽和含有所述多肽的酶组合物在要求高效水解纤维素是其主要成分之一的复合纤维素或木质纤维素材料的不同应用中都很理想。多肽和酶组合物例如可以用于水解纤维素材料，以便从高分子原料中制备糖单体，然后再通过微生物发酵以生产生物燃料。因此，本发明提供了用于生物燃料和其他实际应用的替代性的CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶。真菌CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶可以在高产真菌宿主中生产，可以有或没有下游加工，例如发酵液和菌丝的分离很容易进行，或者在发酵生物机体中制备。本发明所用的用语“纤维素”或“纤维素材料”指含有纤维素作为主要组分的任何材料。纤维素是高等植物的主要结构组分。它为植物细胞提供高抗张强度，帮助它们抵抗机械应力和渗透压。纤维素是一种由通过β-1，4-糖苷键相连的葡萄糖残基的直链构成的β-1，4-葡聚糖。纤维二糖是纤维素的最小重复单元。纤维素材料的例子包括源自如棉、亚麻、大麻、黄麻的织物纤维，以及诸如莫代尔、粘胶、莱赛尔的人造纤维素纤维。用语“纤维素”或“纤维素材料”也指含有纤维素作为主要组分的“木质纤维素”或“木质纤维材料”。在细胞壁中，纤维素被包裹在不同走向的薄层中，其嵌入半纤维素、果胶质和/或苯酚丙醇单元的聚合物如木质素的基质中，以形成“木质纤维材料”或“木质纤维素”。木质纤维素的物理特性是硬而密，并且无法透过。含木质纤维素的材料例如包括植物材料,如木材(包括硬木和软木)、硬木和软木碎片、木浆、木屑，以及林业和木材工业废弃物；草本作物、农业生物质(如谷类秸杆、糖用甜菜制浆、玉米纤维、玉米秸杆和玉米棒)、谷物β -葡聚糖、甘蔗渣、茎、叶、皮、壳等等；废品，如市政固体垃圾、报纸和废弃办公纸张、废纤维、造纸污泥、诸如谷物的磨粉废弃物；专用的能源作物(如柳树、杨树、柳枝稷或利甘草等)。纤维素和木质纤维素材料在本质上可以被包括会产生能够水解糖类聚合物的酶的细菌和真菌的各种生物机体降解。降解通常需要多种酶发生作用，其通常按顺序地或同时地发生作用。纤维素到葡萄糖的生物转化一般需要三种主要类型的水解酶(I)内切葡聚糖酶(EG)，其主要是在纤维素的非晶区域内切割内部β-1，4-糖苷键；(2)外切葡聚糖酶或纤维二糖水解酶(CBH)，其从晶状纤维素聚合物链的还原或非还原端切割二糖、纤维二糖；(3) β -I, 4-葡萄糖苷酶(BG)，其将纤维二糖和其它短纤维寡糖水解成葡萄糖。葡萄糖和纤维二糖用作水解反应的终产品抑制剂。“纤维素酶”或“纤维素分解酶”是一种具有“纤维素酶活性”或“纤维素分解酶活性”的酶，这意味着它能够水解纤维素材料。一种研究最多的纤维素酶体系是丝状真菌里氏木霉，其已知至少有2种CBH,8种EG和5种BG。“木质纤维素水解酶”是具有“木质纤维素酶活性”或“木质纤维素水解活性”的酶，这意味着它们能够将木质纤维素材料如纤维素、半纤维素或其衍生物水解成分子量较小的糖类。“ β -葡聚糖”是混联(I — 3)，(I — 4) - β -D-葡聚糖。它们通常存在于例如谷物中。本发明所用的用语“ β -葡聚糖酶”指能够至少部分地切割β -葡聚糖中的连接键的酶。本发明所用的用语“纤维二糖水解酶”或“CBH”指能够从还原或非还原端切割诸如纤维素类的聚合物的1，4-β-D-糖苷键并主要产生纤维二糖的酶。它们也被称为外切葡聚糖酶，或1，4- β -D-葡聚糖纤维二糖水解酶，或纤维素1，4- β -纤维二糖糖苷酶。CBH具有由诸如催化域和N-或C-端纤维素结合域(CBD)类的非重复域所构成的模块式结构。还有一些本身缺乏CBD的纤维二糖水解酶。CBH可能还具有其他具有未知功能的域。不同的域通常通过甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸或苏氨酸中所富含的O-糖基化连接桥或铰链肽连接在一起。本发明所涉及“纤维二糖水解酶II”或“CBHII纤维二糖水解酶”或“CBHII/Cel6A 纤维二糖水解酶”或“CBHII/Cel6A纤维素酶”或“CBHII/Cel6A多肽”或“CBHII/Cel6A酶”意指按照国际生物化学和分子生物学联盟(IUBMB 见http://www. iubmb. orR)归类为EC3. 2. I. 91的一种1，4-β -D-葡聚糖纤维二糖水解酶的酶。基于其结构的相似性，本发明的纤维二糖水解酶II或CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶可以归入具有类似的氨基酸序列和三维结构的糖基水解酶家族 6 (GH6)中(Henrissat, 1991 ；Henrissat 和 Bairoch, 1993、1996 ；Henrissat 等人，1998 :也见 http: IIwm. cazy. org/farn/GH. html )。因为在序列和折叠相似性之间具有直接的关系，这一分类被认为比其专有的底物特异性更能反映出酶的结构特点，有助于揭示酶之间的进化关系，并提供一种方便的工具来获取机理信息。本发明所用的用语“纤维二糖水解酶活性”或“CBH活性”指对纤维素、纤维三糖、纤维四糖或主要从聚合物链的还原端或非还原端释放纤维二糖的任何以β_1，4-链接的葡萄糖聚合物中的1，4-β-D-糖苷键具有水解活性。糖苷键的酶解是一种立体选择性过程，其中异头中心(Cl碳)的构型既可反转也可保持。这两种构型包含一对位于待切割键的任一侧的羧酸残基。反转酶采用单置换机制，而保持酶涉及双置换反应(Sinnott，1990 ；Withers和Aebersold, 1995)。水解的立体化学进程通常由质子NMR测定,其中α-和β-异头质子呈现出不同的化学位移(Withers等人，1986)。本发明中所用的用语“纤维二糖水解酶II活性”或“CBHII/Cel6A活性”指对纤维素、纤维三糖、纤维四糖或主要从聚合物链的还原端或非还原端释放纤维二糖的任何以 β -I, 4-链接的葡萄糖聚合物中的1，4-β -D-糖苷键具有水解活性。CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶的反应机理是构型反转型。分析纤维素酶活性的方法已在文献有记载，例如可参考Ghose (1987)，Tomme等人(1988)和van Tilbeurgh等人(1988)。总的纤维素酶活性通常以过滤纸降解活性(FPU)来测量。纤维二糖水解酶活性可以使用小分子、可溶性纤维糊精和其显色苷、如4-甲基伞形酮-β-D-苷进行分析。CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶可以基于水解反应的结果来识别；CBHII/Cel6A酶不能切割小分子显色低聚糖的葡萄糖苷键(van Tilbeurgh等人，1988)。纤维二糖水解酶活性还可以基于诸如Avicel Ph 101类的微晶纤维素来分析，例如实施例3中所用。水解后形成的可溶性还原糖可以通过利用纤维二糖标准曲线的对羟基苯甲酸酰阱(PAHBAH)法(Lever, 1972)、Somogyi-Nelson 法(Somogyi, 1952)、喊性铁氰化物法(Robyt和 Whelan，1972),2, 2’ -双辛可宁酸盐法(Waffenschmidt 和 Jaenicke，1987)或二硝基水杨酸(DNS)法(Miller，1959)来测量。其他纤维素底物例如包括Solka floe纤维素或磷酸溶胀纤维素(Karlsson等人,2001)。纤维二糖水解酶II还可以用蛋白质印迹或酶联免疫吸附试验检测法利用多克隆或单克隆抗体针对纯化CBHII/Cel6A蛋白进行识别。用语“CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶”意指纤维二糖水解酶II酶，其属于糖基水解酶家族6的成员，兼具水解反应的保守折叠和立体化学结构。本发明上下文中的用语“中温”或“常规温度”指纤维素水解中的常用温度，其对应于这些过程中的酶的最佳温度或热稳定性。因此，该用语指30-45°C的温度范围。术语“升温”或“高温”指45_70°C的温度范围。在短时间的水解过程中，酶在高达80°C下仍然可以有效地作用。在这种高温的范围内仍然具有活性或稳定性的酶也称为“耐热”或“嗜热”酶。能够产生CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶多肽或CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶活性的微生物菌株可基于不同的底物进行筛选。首先，将所选的菌株在合适的培养基上培养。在制得足够量的目标纤维二糖水解酶后，将这种酶分离或纯化，对其特性进行更完全地表征。或者，将各种生物机体中的编码纤维二糖水解酶或CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶的基因分离，并且由基因编码的氨基酸序列与在实施例I中所分离并表征的CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶的氨基酸序列进行比较。所制备的纤维二糖水解酶、特别是CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶能够通过使用常规的酶化学方法如盐制备、超滤、离子交换色谱、亲和层析、凝胶过滤及疏水色谱法进行纯化。纯化过程可以通过蛋白质测定、酶活性分析以及通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳进行监测。可以对不同的温度和pH值以及分子质量及等电点的条件下的纯化酶的酶活性和稳定性进行测定。或者，本发明的CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶的特性可以通过在重组宿主中制备酶、以及纯化和表征重组CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶的酶来进行识别。此外，含有本发明的CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶作为主要酶组分之一的重组酶制剂的特性可依照实施例3中所述的方法进行表征。纯化后的CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶的分子量可以通过质谱法或根据 Laemmli (1970)基于SDS-PAGE测量。所述分子量也可以利用ExPASy服务器处的pi/MW工JlChttp: //expasy. org/tools/pi tool, html ；Gasteiger 等人,2003)从酶的氨基酸序列中预测。CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶的酶的温度依赖性或热稳定性可以在合适的缓冲液中在不同的温度下通过如实施例3所述地使用例如Avicel纤维素作为底物来测定，或通过使用文献中已描述的其它底物和缓冲体系来测定。PH依赖性和pH稳定性可以在合适的缓冲液中在不同的PH值下通过以下基于纤维素底物的活性进行测定。pi (等电点)可通过在由聚丙烯酰胺、淀粉或琼脂糖制成的固定化pH梯度凝胶上的等电聚焦来确定，或者通过从氨基酸序列中估算P〗、例如采用ExPASy服务器处的pi/MW工具(http: //expasy. otr/tools/pi tool, html ；Gasteiger 等人，2003)来测定。纯化的重组CBHII/Cel6A酶以及内部多肽的N-端可以根据Edman降解化学(Edman和Begg，1967)来测序，或者依照实施例I所述的方法或文献中所介绍的其它方法例如通过使用程序 SignalP V3. O (Nielsen 等人，1997 ；Nielsen 和 Krogh, 1998 ；Bendtsen 等人，2004)从氨基酸序列中预测分泌信号序列的切割位点来测序。用语“全长”指从编码DNA序列中翻译的酶的形式，其以编码氨基酸序列中的第一个蛋氨酸的ATG起始密码子起始，并且终止于TGA、TAG或TAA终止密码子。术语“成熟”指在去除信号序列(分泌信号肽或前肽)后含有酶活性或催化活性所需必须的氨基酸的酶的形式。对丝状真菌而言，它是指例如作为信号序列的N-端处理和其他的N-端处理以及翻译后的糖基化的结果而分泌到培养基中的形式。此外，成熟形式是指从融合构建体中的载体蛋白中切割下来的酶。许多细菌及真菌纤维二糖水解酶以模块化酶的方式制备(Srisodsuk等人，1993 ；Suurnakki等人，2000)。除了表达纤维素分解活性的催化或核心域外，这些酶还可能含有一个或多个纤维素结合域(CBD)，也称为糖类结合域/模块(CBD/CBM)，其可位于催化域的N-端或C-端。CBD具有糖类结合活性，它们调控纤维素酶与晶状纤维之间的连接，但对于酶对可溶性底物的纤维素酶水解活性的影响很小或基本没有影响。这两个域通常通过一种灵活的和高度糖基化的连接桥或铰链域连接，这一点从SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14、SEQID NO: 15和SEQ ID NO: 16的氨基酸序列中可以明显看出。本发明所用的用语“片段”意指SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID N0:15 或SEQ ID NO: 16的全长多肽的N-端和/或C-端缺少一个或多个氨基酸残基的多肽，例如多肽的成熟形式或多肽的其他酶活性部分。该片段仍然具有全长CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶所必要的催化活性或纤维二糖水解酶活性，以及基本上类似的特性如温度和PH值依赖性和稳定性及底物特异性。本发明所披露的SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14、SEQ ID: 15和SEQ ID NO: 16中的多肽本身包含N-端CBD和连接桥。这些固有的连接桥或CBD区域例如可由来自木霉属或毛壳菌的CBD取代。本发明的CBHII /Ce 16A酶在实际应用中也可以没有信号序列和/或CBD，或者信号序列和/或CBD也可以来自上述微生物或不同微生物的不同酶，或者以合成或重组的方式并入到上述酶的催化域中。本发明中所用的用语“一致性”意指在具有大约相同氨基酸数量的相应序列区域内相互比较的两个氨基酸序列之间的一致性。例如，两个氨基酸序列的全长或成熟序列可以比较一致性。此外，两个氨基酸序列中的缺乏N-端CBD的 全长或成熟序列可以比较一致性。因此，例如包括CBD和/或信号序列的CBHII/Cel6A序列与缺乏这些元素的序列的比较不在本发明的范围内。全长序列的一致性可通过例如使用ClustalW比对法(例如见 WWW, ebi. ac. uk/Tools/Clustalw)米用如下矩阵进行测量BL0SUM, Gap open: 10, Gapextension:0. 5,或者使用Clone Manager程序(版本9)(美国Cary的科学和教育软件),其包括功能“比较两个序列/全球/比较作为氨基酸的序列/BL0SUM62打分矩阵”，如实施例I所述。待比较的两个分子的氨基酸序列可能在一个或多个位置上不同，但这不会改变该分子的生物学功能或结构。这种“变异体”可能会因为不同的宿主生物基体或突变体而在氨基酸序列中自然出现，例如作为同一株、种或属内的等位基因变异体，或者它们可通过特异性变异实现。它们可能包括氨基酸序列中的一个或多个位置上的氨基酸的取代、删除、合并或插入，但它们实质上仍然以与SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID N0:15或SEQ IDNO: 16所定义的酶本质上类似的方式发生作用，即它们含有具有纤维素分解活性的变异体。本发明涉及一种用于处理纤维素材料的方法，包括用CBHII/Cel6A多肽或含有所述多肽的酶组合物或者以综合生物过程的方式来处理木质纤维材料，该纤维素材料可以采用产生所述多肽的发酵微生物进行处理，其中CBHII/Cel6A多肽呈现出纤维二糖水解活性，并且含有与SEQ ID NO: 12的全长多肽至少具有76%—致性，与SEQ ID NO: 14的全长多肽至少具有76% —致性，与SEQ ID NO: 15的全长多肽至少具有95% —致性，或者与SEQ IDNO: 16的全长多肽至少具有91% —致性的氨基酸序列，或者是具有类似特性的其片段或变异体。所述酶能够在中到高温条件下水解纤维素材料，包括木质纤维素。所述方法包括以下步骤i)制备本发明的CBHII/Cel6A多肽或含有所述多肽的酶组合物或产生所述多肽的发酵微生物；ii)将纤维素材料与本发明的CBHII/Cel6A多肽或含有所述多肽的酶组合物或产生所述多肽的发酵微生物反应；以及iii)获得部分或完全水解的纤维素材料，包括水解的木质纤维材料。用于处理或水解纤维素材料的CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶的酶“可以得自于”任何一种包括植物在内的生物机体。CBHII/Ce16A酶优选源于例如细菌或真菌类的微生物。细菌可以例如选自芽孢杆菌、固氮螺菌属、链霉菌和假单胞菌属。更为优选的是，酶源自真菌(包括丝状真菌和酵母菌)，例如源自基因，其选自裂殖酵母、克鲁维酵母菌属、毕赤酵母属、酵母属、假丝酵母和耶氏酵母，或丝状真菌毛壳菌、枝顶孢酶、曲霉、短梗霉、葡萄孢菌、毛壳菌属、金孢霉属、隐球菌、金钱菌属、木蹄层孔菌、镰刀酶、腐殖霉属、肉座菌属、香菇属、稻痕菌、白丝菌、毛霉菌、毁丝霉属、团丝核菌、厌气性真菌(Neocallimastix)、粗糙脉孢、拟青霉、青霉、黄孢原毛平革菌、射脉菌属、侧耳菌属、粪壳菌、多孔菌、密孔菌属、丝核菌属、裂褶菌、小柱孢属、篮状菌、嗜热子囊菌、梭孢壳菌属、白腐菌或木霉属。CBHII/Cel6A酶优选源自嗜热枝顶孢霉、黑果白丝菌、嗜热毛壳菌或埃默森篮状菌。根据本发明的一个优选实施例，酶可以得自于作为CBS 116240保藏的且目前被归类为嗜热枝顶孢霉的丝状真菌株ALK04245、作为CBS 685. 95保藏的黑果白丝菌株ALK04237、埃默森篮状菌株DSM 2432 (申请人的菌种保藏编号为RF8069)或作为CBS730. 95保藏的嗜热毛壳菌株ALK04237。本发明的CBHII/Ce16A纤维二糖水解酶被标记为At_ALK04245_Cel6A、Ma_ALK04237_Cel6A、Ct_ALK04265_Cel6A 和 Te_RF8069_Cel6A，CBHII/Ce16A 纤维二糖水解酶源于嗜热枝顶孢霉CBS 116240株、黑果白丝菌CBS 685. 95株、嗜热毛壳菌CBS 730. 95株或埃默森篮状菌株DSM 2432株以及糖苷水解酶家族6的成员。表I :本发明的CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶
权利要求
1.一种采用CBHII/Cel6A多肽或含有所述多肽的酶制剂来处理纤维素材料的方法，其中所述CBHII/Cel6A多肽具有纤维二糖水解酶活性，并且含有与SEQ ID NO: 12的全长多肽具有至少76%的一致性，与SEQ ID NO: 14的全长多肽具有至少76%的一致性，与SEQ IDNO: 15的全长多肽具有至少95%的一致性，或者与SEQ ID NO: 16的全长多肽具有至少91%的一致性的氨基酸序列，或者是具有类似特性的所述氨基酸序列的片段或变异体，所述方法包括以下步骤 i)制备所述CBHII/Cel6A多肽或者含有所述多肽的酶制剂或者产生所述多肽的发酵微生物； )使纤维素材料与所述CBHII/Cel6A多肽或者含有所述多肽的酶制剂或者产生所述多肽的发酵微生物反应；以及 iii)获得部分或完全水解的纤维素材料。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述CBHII/Cel6A多肽源自于枝顶孢霉属、黑果属、毛壳菌属或篮状菌属，更优选地源自于嗜热枝顶孢霉、黑果白丝菌、嗜热毛壳菌或埃默森篮状菌，最优选地源自于保藏菌株嗜热枝顶孢霉CBS 116240、黑果白丝菌CBS685. 95、嗜热毛壳菌CBS 730. 95或埃默森篮状菌DSM 2432。
3.根据权利要求I或2所述的方法，其特征在于所述CBHII/Cel6A多肽具有SEQIDNO: 12、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15 或 SEQ ID NO: 16 的氨基酸序列。
4.根据权利要求I到3中任意一项所述的方法，其特征在于所述CBHII/Cel6A多肽能够在中温到高温下水解纤维素材料。
5.根据权利要求I到4中任意一项所述的方法，其特征在于所述纤维素材料用酶组合物来处理，所述酶组合物包括一种或多种所述CBHII/Cel6A多肽以及至少一种能够水解所述纤维素材料的其它的酶，所述其它的酶选自纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶、β -葡萄糖苷酶、β -葡聚糖酶、木葡聚糖酶、木聚糖酶、β -木糖苷酶、甘露聚糖酶、β -甘露糖苷酶、α -葡萄糖苷酸酶、乙酰基木聚糖酯酶、α -阿拉伯呋喃糖苷酶、α _半乳糖苷酶、果胶酶、内切a -L-阿拉伯糖酶和外切a -L-阿拉伯糖酶、α -半乳糖苷酶、内切半乳糖醛酸酶和外切半乳糖醛酸酶、内切果胶裂解酶、果胶酸盐裂解酶和果胶(甲)酯酶、苯酚酯酶、包括过木质素过氧化物酶的木质酶、锰过氧化物酶、H2O2-生成酶以及有介体或无介体的漆酶。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述酶同时地或者按顺序地加入到纤维素材料中。
7.根据权利要求I到6中任意一项所述的方法，其特征在于所述纤维素材料选自植物材料、农业生物质、废弃产品和专用能源作物。
8.根据权利要求I到7中任意一项所述的方法，其特征在于所述CBHII/Cel6A多肽适用于制备生物燃料。
9.根据权利要求I到8中任意一项所述的方法，其特征在于所述CBHII/Cel6A多肽源自嗜热枝顶孢霉CBS 116240，并且具有SEQ ID NO: 12的氨基酸序列。
10.一种真菌CBHII/Cel6A多肽，其中所述多肽具有纤维二糖水解酶活性，并且含有与SEQ ID NO: 12的全长多肽具有至少76%的一致性，与SEQ ID NO: 14的全长多肽具有至少76%的一致性，与SEQ ID NO: 15的全长多肽具有至少95%的一致性，或者与SEQ ID NO: 16的全长多肽具有至少的91% —致性的氨基酸序列，或者是具有类似特性的所述氨基酸序列的片段或变异体。
11.根据权利要求10所述的CBHII/Cel6A多肽，其特征在于所述多肽源自于枝顶孢霉属、黑果属、毛壳菌属或篮状菌属中获得，更优选地源自于嗜热枝顶孢霉、黑果白丝菌、嗜热毛壳菌或埃默森篮状菌，最优选地源自于保藏菌株嗜热枝顶孢霉CBS116240、黑果白丝菌CBS 685. 95、嗜热毛壳菌CBS 730. 95或埃默森篮状菌DSM 2432。
12.根据权利要求10或11所述的CBHII/Cel6A多肽，其特征在于所述多肽具有SEQID NO: 12、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15 或 SEQ ID NO: 16 的氨基酸序列。
13.根据权利要求10到12中任意一项所述的CBHII/Cel6A多肽，其特征在于所述多肽能够在中温到高温条件下水解纤维素材料。
14.根据权利要求10到13中任意一项所述的CBHII/Cel6A多肽，其特征在于所述多肽由分离纯化的核酸分子编码，所述核酸分子含有多聚核苷酸序列，所述多聚核苷酸序列编码的多肽，所述多肽含有 SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO:15 或 SEQ ID NO: 16的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO: 12的全长多肽具有至少76%的一致性、与SEQ ID NO: 14具有至少76%的一致性、与SEQ ID NO: 15具有至少的95% —致性、或者与SEQ ID NO: 16具有至少91%的一致性的氨基酸序列，或者是具有类似特性的其片段或变异体。
15.根据权利要求10到14中任意一项所述的CBHII/Cel6A多肽，其特征在于所述多肽由分离纯化的核酸分子编码，所述分离纯化的核酸分子包括SEQ ID NO: 11、SEQIDNO: 13、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO: 10或其子序列所包含的多聚核苷酸序列。
16.根据权利要求10到15中任意一项所述的CBHII/Cel6A多肽，其特征在于所述多肽由分离纯化的核酸分子编码，所述分离纯化的核酸分子在严谨的条件下杂交到SEQ IDNO: 11、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO:7 或 SEQID NO:8 或其子序列所包含的多聚核苷酸序列。
17.根据权利要求10到16中任意一项所述的CBHII/Cel6A多肽，其特征在于所述多肽由包括SEQ ID NO: 11所包含的多聚核苷酸序列的分尚纯化的核酸分子编码。
18.根据权利要求10到17中任意一项所述的CBHII/Cel6A多肽，其特征在于所述多肽由位于登记号为DSM 22946的大肠杆菌内的质粒pALK2582、位于登记号为DSM22945的大肠杆菌内的质粒PALK2581、位于登记号为DSM 22947的大肠杆菌内的质粒pALK2904或位于登记号为DSM 23185的大肠杆菌内的质粒pALK 3006所包含的多聚核苷酸序列编码。
19.根据权利要求10到18中任意一项所述的CBHII/Cel6A多肽，其特征在于所述多肽由含有核酸分子的重组表达载体来制备，所述核酸分子包括可操作地连接到能够在合适宿主中直接表达编码核酸分子的CBHII/Cel6A的调控序列上的根据权利要求9到18中任意一项所述的CBHII/Cel6A酶的多聚核苷酸序列。
20.根据权利要求10到19中任意一项所述的CBHII/Cel6A多肽，其特征在于所述多肽来自异源宿主，优选来自微生物宿主。
21.根据权利要求10到20中任意一项所述的CBHII/Cel6A多肽，其特征在于所述多肽来自木霉属、曲霉属、镰刀霉属、腐质霉属、金孢霉属、脉孢菌属、根霉属、青霉属或被孢酶属。
22.根据权利要求10到21中任意一项所述的CBHII/Cel6A多肽，其特征在于所述多肽来自木霉属或曲霉属，优选来自里氏木霉。
23.根据权利要求10到22中任意一项所述的CBHII/Cel6A多肽，其特征在于所述CBHII/Ce16A多肽源自嗜热枝顶孢霉CBS 116240，并且具有SEQ ID NO: 12的氨基酸序列。
24.一种分离纯化的核酸分子，含有编码真菌CBHII/Cel6A多肽的多聚核苷酸序列，其选自 (a)一种核酸分子，其包括编码多肽的多聚核苷酸序列，所述多肽具有纤维二糖水解酶活性，并含有如 SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15 或 SEQ ID NO: 16 所列的全长氨基酸序列，或者具有类似特性的其片段或变异体。
(b)一种核酸分子，其包括编码多肽的多聚核苷酸序列，所述多肽具有纤维二糖水解酶活性，并且与SEQ ID NO: 12的全长氨基酸序列具有至少76%的一致性，与SEQ IDNO: 14的全长氨基酸序列具有至少76%的一致性，与SEQ ID NO: 15的全长氨基酸序列具有至少95%的一致性，或者与SEQ ID NO: 16的全长氨基酸序列具有至少91%的一致性，或者是具有类似特性的其片段或变异体。
(c)一种核酸分子，其含有如 SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID N0:9 或 SEQ IDNO: 10所列的多聚核苷酸序列的编码序列； (d)一种核酸分子，其含有DSM 22946、DSM 22945、DSM 22947或DSM 23185所包含的多聚核苷酸序列的编码序列； (e)一种核酸分子，其编码序列由于遗传密码的降解而与(c) (d)中任意一种核酸分子的编码序列不同；以及 (f)一种在严谨条件下杂交到DSM 22946,DSM 22945,DSM 22947或DSM 23185所包含的核酸分子上的核酸分子，所述核酸分子编码多肽，所述多肽具有纤维二糖水解酶活性，并且具有与SEQ ID NO: 12的全长氨基酸序列具有至少76%的一致性，与SEQID NO: 14的全长氨基酸序列具有至少76%的一致性，与SEQ ID NO: 15的全长氨基酸序列具有至少95%的一致性，或者与SEQ ID NO: 16的全长氨基酸序列具有至少91%的一致性的氨基酸序列，或者是具有类似特性的其片段或变异体。
25.根据权利要求24所述的核酸分子，其特征在于编码核酸分子的所述CBHII/Cel6A116240源自嗜热枝顶孢霉CBS 116240，并具有SEQ ID N0:11的氨基酸序列。
26.一种重组表达载体，含有操作性链接到能够在合适的宿主中直接表达所述CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶基因并产生所述CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶的调控序列上的根据权利要求24或25所述的核酸分子。
27.—种含有根据权利要求26所述的重组表达载体的宿主细胞。
28.根据权利要求27所述的宿主细胞，其特征在于所述宿主为微生物宿主。
29.根据权利要求27或28所述的宿主细胞，其特征在于所述宿主为丝状真菌。
30.根据权利要求27到29中任意一项所述的宿主细胞，其特征在于所述宿主为木霉属、曲霉属、镰刀霉属、腐质霉属、金孢霉属、脉孢菌属、根霉属、青霉属或被孢酶属。
31.根据权利要求30所述的宿主细胞，其特征在于所述宿主为木霉属或曲霉属，优选为里氏木霉。
32.根据权利要求27到29中任意一项所述的宿主细胞，其特征在于所述宿主为发酵微生物。
33.一种制造具有纤维二糖水解酶活性的多肽的方法，所述方法包括步骤培养根据权利要求27到32中任意一项所述的宿主细胞，以及收集所述多肽。
34.一种由根据权利要求24或25所述的核酸序列编码并且其能够通过根据权利要求33所述的方法获得的具有纤维二糖水解酶活性的多肽。
35.一种用于获得酶制剂的方法，包括步骤培养根据权利要求27到32中任意一项所述的宿主细胞，以及制备全营养培养肉汤，或者从用过的培养基中分离出所述细胞，以及获得上清液。
36.一种根据权利要求35所述的方法获得的酶制剂。
37.一种酶制剂，包括根据权利要求10到23中任意一项所述的CBHII/Cel6A酶。
38.根据权利要求37所述的酶制剂，其特征在于所述CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶源自源嗜热枝顶孢霉，并且具有SEQ ID NO: 12的氨基酸序列。
39.根据权利要求36到38中任意一项所述的酶制剂，其特征在于所述制剂包括其他的酶，所述其他的酶选自纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶、葡萄糖苷酶、葡聚糖酶、木葡聚糖酶、木聚糖酶、木糖苷酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、α-葡萄糖苷酸酶、乙酰基木聚糖酯酶、α -阿拉伯呋喃糖苷酶、α -半乳糖苷酶、果胶酶、内切a -L-阿拉伯糖酶和外切a-L-阿拉伯糖酶、α-半乳糖苷酶、内切半乳糖醛酸酶和外切半乳糖醛酸酶、内切果胶裂解酶、果胶酸盐裂解酶和果胶(甲)酯酶、苯酚酯酶、包括过木质素过氧化物酶的木质酶、锰过氧化物酶、H2O2-生成酶以及有介体或无介体的漆酶。
40.根据权利要求36到39中任意一项所述的酶制剂，其特征在于所述酶制剂以全营养培养肉汤、用过的培养基、液体、粉末或者颗粒的形式存在。
41.根据权利要求10到23中任意一项所述的CBHII/Cel6A多肽或者根据权利要求36到40中任意一项所述的酶制剂在制备生物燃料、洗涤剂、处理纤维、处理食物或饲料、纸浆和纸、饮料或任何涉及纤维素材料水解或改性的用途中的应用。
42.根据权利要求10到23中任意一项所述的CBHII/Cel6A多肽或者根据权利要求36到40中任意一项所述的酶制剂在制备生物燃料中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种从纤维素材料中生产糖类水解物的方法。该方法例如可用于从木质纤维材料制备供生产生物乙醇所用的可发酵糖。本发明描述了源自嗜热枝顶孢霉、黑果白丝菌、嗜热毛壳菌或埃默森篮状菌这四种丝状真菌的纤维素酶，通过重组技术获得的其酶制剂，以及所述的酶和酶制剂的应用。
文档编号C12N9/42GK102712917SQ201080060251
公开日2012年10月3日 申请日期2010年12月30日 优先权日2009年12月30日
发明者亚里·韦赫曼佩雷, 特瑞·普拉能, 绍利·托伊卡, 金·朗法德 申请人:罗尔公司