鉴定抗药性分枝杆菌的方法

专利名称：鉴定抗药性分枝杆菌的方法
CN 102947465 A书明说1/33 页鉴定抗药性分枝杆菌的方法
介绍
这里所公开的是确定未突变分枝杆菌rpoB基因核心区存在的方法。例如，这里所公开的方法通过确定分枝杆菌rpoB基因核心区是否包含突变，从而允许确定分枝杆菌是否是利福平抗性的。根据此类的方法，可以鉴定多重耐药性的分枝杆菌菌株。
背景技术：
结核是一种由分枝杆菌引起的，常见的、通常是致死性的感染性疾病。在人类中， 结核分枝杆菌是结核病的主要病因，而其他的结核分枝杆菌复合群成员同样也是病因，例如牛型分支杆菌，非洲分枝杆菌以及田鼠分枝杆菌。
结核病的治疗通常很困难，需要长期施用抗微生物制剂，尤其是一线抗微生物制剂利福平和异烟肼，通常两者联合使用。尽管如此，由于不同的环境因素(例如，不合适的治疗方案，低质量的药物)，通常会出现耐药性分枝杆菌。耐药性分枝杆菌，尤其是多重耐药性分枝杆菌(以同时对利福平和异烟肼的耐药性为特征)是一个主要的公共健康问题，需要更加长期的治疗，在治疗中使用更大范围和更加昂贵的药物，以及施用会导致/具有更大副作用的二、三线药物。
分枝杆菌rpoB基因编码分枝杆菌RNA聚合酶的beta-亚基。利福平能结合RNA 聚合酶的beta-亚基，抑制聚合酶催化DNA向RNA的转录，这将会导致RNA向蛋白质的后续翻译过程的抑制。分枝杆菌rpoB基因特定区域的突变导致具有不同beta-亚基结构的RNA 聚合酶的产生，而这种聚合酶不再容易被利福平所抑制，因此产生了利福平抗性的菌株。此外，对利福平的耐药性同时也会导致对异烟肼的耐药性(例如,见Riska et al. ,2000, Int. J. Tuberc Lung Dis. ,4(2) :S4_S10)，因此，这使得鉴定突变分枝杆菌rpoB基因成为鉴定多重耐药性分枝杆菌的一个可能的机制。
如今，鉴定在rpoB基因中含有突变的分枝杆菌菌株，从而鉴定利福平耐药性的分枝杆菌的方法需要很长的时间和/或复杂和昂贵的机器。就这点而言，本领域中仍然需要一种快速和简单的方法来鉴定分枝杆菌的rpoB基因突变。
发明概述
在一个方面，这里公开了一种利用可检测标记的探针来快速检测在rpoB基因核心区含有突变的分枝杆菌的方法。这里公开的方法减少了用于确定分枝杆菌rpoB基因核心区突变存在的可检测标记的数量，因此，降低了分析系统的复杂性，所述分析系统检测在 rpoB基因核心区突变的分枝杆菌菌株。由于rpoB基因核心区的突变意味着对抗微生物制剂利福平的抗性，因此，对含有rpoB基因核心区突变的分枝杆菌菌株的检测能够提供这样的信息，该信息能够为患者，例如结核病患者选择合适的治疗方法。除了检测在rpoB基因核心区的突变存在之外，这里所公开的方法还可以用于检测特定的分枝杆菌菌株或种系的存在以及检测除rpoB基因之外其他的可能与耐药性有关的分枝杆菌基因突变的存在。
在一个具体实施方式
中，这里公开了一种确定未突变分枝杆菌rpoB基因核心区存在的方法，包括5
(a)将核酸样品与包含一组探针的组合物接触，其中至少四个探针是rpoB探针， 其在允许rpoB探针与核心区杂交的条件下对未突变的rpoB基因核心区具有特异性，其中第一和第三rpoB探针用荧光供体基团进行标记，第二和第四rpoB探针用不同的荧光受体基团进行标记，其中rpoB探针与未突变的rpoB基因核心区杂交，以便荧光受体基团能够接收来自于荧光供体基团的能量的转移；以及(b)分析荧光发射的存在，所述荧光是当两个供体基团将能量转移到两个受体基团基团时产生的，其中产生于当两个供体基团将能量转移到两个受体基团基团时的荧光发射的存在意味着未突变rpoB基因核心区的存在，而产生于当两个供体基团将能量转移到两个受体基团基团时的荧光发射不存在或者减少意味着并不存在未突变rpoB基因核心区。
在另一个具体实施方式
中，这里公开了一种确定分枝杆菌存在以及未突变分枝杆菌rpoB基因核心区存在的方法，包括
(a)将核酸样品与组合物接触，所述组合物包括(i)至少一个分枝杆菌检测探针， 和(ii) 一组探针，其中至少四个探针是rpoB探针，其在允许rpoB探针与核心区杂交以及检测探针与分枝杆菌核酸互补序列杂交的条件下，对未突变的rpoB基因核心区具有特异性，其中第一和第三rpoB探针用荧光供体基团进行标记，第二和第四rpoB探针用不同的荧光受体基团进行标记，其中rpoB探针与未突变的rpoB基因核心区杂交，以便荧光受体基团能够接收来自于荧光供体基团的能量的转移；
以及(b)分析杂交的检测探针和荧光发射的存在，所述荧光是当两个供体基团将能量转移到两个受体基团基团时产生的，其中(i)杂交的检测探针的存在和产生于当两个供体基团将能量转移到两个受体基团时的荧光发射的存在意味着分枝杆菌的存在和未突变rpoB基因核心区的存在；(ii)不存在杂交的检测探针和产生于当两个供体基团将能量转移到两个受体基团基团时的荧光发射不存在或者减少意味着不存在分枝杆菌；以及(iii)杂交的检测探针存在，而产生于当两个供体基团将能量转移到两个受体基团基团时的荧光发射不存在或者减少意味着存在分枝杆菌但并不存在未突变rpoB基因核心区。
可以这么理解，在这里所公开的每一种方法中，每一个rpoB探针杂交于rpoB基因核心区的不同部位。举个例子，当根据这里公开的其中一个方法使用与rpoB基因核心区杂交的四个rpoB探针时，四个rpoB探针中的每一个都杂交于核心区的不同部位。同样的，当根据这里公开的其中一个方法使用与rpoB基因核心区杂交的三个rpoB探针时,三个rpoB 探针中的每一个都杂交于核心区的不同部位。在一些具体实施方式
中，当在rpoB基因核心区中没有突变的时候，与rpoB基因核心区进行杂交的rpoB探针能够杂交到整个rpoB基因核心区。举个例子，如果rpoB基因核心区包含81个碱基对，那么当rpoB基因核心区没有突变的时候，rpoB核心区的全部81个碱基对都与rpoB探针进行杂交。在其他具体实施方式
中，当rpoB基因核心区中没有突变的时候，与rpoB基因核心区进行杂交的探针并没有杂交到全部的rpoB基因核心区，即，当杂交的时候，rpoB探针并没有覆盖全部的rpoB基因核心区。举个例子，如果rpoB基因核心区包含81个碱基对，当rpoB基因核心区中没有突变的时候，与rpoB探针杂交的rpoB基因核心区的碱基对数目可能少于81,例如，当rpoB基因核心区中没有突变的时候，80或更少、79或更少、78或更少、77或更少、76或更少、75或更少、74或更少、73或更少、72或更少、71或更少、70或更少、65或更少、60或更少、50或更少的碱基对杂交到rpoB探针。
根据这里所公开的方法，未突变rpoB基因核心区的存在表明分枝杆菌对抗微生物制剂利福平是敏感的，而不存在为突变rpoB基因核心区表明分枝杆菌对抗微生物制剂利福平是敏感的。在特定的具体实施方式
中，确定分枝杆菌对抗微生物制剂利福平的耐药性表明分枝杆菌是多重耐药性分枝杆菌。
在这里所描述的方法的一些具体实施方式
中，一个或多个rpoB探针可以包含自身互补区域，因此，在不存在包含能与探针杂交的核酸的核酸样品的情况下，探针形成发夹环。在特定的具体实施方式
中，探针包含淬灭基团，当探针形成发夹环时，该淬灭基团能够淬灭探针上的荧光基团(例如，荧光供体基团)。根据此类具体实施方式
，只有当探针结合到一个互补核酸序列的时候，才能够检测到探针上的荧光基团发射出来的荧光，因此这能够降低对探针上的荧光基团所发射出来荧光的非特异性检测。
在这里所描述的方法的一些具体实施方式
中，这一组探针还包含封闭探针，该封闭探针能够提高方法的特异性。在特定的具体实施方式
中，封闭探针至少和与rpoB基因核心区杂交的rpoB探针部分互补，因此，当不存在包含能与探针杂交的核酸的核酸样品时， 封闭探针杂交到rpoB探针。在一些具体实施方式
中，封闭探针用淬灭基团标记，所述淬灭基团能够淬灭与rpoB基因核心区杂交的rpoB探针上的荧光基团(例如，荧光供体基团)。 在其他的具体实施方式
中，封闭探针至少与未突变的rpoB基因核心区的核酸序列部分互补，当不存在一个或多个能与rpoB基因核心区杂交的rpoB探针时，封闭探针与未突变的 rpoB基因核心区杂交，而当未突变的rpoB基因核心区存在的时候，未突变的rpoB基因核心区与rpoB探针而不是封闭探针进行杂交。
在特定的具体实施方式
中，在用于这里描述的方法之前，先裂解核酸样品。在其他的具体方式中，这里所描述的方法包括裂解核酸样品的步骤，该步骤作为方法的一部分，例如，裂解剂包括在方法的步骤(a)中。
在特定的具体实施方式
中，这里所描述的方法中使用的核酸样品包括扩增的核酸。在特定的具体实施方式
中，扩增的核酸包括对应于分枝杆菌的rpoB基因或分枝杆菌 rpoB基因的区域的核酸。在一些具体实施方式
中，扩增的核酸包括对应于除rpoB基因之外的其他基因或除rpoB基因之外的其他基因的区域的核酸，例如，扩增的核酸是分枝杆菌的 inhA基因、katG基因、ahpC基因、mabA基因、oxyR基因、pncA基因、rrs基因、rpsL基因、 embA基因、embB基因、embC基因、gyrA基因、gyrB基因或nor基因、或者这些基因的区域。
在一些具体实施方式
中，在用于这里所描述的方法之前，先扩增核酸样品中的核酸。在其他的具体实施方式
中，核酸样品中的核酸的扩增作为这里所描述的方法的一个部分，例如，扩增步骤包括在本方法的步骤(a)中。在特定的具体实施方式
中，扩增分枝杆菌的rpoB基因或者rpoB基因的区域。在一些具体实施方式
中，扩增除rpoB基因之外的基因或者除rpoB基因之外的其他基因的区域，例如，扩增的核酸是分枝杆菌的inhA基因、katG 基因、ahpC基因、mabA基因、oxyR基因、pncA基因、rrs基因、rpsL基因、embA基因、embB 基因、embC基因、gyrA基因、gyrB基因或nor基因、或者这些基因的区域。
这里所描述的方法进一步包括检测除了 rpoB之外的分枝杆菌其他基因的突变， 其中所述突变与除利福平外的其他抗微生物制剂抗性有关。举个例子，可以使用能与这些基因的未突变区域杂交的探针，其中荧光标记的探针与之杂交的这些区域中的突变与对特定的抗微生物制剂的抗性相关。根据此类方法，如果检测到了从探针发射出来的荧光，那么这些基因中就不存在突变，表明分枝杆菌对被测抗微生物制剂并没有抗性，而如果检测不到从探针发射出来的荧光，那么在基因中就存在着突变，表明分枝杆菌对被测抗微生物制剂有耐药性。另外，探针可以用来与除了 rpoB之外的其他分枝杆菌基因的突变区域进行杂交，其中该突变与对除利福平之外的其他抗微生物制剂的耐药性有关。根据此类方法，如果检测到了从探针发射出来的荧光，那么这些基因中就存在着突变，表明分枝杆菌对被测抗微生物制剂有耐药性，而如果检测不到从探针发射出来的荧光，那么在基因中就不存在突变，表明分枝杆菌对被测抗微生物制剂没有耐药性。
赋予分枝杆菌对抗微生物制剂耐药性的分枝杆菌基因的突变在本领域是已知的例如，katG、inhA、mabA、ahpC和oxyR基因的突变带来对于异烟肼的耐药性；pncA基因的突变带来对于卩比嗪酰胺的耐药性；rrs和rpsL基因的突变带来对链霉素的耐药性；embA、 embB、embC基因的突变带来对乙胺丁醇的耐药性；inhA基因的突变还带来对乙硫异烟胺 (ethioamide)的耐药性；gyrA、gyrB和nor基因的突变带来对环丙沙星的耐药性(见,例如 Drobniewski 和 Wilson, 1998, J. Med. Microbiol.，47 189-196)。
在另一个方面，这里公开了用于根据这里所描述的一个或多个方法来确定未突变分枝杆菌rpoB基因核心区存在的试剂盒。
术语
这里所使用的术语“大约”和“大概”，除非特别指明，是指该术语修饰的数值上下不超过20 %的值。
这里所使用的术语“来源”是指任何可以提供一个核酸的物质，例如，一个受试者 (例如人类或非人类的动物)。
这里所使用的术语“核酸样品”是指包含或者怀疑包含核酸，例如分枝杆菌的核酸的样品。核酸样品可以包含除核酸之外的其他组分，例如受试者(例如人类或非人类的动物)的宿主细胞，和/或能被纯化、分离或富集的核酸样品。核酸的纯化、分离和富集的方法在本领域是已知的。在特定的具体实施方式
中，核酸样品中的核酸是易于被探针所杂交的。在特定的具体实施方式
中，核酸样品被裂解。可以用本领域中已知的方法来实施裂解， 例如加热、酶解、去污剂、缓冲液、酸、碱、离液剂、在珠子或颗粒的存在下进行物理剪切、和/ 或使用压力。在一些具体实施方式
中，对核酸样品施以一个或多个变性步骤，以使得含有内部二级结构的双链核酸或核酸变性。核酸变性的方法在本领域是已知的。在一些具体实施方式
中，核酸样品包括扩增的核酸，例如，扩增的rpoB基因核心区。在其他的具体实施方式
中，扩增核酸样品是作为这里所描述的一个或多个方法的一个部分。扩增核酸的方法在本领域是已知的，例如PCR、SDA、TMA, NASBA、滚环扩增、螺旋位移扩增或者LAMP。
这里所使用的术语“分枝杆菌”是指包含rpoB基因的分枝杆菌菌株，其中rpoB基因包含一个核心区，而该rpoB核心区的突变与利福平耐药性有关。在特定的具体实施方式
中，分枝杆菌是指结核分枝杆菌复合群的成员，例如，结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌、牛型分枝杆菌、牛型分枝杆菌卡介苗(牛型分枝杆菌BCG,Mycobacterium bovis BCG)和田鼠分枝杆菌。许多分枝杆菌的rpoB基因的核酸序列被指定了 GenBank登录号，例如，L27989 (结核分枝杆菌的rpoB基因)；AY544894 (牛型分枝杆菌的rpoB基因)；AF057453 (牛型分枝杆菌BCG的rpoB基因)；AY544944 (田鼠分枝杆菌的rpoB基因)；以及AY544880 (非洲分枝杆菌的rpoB基因)。
这里所使用的术语“分枝杆菌rpoB基因核心区”是指分枝杆菌的rpoB基因的这样的区域，即当该区域包含突变时，其与利福平耐药性相关。在一些具体实施方式
中，分枝杆菌rpoB基因核心区对应于结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌、牛型分枝杆菌、牛型分枝杆菌 BCG、田鼠分枝杆菌或鸟分枝杆菌的rpoB基因的分枝杆菌rpoB基因核心区。在特定的具体实施方式
中，分枝杆菌rpoB基因核心区对应于结核分枝杆菌的rpoB基因的分枝杆菌rpoB 基因核心区，例如，该核心区包含81个碱基对，对应于结核分枝杆菌rpoB基因的密码子 507-533 (例如，见 Hauck et al. , 2009, J. Antimic. Chemother. ,64:259-262)。
这里所使用的术语“未突变的分枝杆菌rpoB基因核心区”以及“未突变的rpoB基因核心区”是指不包含突变的分枝杆菌rpoB基因核心区，所述突变与抗微生物制剂利福平耐药性相关。
这里所使用的术语“生长培养基”一般而言涉及能使分枝杆菌生长的营养源。生长培养基可以提供分枝杆菌维持生命以及促进其复制/繁殖所必需或有益的维生素、氨基酸、微量元素、盐、化合物以及其他物质，无论是有机的还是无机的。示例性的生长培养基包括Middlebrook培养基、Lowenstein-Jensen斜面培养基、Ogawa卵黄培养基、MGIT管 (Becton Dickinson)以及 BACTEC12B (Becton Dickinson)。
这里所使用的术语“核酸”是指脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核酸、核糖核苷酸以及核糖核酸，以及它们的聚合物形式，也包括单链或双链形式。核酸包括天然发生的核酸，例如脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)以及核酸类似物。核酸类似物包括那些含有非天然发生的碱基的核酸、包含与其他核苷酸之间连锁(linkages)而不是通过天然发生的磷酸二酯键连接的核苷酸的核酸，或者包括通过连锁(linkages)而不是通过磷酸二酯键连接的碱基的核苷酸的核酸。因此，核酸类似物包括，例如但不限于硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、硼磷酸酯、甲基磷酸酯、手性甲基磷酸酯、2-0-甲基核糖核苷酸、 多肽-核酸(PNAs)、锁核酸(LNAs)等。
这里所使用的术语“rpoB探针”是指与分枝杆菌rpoB基因的一个部位特异性结合的探针。
这里所使用的术语“分枝杆菌检测探针”是指包含一个可检测标记的探针，该探针与分枝杆菌的除rpoB基因核酸序列之外的其他核酸序列互补。在一个特定的具体实施方式
中，分枝杆菌检测探针特异性结合分枝杆菌的核酸序列，该核酸序列在所有或者多个分枝杆菌品种或菌株中是保守的。在另外的具体实施方式
中，分枝杆菌检测探针特异性结合一个特定分枝杆菌品种或菌株的核酸序列。
这里所使用的术语“荧光发射不存在或减少”是指一种观察到的现象，其中荧光基团发射的荧光没有被检测到(即，荧光信号不存在)或检测到相对于在一个给定条件下、例如当荧光基团发射的荧光未被淬灭或者当荧光基团处于一个能够使得荧光从荧光基团转移到荧光受体基团的位置时，荧光基团发射的荧光减少。举个例子，当一个荧光供体基团和荧光受体基团所处的位置并不能够使得荧光可以从荧光供体基团转移到荧光受体基团时， 将会发生荧光发射的缺失或者减少，即，FRET并不会发生。在另外的例子中，当用淬灭基团将荧光基团发射的荧光淬灭之后，荧光基团发射的荧光可能缺失或者减少。
这里所使用的，在核酸的相关内容中出现的术语“纯化的”是指从其他成分(例如蛋白质，脂类盐，其他类型的核酸分子)中分离出来的核酸，而这些成分存在于核酸的天然来源中，或者该术语也可以指基于给定的核酸序列而合成的、并在合成探针中所使用的过量的核酸中纯化出来的探针。在特定的具体实施方式
中，纯化的核酸按本领域技术人员已知的技术评估至少60 %纯度，至少65 %纯度，至少70 %纯度，至少75 %纯度，至少80 %纯度，至少85 %纯度，至少90 %纯度，至少99 %纯度或至少99. 9 %纯度。
这里所使用的术语“荧光共振能量转移”或“FRET”是指一种发生于两种荧光分子之间的能量转移机制，两种荧光分子是荧光供体基团和荧光受体基团或淬灭基团(即， FRET对)，其中FRET对中的一个成员(荧光供体基团)在它的特定荧光激发波长下被激发并将荧光能量转移到第二个分子(荧光受体基团或淬灭基团)，然后供体返回到电子基态。
这里所使用的“荧光基团”是指发射能够被检测到的荧光的荧光化合物。
这里所使用的“荧光供体基团”是指能够吸收能量，也能够将能量转移至荧光受体基团或淬灭基团的荧光化合物。
这里所使用的“荧光受体基团”是指能够吸收来自于荧光供体基团的能量，并能够将转移的能量重新以荧光的形式发射出去的荧光化合物。在FRET中，荧光受体基团与荧光供体基团有足够的光谱重叠，以致于当FRET对的成员(即荧光供体基团和荧光受体基团) 处于发生FRET的特征距离的位置时，其能够接收发射自荧光受体基团的能量。
这里所使用的术语“淬灭基团”是指能够减少荧光基团(例如，荧光供体基团)发射荧光的分子或者化合物的一个部分。这种减少包括减少当一个光子从荧光基团正常发射后产生的光。在FRET中，淬灭基团与荧光基团具有足够的空间重叠，以使得当FRET对的成员(即荧光基团和淬灭基团)处于FRET的特征距离时，其能够接收荧光基团发射的能量。 其他类型的非FRET淬灭机制也同样存在，这些机制不依赖供体和受体基团之间的光谱重叠(见，例如 Tyagi et al.，1998, Nature Biotechnol. 16 :49_53)。
示例性的荧光供体基团、荧光受体基团以及淬灭基团包括但不限于香豆素类及相关的染料、氧杂蒽染料(例如荧光素类、对甲氨基酚类和若丹明类)、试卤灵、花青染料 (cyanine dyes)、bimanes、吖唳类、异H引哚类、丹酰染料、氨基邻苯二甲酰肼类(例如鲁米诺和异鲁米诺衍生物)、氨基苯邻二甲酰亚胺类、氨基萘二酰亚胺(aminonaphthalimides)、 氨基苯并呋喃类、氨基喹啉类、双氰基氢醌、荧光铕、铽复合物及相关化合物。淬灭基团的特定示例包括但不限于DABCYL和黑洞淬灭子1-111。荧光供体基团、荧光受体基团和淬灭基团的特定示例包括但不限于 FITC、ROX、GFP、Cy5、Cy5. 5、Cy3、Cy3B、GFP, YFP, RFP, CFP、 若丹明红、德克萨斯红(Texas Red)、氟硼突、IDR700、LightCycler610、LightCycler640、 LightCycler670> LightCycler705 以及 TAMRA。
这里所使用的术语“淬灭”和“被淬灭”是指能量被荧光受体基团或淬灭基团部分或全部吸收。淬灭现象会发生在两个相同或者实质上相同的荧光组分(例如单一的青色素 (cyanine dye))之间，或者两个不同的荧光组分之间(例如青色素和方酸菁染料)，或者一个荧光组分和一个非荧光受体(例如荧光染料和DABCYL基团)之间。
这里所使用的术语“预先确定的参考范围”是指一个特定分析的读数的参考范围。
这里所使用的术语“可检测标记”是指可直接或间接提供可检测信号的任何标记。在一些具体实施方式
中，可检测标记包含一个生物或化学分子，例如，酶类、放射性分子、荧光分子、荧光团(例如 FITC、ROX、GFP、Cy5、Cy5. 5、Cy3、Cy3B、GFP、YFP、RFP、CFP、若丹明红、德克萨斯红、氟硼突、IDR700、LightCycler610、LightCycler640、LightCycler670、LightCycler705以及TAMRA)、粒子、化学发光子、酶的底物或协同因子、酶抑制剂或磁性颗粒。在其他的具体实施方式
中，可检测标记包括其物理特性，例如，大小、形状、电泳迁移率、 疏水性、亲水性、可溶性和/或色谱表型。
这里所使用的“杂交”(“hybridize”、“hybridizes”和 “hybridization”)是指相互之间具有至少 60% (优选的，70%，75%，80%，85%，90%，95%，98%，99% 或 99. 5%) 互补性的两个或多个核酸序列的结合。核酸杂交技术和条件是本领域技术人员所已知的， 例如描述在如 Sambrook et al. Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Lab. Press，12 月，1989 ;US 专利 4563419 和 4851330，以及在 Dunn，et al. ,Cell 12 pp. 23-26(1978)和许多其他公开文献中。杂交反应的各种改进方式在本领域中是已知的， 包括溶液杂交或在一个或多个反应步骤中与固定在固相支持物上的探针进行的杂交。
这里所描述的术语“受试者”或“患者”可以互相替换使用，是指一个动物受试者。 在一个具体实施方式
中，受试者是哺乳动物。在另外的具体实施方式
中，受试者是非人类动物。在另外的具体实施中，受试者是人类。


图I :示例性的图示，说明rpoB探针如何杂交到分枝杆菌rpoB基因核心区中。 PlD :包含供体基团的探针I ;P2A :包含受体基团的探针2 ；P3D :包含供体基团的探针3 ； P4A :包含受体基团的探针4。IA :包含供体基团的探针结合的rpoB基因核心区中的突变的效果。IB :包含受体基团的探针结合的rpoB基因核心区中的突变的效果。1C:包含供体基团的探针结合的rpoB基因核心区中的突变的效果。ID :包含受体基团的探针结合的rpoB 基因核心区中的突变的效果。图2展示了图I中所描述的分析是如何进行的。
图2 :如何执行这里所描述的分析的示例性模型，该分析能够确定分枝杆菌rpoB 基因核心区是否包含突变并因此对抗微生物制剂，如利福平产生了耐药性。
发明详述
确定是否存在未突变分枝杆菌rpoB基因核心区的方法
在一个方面，这里所展示的是用可检测标记的探针快速检测在rpoB基因核心区含有突变的分枝杆菌菌株的方法。这里所展示的方法减少了用于检测分枝杆菌rpoB基因核心区突变存在而所需的可检测标记的数量，因此，降低了检测在rpoB基因核心区含有突变的分枝杆菌菌株的复杂性。由于在rpoB基因核心区中的突变表明对抗微生物制剂利福平的耐药性，因此检测在rpoB基因核心区含有突变的分枝杆菌菌株为选择合适的方案以治疗肺结核患者提供了信息。除了检测rpoB基因核心区突变的存在之外，这里展示的方法可以用于检测特定的分枝杆菌菌株或品种，以及除rpoB基因之外其他的与耐药性有关的分枝杆菌基因。
在一些具体实施方式
中，这里所展示的方法允许使用能杂交到整个分枝杆菌rpoB 基因核心区的探针群，只是需要检测两个不同的可检测信号，例如，通过使用FRET。因此，在不需要检测多于两种可检测标记的情况下，这些方法允许鉴定分枝杆菌rpoB基因核心区是否含有突变。
在特定的具体实施方式
中，当在检测分枝杆菌rpoB基因核心区突变时使用封闭探针，这里所展示的方法可以使特异性增强。根据此类的方法，封闭探针的使用确保了只有当分枝杆菌rpoB基因核心区中没有突变的时候，rpoB探针才会杂交到分枝杆菌rpoB基因核心区上。
在一个具体实施方式
中，这里展示了确定是否存在未突变分枝杆菌rpoB基因核心区的方法，包括
(a)将核酸样品与含有一组探针的组合物接触，其中有至少5个探针是在允许 rpoB探针与核心区杂交的条件下，特异性结合未突变rpoB基因核心区的rpoB探针，其中 (i)第一和第三rpoB探针用荧光供体基团标记，(ii)第二和第四rpoB探针用不同的荧光受体基团标记，(iii)第五探针用荧光基团标记；其中rpoB探针与未突变rpoB基因核心区杂交以使得荧光受体基团能够接受来自于荧光供体基团的能量转移；以及
(b)分析(i)当两个供体基团将能量转移到两个受体基团时所导致的荧光发射是否存在以及(ii)来自于第五rpoB探针的荧光，其中存在当两个供体基团将能量转移到两个受体基团时所导致的突光发射以及存在来自于第五rpoB探针的突光表明存在未突变的 rpoB基因核心区，而如果当两个供体基团将能量转移到两个受体基团时所导致的荧光发射不存在或减少，或者来自于第五rpoB探针的荧光不存在表明不存在未突变的rpoB基因核心区。
在一个方面，该方法进一步包括将核酸样品与分枝杆菌检测探针相接触，分析是否存在杂交的检测探针，其中如果存在杂交的检测探针意味着存在分枝杆菌，而不存在杂交的检测探针意味着不存在分枝杆菌。在另外的方面，第一、第二、第三和/或第四rpoB探针进一步包括淬灭基团。
在一个具体实施方式
中，这里展示了确定是否存在未突变分枝杆菌rpoB基因核心区的方法，包括
(a)将核酸样品与含有一组探针的组合物接触，其中有至少5个探针是在允许 rpoB探针与核心区杂交的条件下，特异性结合未突变rpoB基因核心区的rpoB探针，其中(i)第一和第三rpoB探针用荧光供体基团标记，(ii)第二和第四rpoB探针用不同的荧光受体基团标记，(iii)第五探针用荧光基团和淬灭基团标记，其中，如果不存在第五探针特异性杂交的未突变rpoB基因核心区时，第五探针会形成发夹环，这样荧光基团的荧光就被淬灭了 ；rpoB探针杂交到未突变的rpoB基因核心区，以便荧光受体基团能够接受来自于荧光供体基团的能量转移；以及
(b)分析(i)当两个供体基团将能量转移到两个受体基团时所导致的荧光发射是否存在以及(ii)来自于标记有荧光基团的第五rpoB探针的荧光，其中存在当两个供体基团将能量转移到两个受体基团时所导致的荧光发射以及存在来自于荧光基团的荧光表明存在未突变的rpoB基因核心区，而如果当两个供体基团将能量转移到两个受体基团时所导致的荧光发射不存在或减少，或者来自于荧光基团的荧光不存在表明不存在未突变的 rpoB基因核心区。
在一个方面，该方法进一步包括将核酸样品与分枝杆菌检测探针相接触，分析是否存在杂交的检测探针，其中如果存在杂交的检测探针意味着分枝杆菌存在，而不存在杂交的检测探针意味着不存在分枝杆菌。在另外的方面，第一、第二、第三和/或第四rpoB探针进一步包括淬灭基团。
在另外的具体实施方式
中，这里展示了确定是否存在未突变分枝杆菌rpoB基因核心区的方法，包括
(a)将核酸样品与含有一组探针的组合物接触，其中有至少四个探针是在允许 rpoB探针与核心区杂交的条件下，特异性结合未突变rpoB基因核心区的rpoB探针，其中第一和第三rpoB探针用荧光供体基团标记，第二和第四rpoB探针用不同的荧光受体基团标记；其中rpoB探针与未突变rpoB基因核心区杂交以使得荧光受体基团能够接受来自于荧光供体基团的能量转移；以及
(b)分析当两个供体基团将能量转移到两个受体基团时所导致的荧光发射是否存在，其中存在当两个供体基团将能量转移到两个受体基团时所导致的荧光发射时，表明存在未突变的rpoB基因核心区，而如果当两个供体基团将能量转移到两个受体基团时所导致的荧光发射不存在或减少时，表明不存在未突变的rpoB基因核心区。
在一个方面，第一、第二、第三和/或第四rpoB探针进一步包括淬灭基团。
在另外的具体实施方式
中，这里所展示的是确定是否存在分枝杆菌以及是否存在未突变分枝杆菌rpoB基因核心区的方法，包括
(a)将核酸样品与含有(i)分枝杆菌检测探针，和(ii) 一组探针的组合物接触，其中有至少四个探针是在允许rpoB探针与核心区杂交以及检测探针与互补分枝杆菌核酸序列杂交的条件下，特异性结合未突变rpoB基因核心区的rpoB探针,其中第一和第三rpoB 探针用荧光供体基团标记，第二和第四rpoB探针用不同的荧光受体基团标记；其中rpoB探针与未突变rpoB基因核心区杂交以使得荧光受体基团能够接受来自于荧光供体基团的能量转移；以及
(b)分析杂交的检测探针和当两个供体基团将能量转移到两个受体基团时所导致的荧光发射是否存在，其中(i)存在杂交的检测探针和存在当两个供体基团将能量转移到两个受体基团时所导致的荧光发射，意味着存在分枝杆菌和存在未突变的rpoB基因核心区；(ii)杂交的检测探针不存在，以及当两个供体基团将能量转移到两个受体基团时所导致的荧光发射不存在或减少时，意味着不存在分枝杆菌；(iii)杂交的检测探针存在，以及当两个供体基团将能量转移到两个受体基团时所导致的荧光发射不存在或减少时，意味着存在分枝杆菌，但不存在未突变的rpoB基因核心区。
在另外的方面，第一、第二、第三和/或第四rpoB探针进一步包括淬灭基团。
在另外的具体实施方式
中，这里所展示的是确定是否存在未突变分枝杆菌rpoB 基因核心区的方法，包括
(a)将核酸样品与含有一组探针的组合物接触，其中有至少四个探针是在允许该探针与核心区杂交的条件下，特异性结合未突变rpoB基因核心区的rpoB探针，其中第一和第二 rpoB探针用不同的荧光基团标记，第三rpoB探针用荧光供体基团标记，第四rpoB探针用荧光受体基团标记；其中第三和第四rpoB探针与未突变rpoB基因核心区杂交以使得荧光受体基团能够接受来自于荧光供体基团的能量转移；以及
(b)分析(i)当供体基团将能量转移到受体基团时所导致的荧光发射是否存在以及(ii)来自于标记有荧光基团的杂交rpoB探针的荧光是否存在，其中存在当供体基团将能量转移到受体基团时所导致的荧光发射以及存在来自于荧光基团的荧光表明存在未突变的rpoB基因核心区，而如果当两个供体基团将能量转移到两个受体基团时所导致的荧光发射不存在或减少，或者来自于荧光基团之一的荧光不存在表明不存在未突变的rpoB基因核心区。
在一个方面，该方法进一步包括将核酸样品与分枝杆菌检测探针相接触，分析是否存在杂交的检测探针，其中如果存在杂交的检测探针意味着分枝杆菌存在，而不存在杂交的检测探针意味着不存在分枝杆菌。在另外的方面，第一、第二、第三和/或第四rpoB探针进一步包括淬灭基团。
在另外的具体实施方式
中，这里所展示的是确定是否存在未突变分枝杆菌rpoB 基因核心区的方法，包括
(a)将核酸样品与含有一组探针的组合物接触，其中有至少四个探针是在允许该探针与核心区杂交的条件下，特异性结合未突变rpoB基因核心区的rpoB探针，其中(i)第一和第二 rpoB探针包含荧光基团和淬灭基团，其中，当不存在第一和第二探针特异性的未突变rpoB基因核心区时，第一和第二 rpoB探针形成发夹环，因此荧光基团的荧光就被淬灭，(ii)第三rpoB探针用荧光供体基团标记，(iii)第四rpoB探针用荧光受体基团标记， 其中第三和第四rpoB探针与未突变rpoB基因核心区杂交以使得荧光受体基团能够接受来自于荧光供体基团的能量转移；以及
(b)分析(i)当供体基团将能量转移到受体基团时所导致的荧光发射是否存在以及(ii)来自于标记有荧光基团的杂交的rpoB探针的荧光是否存在，其中存在当供体基团将能量转移到受体基团时所导致的荧光发射以及存在来自于荧光基团的荧光表明存在未突变的rpoB基因核心区，而如果当两个供体基团将能量转移到两个受体基团时所导致的荧光发射不存在或减少，或者来自于荧光基团的荧光不存在表明不存在未突变的rpoB基因核心区。
在一个方面，该方法进一步包括将核酸样品与分枝杆菌检测探针相接触并分析是否存在杂交的检测探针，其中如果存在杂交的检测探针意味着分枝杆菌存在，而不存在杂交的检测探针意味着不存在分枝杆菌。在另外的方面，第一、第二、第三和/或第四rpoB探针进一步包括淬灭基团。
在另外的具体实施方式
中，这里展示了确定是否存在未突变分枝杆菌rpoB基因核心区的方法，包括
(a)将核酸样品与含有一组探针的组合物接触，其中有至少四个探针是在允许 rpoB探针与核心区杂交的条件下，特异性结合未突变rpoB基因核心区的rpoB探针，其中 rpoB探针包含不同的荧光基团和淬灭基团，而当rpoB探针特异性的rpoB基因核心区不存在的时候，rpoB探针形成发夹环，因此荧光基团的荧光就被淬灭，以及
(b)分析来自于突光基团的突光,其中,存在来自于突光基团的突光就表明存在未突变的rpoB基因核心区，来自于其中荧光基团之一的荧光不存在或减少就表明不存在未突变的rpoB基因核心区。
在一个方面，该方法进一步包括将核酸样品与分枝杆菌检测探针相接触，分析是否存在杂交的检测探针，其中，存在杂交的检测探针意味着分枝杆菌存在，而不存在杂交的检测探针意味着不存在分枝杆菌。
在另外的具体实施方式
中，这里展示了确定是否存在未突变分枝杆菌rpoB基因核心区的方法，包括
(a)将核酸样品与含有一组探针的组合物接触，其中有至少三个探针是在允许rpoB探针与核心区杂交的条件下，特异性结合未突变rpoB基因核心区的rpoB探针，其中第一 rpoB探针用荧光基团标记，第二 rpoB探针用荧光供体基团标记，第三rpoB探针用荧光受体基团标记；其中第二和第三rpoB探针与未突变rpoB基因核心区杂交以使得荧光受体基团能够接受来自于荧光供体基团的能量转移；以及
(b)分析(i)当供体基团将能量转移到受体基团时所导致的荧光发射是否存在以及(ii)来自于标记有荧光基团的杂交的rpoB探针的荧光是否存在，其中，存在当供体基团将能量转移到受体基团时所导致的荧光发射以及存在来自于荧光基团的荧光表明存在未突变的rpoB基因核心区，当供体基团将能量转移到受体基团时所导致的荧光发射不存在或减少，或者来自于荧光基团的荧光不存在则表明不存在未突变的rpoB基因核心区。
在一个方面，该方法进一步包括将核酸样品与分枝杆菌检测探针相接触，分析是否存在杂交的检测探针，其中，存在杂交的检测探针意味着分枝杆菌存在，而不存在杂交的检测探针意味着不存在分枝杆菌。在另外的方面，第一、第二和/或第三rpoB探针进一步包括淬灭基团。
在另外的具体实施方式
中，这里展示了确定是否存在未突变分枝杆菌rpoB基因核心区的方法，包括
(a)将核酸样品与含有一组探针的组合物接触，其中有至少三个探针是在允许 rpoB探针与核心区杂交的条件下，特异性结合未突变rpoB基因核心区的rpoB探针，其中(i)第一 rpoB探针包含荧光基团和淬灭基团，其中，当不存在第一探针特异性的未突变 rpoB基因核心区时，第一 rpoB探针形成发夹环，因此荧光基团的荧光就被淬灭，(ii)第二 rpoB探针用荧光供体基团标记，(iii)第三rpoB探针用荧光受体基团标记；其中第二和第三rpoB探针与未突变rpoB基因核心区杂交以使得荧光受体基团能够接受来自于荧光供体基团的能量转移；以及
(b)分析(i)当供体基团将能量转移到受体基团时所导致的荧光发射是否存在以及(ii)来自于第一 rpoB探针的荧光是否存在，其中存在当供体基团将能量转移到受体基团时所导致的荧光发射以及存在来自于第一 rpoB探针的荧光则表明存在未突变的rpoB基因核心区，而供体基团将能量转移到受体基团时所导致的荧光发射不存在或减少，或者来自于第一 rpo探针的荧光不存在则表明不存在未突变的rpoB基因核心区。
在一个方面，该方法进一步包括将核酸样品与分枝杆菌检测探针相接触并分析是否存在杂交的检测探针，其中，存在杂交的检测探针则意味着分枝杆菌存在，而不存在杂交的检测探针意味着不存在分枝杆菌。在另外的方面，第二和/或第三rpoB探针进一步包括淬灭基团。
在另外的具体实施方式
中，这里展示了确定是否存在未突变分枝杆菌rpoB基因核心区的方法，包括
(a)将核酸样品与含有一组探针的组合物接触，其中有至少三个探针是在允许 rpoB探针与核心区杂交的条件下，特异性结合未突变rpoB基因核心区的rpoB探针，其中 rpoB探针包含不同的荧光基团和一个淬灭基团，当rpoB探针特异性的rpoB基因核心区不存在的时候，rpoB探针形成发夹环，因此荧光基团的荧光就被淬灭，以及
(b)分析来自于突光基团的突光发射是否存在,如果存在来自于突光基团的突光发射则表明存在未突变的rpoB基因核心区，而如果来自于其中一个荧光基团的荧光发射不存在或减少表明不存在未突变的rpoB基因核心区。
在一个方面，该方法进一步包括将核酸样品与分枝杆菌检测探针相接触并分析是否存在杂交的检测探针，其中如果存在杂交的检测探针则意味着分枝杆圃存在，而不存在杂交的检测探针则意味着不存在分枝杆菌。
在另外的具体实施方式
中，这里展示了确定是否存在未突变分枝杆菌rpoB基因核心区的方法，包括
(a)将核酸样品与含有一组探针的组合物接触，其中有至少两个探针是在允许 rpoB探针与核心区杂交的条件下，特异性结合未突变rpoB基因核心区的rpoB探针，其中 rpoB探针包含不同的荧光基团和淬灭基团，而当rpoB探针特异性的rpoB基因核心区不存在的时候，rpoB探针形成发夹环，因此荧光基团的荧光就被淬灭，以及
(b)分析来自于突光基团的突光发射是否存在,如果存在来自于突光基团的突光则表明存在未突变的rpoB基因核心区，而如果来自于其中荧光基团之一的荧光不存在或减少表明不存在未突变的rpoB基因核心区。
在一个方面，该方法进一步包括将核酸样品与分枝杆菌检测探针相接触，分析是否存在杂交的检测探针，其中如果存在杂交的检测探针意味着分枝杆菌存在，而不存在杂交的检测探针意味着不存在分枝杆菌。
在另外的具体实施方式
中，这里展示了确定是否存在未突变分枝杆菌rpoB基因核心区的方法，包括
(a)将核酸样品与含有一组探针的组合物接触，其中有至少两个探针是在允许 rpoB探针与核心区杂交的条件下，特异性结合未突变rpoB基因核心区的rpoB探针，其中第一rpoB探针用荧光供体基团标记，第二 rpoB探针用荧光受体基团标记；其中rpoB探针与未突变rpoB基因核心区杂交以使得荧光受体基团能够接受来自于荧光供体基团的能量转移；以及
(b)分析当供体基团将能量转移到受体基团时所导致的荧光发射是否存在，其中存在当供体基团将能量转移到受体基团时所导致的荧光发射时，表明存在未突变的rpoB 基因核心区，而如果当供体基团将能量转移到受体基团时所导致的荧光发射不存在或减少时，表明不存在未突变的rpoB基因核心区。
在一个方面，该方法进一步包括将核酸样品与分枝杆菌检测探针相接触，分析是否存在杂交的检测探针，其中如果存在杂交的检测探针则意味着分枝杆圃存在，而不存在杂交的检测探针意味着不存在分枝杆菌。在另一个方面，第一和/或第二 rpoB探针进一步包括淬灭基团。
在另外的具体实施方式
中，这里展示了确定是否存在未突变分枝杆菌rpoB基因核心区的方法，包括
(a)将一个核酸样品与含有一组探针的组合物接触，其中有至少一个探针是在允许rpoB探针与核心区杂交的条件下，特异性结合未突变rpoB基因核心区的rpoB探针，其中rpoB探针包含荧光基团和淬灭基团，而当rpoB探针特异性的rpoB基因核心区不存在的时候，rpoB探针形成发夹环，因此荧光基团的荧光就被淬灭，以及
(b)分析来自于供体基团的荧光发射是否存在，如果存在来自于荧光基团的荧光则表明存在未突变的rpoB基因核心区，而如果来自于其中荧光基团之一的荧光不存在或减少表明不存在未突变的rpoB基因核心区。
在一个方面，该方法进一步包括将核酸样品与分枝杆菌检测探针相接触，分析是否存在杂交的检测探针，其中如果存在杂交的检测探针意味着分枝杆菌存在，而不存在杂交的检测探针意味着不存在分枝杆菌。
在特定的具体实施方式
中，这里提供的方法包括探针组的用途，其中在该组探针中的一些探针与分枝杆菌rpoB基因核心区外的rpoB基因区互补，而其中该组探针中的另外一些探针则特异性结合未突变的rpoB基因核心区。举个例子，在一个具体实施方式
中， 这里展示了确定是否存在未突变分枝杆菌rpoB基因核心区的方法，包括
(a)将核酸样品与含有一组探针的组合物接触，其中在允许该探针与核心区杂交的条件下，第一探针是特异性结合未突变rpoB基因核心区的rpoB探针，第二探针与分枝杆菌rpoB基因核心区外的rpoB基因区互补，其中第一探针用荧光供体基团标记，第二探针用荧光受体基团标记，第一和第二探针与rpoB基因杂交，以使得荧光受体基团就能接收来自于荧光供体基团的能量转移，以及
(b)分析当供体基团将能量转移到受体基团时所导致的荧光发射是否存在，其中存在当供体基团将能量转移到受体基团时所导致的荧光发射时，表明存在未突变的rpoB 基因核心区，而如果当供体基团将能量转移到受体基团时所导致的荧光发射不存在或减少时，表明不存在未突变的rpoB基因核心区。
在一个方面，该方法进一步包括将核酸样品与分枝杆菌检测探针相接触，分析是否存在杂交的检测探针，其中如果存在杂交的检测探针意味着分枝杆菌存在，而不存在杂交的检测探针意味着不存在分枝杆菌。在另一个方面，第一和/或第二 rpoB探针进一步包括淬灭基团。
在另外的具体实施方式
中，这里展示了确定是否存在未突变分枝杆菌rpoB基因核心区的方法，包括
(a)将核酸样品与含有一组探针的组合物接触，其中在允许rpoB探针与核心区杂交的条件下，第一探针与分枝杆菌rpoB基因核心区外的rpoB基因区互补，而第二探针和第三探针是特异性结合未突变rpoB基因核心区的rpoB探针，其中第一探针用荧光供体基团标记，第二探针用荧光受体基团标记，第三探针用荧光基团标记，第一和第二探针与rpoB 基因杂交，以使得荧光受体基团能接收来自于荧光供体基团的能量转移，以及
(b)分析(i)当供体基团将能量转移到受体基团时所导致的荧光发射是否存在以及(ii)来自于标记有荧光基团的第三rpoB探针的荧光是否存在，其中存在当供体基团将能量转移到受体基团时所导致的荧光发射以及存在来自于荧光基团的荧光表明存在未突变的rpoB基因核心区，而如果当供体基团将能量转移到受体基团时所导致的荧光发射不存在或减少，或者来自于荧光基团的荧光不存在表明不存在未突变的rpoB基因核心区。
在一个方面，该方法进一步包括将核酸样品与分枝杆菌检测探针相接触，分析是否存在杂交的检测探针，其中如果存在杂交的检测探针意味着分枝杆菌存在，而不存在杂交的检测探针意味着不存在分枝杆菌。在另外的方面，第一、第二和/或第三rpoB探针进一步包括淬灭基团。
在另外的具体实施方式
中，这里展示了确定是否存在未突变分枝杆菌rpoB基因核心区的方法，包括
(a)将核酸样品与含有一组探针的组合物接触，其中在允许rpoB探针与核心区杂交的条件下，第一探针与分枝杆菌rpoB基因核心区外的rpoB基因区互补，而第二、第三和第四探针是特异性结合未突变rpoB基因核心区的rpoB探针，其中第一和第三探针用荧光供体基团标记，第二和第四探针用不同的荧光受体基团标记，而当这些探针杂交到rpoB基因时，荧光受体基团就能接收来自于荧光供体基团的能量转移，以及
(b)分析当两个供体基团将能量转移到两个受体基团时所导致的荧光发射是否存在，其中存在当两个供体基团将能量转移到两个受体基团时所导致的荧光发射时，表明存在未突变的rpoB基因核心区，而如果当两个供体基团将能量转移到两个受体基团时所导致的荧光发射不存在或减少时，表明不存在未突变的rpoB基因核心区。
在一个方面，该方法进一步包括将核酸样品与分枝杆菌检测探针相接触，分析是否存在杂交的检测探针，其中如果存在杂交的检测探针意味着分枝杆菌存在，而不存在杂交的检测探针意味着不存在分枝杆菌。在另外的方面，第一、第二，第三和/或第四rpoB探针进一步包括淬灭基团。
在另外的具体实施方式
中，这里展示了确定是否存在未突变分枝杆菌rpoB基因核心区的方法，包括
(a)将核酸样品与含有一组探针的组合物接触，其中在允许rpoB探针与核心区杂交的条件下，第一探针与rpoB基因核心区外的rpoB基因区互补，而第二、第三、第四和第五探针是特异性结合未突变rpoB基因核心区的rpoB探针，其中第一和第三探针用荧光供体基团标记，第二和第四探针用不同的荧光受体基团标记，第五探针用荧光基团标记，而当这些探针杂交到rpoB基因时，荧光受体基团就能接收来自于荧光供体基团的能量转移，以及
(b)分析(i)当两个供体基团将能量转移到两个受体基团时所导致的荧光发射是否存在以及(ii)来自于标记有荧光基团的杂交的第五rpoB探针的荧光是否存在，其中存在当两个供体基团将能量转移到两个受体基团时所导致的荧光发射以及存在来自于荧光基团的荧光表明存在未突变的rpoB基因核心区，而如果当两个供体基团将能量转移到两个受体基团时所导致的荧光发射不存在或减少，或者来自于荧光基团的荧光不存在表明不存在未突变的rpoB基因核心区。
在一个方面，该方法进一步包括将核酸样品与分枝杆菌检测探针相接触，分析是否存在杂交的检测探针，其中如果存在杂交的检测探针意味着分枝杆菌存在，而不存在杂交的检测探针意味着不存在分枝杆菌。在另外的方面，第一、第二、第三、第四和/或第五 rpoB探针进一步包括淬灭基团。
应该可以理解，在这里所描述的每个方法中，每个与rpoB基因核心区杂交的rpoB 探针是杂交到rpoB基因核心区的不同部位的。举个例子，当根据这里所描述的其中一个方法使用杂交到rpoB基因核心区的四个rpoB探针时,这四个rpoB探针是以杂交到rpoB基因核心区的不同部位的方式来与分枝杆菌rpoB基因核心区进行结合。同样的，当根据这里所描述的其中一个方法使用中的杂交到rpoB基因核心区的三个rpoB探针时,这三个rpoB 探针是以杂交到rpoB基因核心区的不同部位的方式来与分枝杆菌rpoB基因核心区进行结合。在一些具体实施方式
中，当在rpoB基因核心区中没有突变的时候，与rpoB基因核心区杂交的rpoB探针进行杂交以使得整个rpoB基因核心区都已经被rpoB探针杂交。举个例子，如果rpoB基因核心区包含81个碱基对，当rpoB基因核心区不存在突变的时候，rpoB基因核心区的全部81个碱基对都与rpoB探针进行杂交。在另外的具体实施方式
中，当在 rpoB基因核心区中没有突变的时候，与rpoB基因核心区杂交的rpoB探针进行杂交，但并不是整个rpoB基因核心区都已经被杂交，即，当rpoB探针进行杂交时，并没有覆盖全部的 rpoB基因核心区。举个例子，如果rpoB基因核心区包含81个碱基对，而当rpoB基因核心区不存在突变的时候，与rpoB探针进行了杂交的rpoB基因核心区的碱基对数目是少于81， 例如，当rpoB基因核心区不存在突变的时候，80或更少、79或更少、78或更少、77或更少、 76或更少、75或更少、74或更少、73或更少、72或更少、71或更少、70或更少、65或更少、60 或更少、50或更少个碱基对于rpoB探针进行杂交。
在这里所描述的方法的一些具体实施方式
中，一个或多个rpoB探针以及对除 rpoB基因之外的其他分枝杆菌基因具有特异性的一个或多个探针可以包含自互补区域，因此，在不存在含有与探针杂交的核酸的核酸样品的情况下，这些探针形成发夹环。在特定的具体实施方式
中，探针包含淬灭基团，当探针形成发夹环的时候，该淬灭基团能够淬灭探针上的荧光基团。根据此类的具体实施方式
，来自于探针的荧光基团发射的荧光能够根据杂交到互补核酸序列与背景区分开来，因此这能够允许来自于探针的荧光基团发射的荧光的同源检测，而不需要除去未杂交的探针。
在这里所描述的方法的具体实施方式
中，该系列的探针进一步包括能提高方法特异性的封闭探针。在特定的具体实施方式
中，封闭探针和与rpoB基因核心区杂交的rpoB 探针部分互补，因此在不存在含有与探针杂交的核酸的核酸样品时，封闭探针与rpoB探针杂交。在一些具体实施方式
中，封闭探针标记有能够淬灭rpoB探针上的荧光基团(例如， 荧光供体基团)的淬灭基团，所述rpoB探针能够与封闭探针结合的rpoB基因核心区杂交。 在其他的具体实施方式
中，封闭探针与未突变rpoB基因核心区的核酸序列部分互补，当不存在一个或多个与rpoB基因核心区杂交的rpoB探针时，封闭探针杂交到未突变的rpoB基因核心区，而当存在未突变的rpoB基因核心区时，未突变rpoB基因核心区与rpoB探针进行杂交而不与封闭探针进行杂交。
根据这里所描述的方法，未突变rpoB基因核心区的存在意味着分枝杆菌对抗微生物制剂利福平是耐药性的，而不存在未突变rpoB基因核心区则意味着分枝杆菌对抗微生物制剂利福平是敏感的。在特定的具体实施方式
中，鉴定出分枝杆菌对利福平具有耐药性意味着该分枝杆菌是多重耐药性分枝杆菌。
这里所描述的方法进一步包括检测除rpoB基因外其他分枝杆菌基因的突变，其中所述突变与除利福平之外的其他抗微生物制剂耐药性相关。那些能够赋予抗微生物制剂耐药性的分枝杆菌基因的突变在本领域是已知的，例如，katG, inhA, mabA, ahpC, kasA以及 oxyR基因的突变会带来对于异烟肼的耐药性；pncA基因的突变带来对于吡嗪酰胺的耐药性；rrs和rpsL基因的突变带来链霉素的耐药性；embA，embB, embC基因的突变带来对乙胺丁醇的耐药性；inhA基因的突变还带来对乙硫异烟胺的耐药性；gyrA、gyrB和nor基因的突变带来对环丙沙星的耐药性(见，例如Drobniewski和Wilson, 1998, J. Med. Microbiol., 47 189-196) 0本领域技术人员将了解如何对这里提供的方法进行改进以包括检测任何分枝杆菌基因中的突变的步骤，因此，这允许检测分枝杆菌是否对利福平和一种或多种其他的抗微生物制剂具有耐药性。
在一些具体实施方式
中，这里提供的方法包括检测分枝杆菌katG、inhA、mabA、ahpC、kasA和/或oxyR基因中的一个或多个突变，其中所述突变已知或已经被确定与分枝杆菌对异烟肼的耐药性相关。在一个具体实施方式
中，使用一个或多个荧光标记的探针来检测突变，所述探针是已知的异烟肼耐药性相关的基因区特异性探针，而只有当不存在突变的时候，探针才能进行杂交。接着可以分析探针上的荧光，其中如果存在发射于探针的荧光则表明存在着未突变分枝杆菌katG、inhA、mabA、ahpC、kasA和/或oxyR基因,而如果并不存在发射于探针上的荧光则表明未突变分枝杆菌katG、inhA、mabA、ahpC、kasA和/或 oxyR基因并不存在。根据该具体实施方式
，来自于探针的荧光如果存在，则意味着分枝杆菌对异烟肼并不具有耐药性。在另一个的具体实施方式
中，使用一个或多个荧光标记的探针来检测突变，所述探针是已知的异烟肼耐药性相关的基因区特异性探针，而只有当存在突变的时候，探针才能进行杂交。接着可以分析探针上的荧光，其中如果存在发射于探针的荧光则表明未突变分枝杆菌katG、inhA,mabA, ahpC、kasA和/或oxyR基因并不存在，而如果并不存在发射于探针上的荧光则表明存在未突变分枝杆菌katG、inhA、mabA、ahpC、kasA 和/或oxyR基因。根据该具体实施方式
，来自于探针的荧光如果不存在，则意味着分枝杆菌对异烟肼并不具有耐药性。
在其他具体实施方式
中，这里提供的方法包括检测分枝杆菌pncA基因的一个或多个突变，其中所述突变已知或者被确定为与分枝杆菌对抗微生物制剂吡嗪酰胺的耐药性相关。在一个具体实施方式
中，使用一个或多个荧光标记的探针来检测突变，所述探针是已知的吡嗪酰胺耐药性相关的基因区特异性探针，而只有当不存在突变的时候，探针才能进行杂交。接着可以分析探针上的荧光，其中如果存在发射于探针的荧光则表明存在着未突变分枝杆菌pncA基因区，而如果并不存在发射于探针上的荧光则表明未突变分枝杆菌 pncA基因区并不存在。根据该具体实施方式
，来自于探针的荧光如果存在，则意味着分枝杆菌对吡嗪酰胺并不具有耐药性。在另一个的具体实施方式
中，使用一个或多个荧光标记的探针来检测突变，所述探针是已知的吡嗪酰胺耐药性相关的基因区特异性探针，而只有当存在突变的时候，探针才能进行杂交。接着可以分析探针上的荧光，其中如果存在发射于探针的荧光则表明未突变分枝杆菌PncA基因区并不存在，而如果并不存在发射于探针上的荧光则表明存在未突变分枝杆菌pncA基因区。根据该具体实施方式
，来自于探针的荧光如果不存在，则意味着分枝杆菌对吡嗪酰胺并不具有耐药性。
在其他具体实施方式
中，这里提供的方法包括检测分枝杆菌rrs和/或rpsL基因的一个或多个突变，其中所述突变已知或者被确定为与分枝杆菌对抗微生物制剂链霉素的耐药性相关。在一个具体实施方式
中，使用一个或多个荧光标记的探针来检测突变，所述探针是已知的链霉素耐药性相关的基因区特异性探针，而只有当不存在突变的时候，探针才能进行杂交。接着可以分析探针上的荧光，其中如果存在发射于探针的荧光则表明存在着未突变分枝杆菌rrs和/或rpsL基因区，而如果并不存在发射于探针上的荧光则表明未突变分枝杆菌rrs和/或rpsL基因区并不存在。根据该具体实施方式
，来自于探针的荧光如果存在，则意味着分枝杆菌对链霉素并不具有耐药性。在另一个的具体实施方式
中，使用一个或多个荧光标记的探针来检测突变，所述探针是已知的链霉素耐药性相关的基因区特异性探针，而只有当存在突变的时候，探针才能进行杂交。接着可以分析探针上的荧光，其中如果存在发射于探针的荧光则表明未突变分枝杆菌rrs和/或rpsL基因区并不存在，而如果并不存在发射于探针上的荧光则表明存在未突变分枝杆菌rrs和/或rpsL基因区。据该具体实施方式
，来自于探针的荧光如果不存在，则意味着分枝杆菌对链霉素并不具有耐药性。
在其他具体实施方式
中，这里提供的方法包括检测分枝杆菌embA、embB和/或 embC基因的一个或多个突变，其中所述突变已知或者被确定为与分枝杆菌对抗微生物制剂乙胺丁醇的耐药性相关。在一个具体实施方式
中，使用一个或多个荧光标记的探针来检测突变，所述探针是已知的乙胺丁醇耐药性相关的基因区特异性探针，而只有当不存在突变的时候，探针才能进行杂交。接着可以分析探针上的荧光，其中如果存在发射于探针的荧光则表明存在着未突变分枝杆菌embA、embB和/或embC基因区，而如果并不存在发射于探针上的荧光则表明未突变分枝杆菌embA、embB和/或embC基因区并不存在。根据该具体实施方式
，来自于探针的荧光如果存在，则意味着分枝杆菌对乙胺丁醇并不具有耐药性。在另一个的具体实施方式
中，使用一个或多个荧光标记的探针来检测突变，所述探针是已知的乙胺丁醇耐药性相关的基因区特异性探针，而只有当存在突变的时候，探针才能进行杂交。接着可以分析探针上的荧光，其中如果存在发射于探针的荧光则表明未突变分枝杆菌 embA,embB和/或embC基因区并不存在，而如果并不存在发射于探针上的荧光则表明存在未突变分枝杆菌embA、embB和/或embC基因区。根据该具体实施方式
,来自于探针的突光如果不存在，则意味着分枝杆菌对乙胺丁醇并不具有耐药性。
在其他具体实施方式
中，这里提供的方法包括检测分枝杆菌inhA基因的一个或多个突变，其中所述突变已知或者被确定为与分枝杆菌对抗微生物制剂乙硫异烟胺的耐药性相关。在一个具体实施方式
中，使用一个或多个荧光标记的探针来检测突变，所述探针是已知的乙硫异烟胺耐药性相关的基因区特异性探针，而只有当不存在突变的时候，探针才能进行杂交。接着可以分析探针上的荧光，其中如果存在发射于探针的荧光则表明存在着未突变分枝杆菌inhA基因区，而如果并不存在发射于探针上的荧光则表明未突变分枝杆菌inhA基因区并不存在。根据该具体实施方式
，来自于探针的荧光如果存在，则意味着分枝杆菌对乙硫异烟胺并不具有耐药性。在另一个的具体实施方式
中，使用一个或多个荧光标记的探针来检测突变，所述探针是已知的乙硫异烟胺耐药性相关的基因区特异性探针， 而只有当存在突变的时候，探针才能进行杂交。接着可以分析探针上的荧光，其中如果存在发射于探针的荧光则表明未突变分枝杆菌inhA基因区并不存在，而如果并不存在发射于探针上的荧光则表明存在未突变分枝杆菌inhA基因区。根据该具体实施方式
，来自于探针的荧光如果不存在，则意味着分枝杆菌对乙硫异烟胺并不具有耐药性。
在其他具体实施方式
中，这里提供的方法包括检测分枝杆菌gyrA、gyrB和/或 nor基因的一个或多个突变，其中所述突变已知或者被确定为与分枝杆菌对抗微生物制剂环丙沙星的耐药性相关。在一个具体实施方式
中，使用一个或多个荧光标记的探针来检测突变，所述探针是已知的环丙沙星耐药性相关的基因区特异性探针，而只有当不存在突变的时候，探针才能进行杂交。接着可以分析探针上的荧光，其中如果存在发射于探针的荧光则表明存在着未突变分枝杆菌gyrA、gyrB和/或nor基因区,而如果并不存在发射于探针上的荧光则表明未突变分枝杆菌gyrA、gyrB和/或nor基因区并不存在。根据该具体实施方式
，来自于探针的荧光如果存在，则意味着分枝杆菌对环丙沙星并不具有耐药性。在另一个的具体实施方式
中，使用一个或多个荧光标记的探针来检测突变，所述探针是已知的环丙沙星耐药性相关的基因区特异性探针，而只有当存在突变的时候，探针才能进行杂交。接着可以分析探针上的荧光，其中如果存在发射于探针的荧光则表明未突变分枝杆菌gyrA、 gyrB和/或nor基因区并不存在，而如果并不存在发射于探针上的荧光则表明存在未突变分枝杆菌gyrA, gyrB和/或nor基因区。根据该具体实施方式
,来自于探针的突光如果不存在，则意味着分枝杆菌对环丙沙星并不具有耐药性。
根据这里所描述的方法，其包括检测非rpoB基因的多个分枝杆菌基因的一个或多个突变，可以这样理解，非rpoB基因的分枝杆菌基因特异性探针包括荧光标记，所述荧光标记远离那些根据这里的方法用于标记一个或多个rpoB探针的荧光标记，例如，rpoB探针以及非rpoB基因的分枝杆菌基因特异性探针可以相互独立地被检测到。
在一些具体实施方式
中，这里所描述的方法包括检测非rpoB基因的多个分枝杆菌基因的一个或多个突变，其中这些不同的基因上的突变与不同的抗微生物制剂耐药性相关。举个例子，一个方法可以包括检测katG基因的一个或多个突变，其中所述的一个或多个突变与异烟肼耐药性相关；该方法也可以包括检测gyrA基因的一个或多个突变，其中所述一个或多个突变与环丙沙星耐药性相关。根据此类的具体实施方式
，该方法允许检测对多种抗微生物制剂具有耐药性的分枝杆菌，例如，利福平、异烟肼和环丙沙星。根据此类具体实施方式
，非rpoB基因的分枝杆菌基因特异性探针可以包括自互补区域，因此当不存在含有与该探针杂交的核酸的核酸样品时，探针形成发卡环。
在特定的具体实施方式
中，这里所描述的方法包括一个或多个洗涤步骤，例如，在杂交步骤之前和/或之后，该方法包括一个洗涤步骤。在其他的具体实施方式
中，这里所描述的方法不包括洗涤步骤。
在特定的具体实施方式
中，在使用这里所描述的方法前对核酸样品进行裂解。在其他的具体实施方式
中，这里所描述的方法包括将裂解核酸样品作为该方法的一个部分， 例如，将裂解剂包括进该方法的步骤(a)中。
在特定的具体实施方式
中，这里所描述的方法所使用的核酸样品包括扩增的核酸。在一个特定的具体实施方式
中，扩增的核酸包括对应于分枝杆菌rpoB基因或分枝杆菌 rpoB基因区域的核酸。在一些具体实施方式
中，扩增的核酸包括对应于分枝杆菌非rpoB的其他基因或非rpoB的其他基因的区域，例如，扩增的核酸是分枝杆菌的inhA基因、katG基因、ahpC基因、mabA基因、oxyR基因、pncA基因、rrs基因、rpsL基因、embA基因、embB基因、embC基因、gyrA基因、gyrB基因或nor基因，或者其区域。在其他的具体实施方式
中，扩增的核酸包括分枝杆菌特异性的序列，该序列可以用于进行鉴定，例如，IS6110、16S rRNA、 gyrB、dnaj 或 85B 抗原。
在一些具体实施方式
中，核酸样品中的核酸在使用这里所描述的方法之前就被扩增。在一些具体实施方式
中，核酸样品中的核酸扩增是作为这里所描述的方法的一个部分， 例如，扩增步骤包括进该方法的步骤(a)中。在特定的具体实施方式
中，分枝杆菌的rpoB基因或rpoB基因的区域被扩增。在一些具体实施方式
中，被扩增的是非rpoB的分枝杆菌基因或这些基因的区域，例如，被扩增的核酸是分枝杆菌的inhA基因、katG基因、ahpC基因、 mabA基因、oxyR基因、pncA基因、rrs基因、rpsL基因、embA基因、embB基因、embC基因、 gyrA基因、gyrB基因或nor基因，或它们的区域。
在特定的具体实施方式
中，这里所展示的方法包括在核酸样品与这里所使用的一个或多个探针(例如，rpoB探针和/或非rpoB的分枝杆菌基因特异性探针)接触前先裂解核酸样品，接着纯化核酸样品以及扩增核酸样品。举个例子，一个核酸样品可以被裂解， 纯化，然后扩增。接着，就可以将核酸样品应用于这里所展示的方法。
在其他的具体实施方式
中，这里所展示的方法包括裂解核酸样品，接着在核酸样品与这里所使用的探针(例如，rpoB探针和/或非rpoB分枝杆菌基因特异性探针)接触的同时扩增核酸样品。举个例子，将核酸样品与裂解剂、扩增制剂和一组探针组合，然后使用这里的方法，例如，这里所描述的方法可以包括在单管反应中裂解，扩增以及检测。
在其他的具体实施方式
中，这里所展示的方法包括在该方法前裂解核酸样品，接着在核酸样品与这里所使用的探针(例如，rpoB探针和/或非rpoB分枝杆菌基因特异性探针)接触的同时扩增核酸样品。举个例子，核酸样品可以被裂解，然后裂解的核酸样品可以与扩增制剂以及一组探针组合，然后使用这里的方法，例如，这里所描述的方法可以包括在单管反应中扩增和检测。
Mt
探针可以指设计能与目的靶核酸序列特异性杂交的任何核酸序列。典型地，但不排除，探针与一个可检测标记连接，因此该探针(以及它的靶核酸)能够被检测，显现，测量和/或定量。
根据这里所描述的方法所使用的探针可以基于、衍生于或者包含本领域已知的任何探针，或者基于已知的或已确定的分枝杆菌的任何核酸序列或其类似物而改进。
在特定的具体实施方式
中，根据这里所描述的方法所使用的探针可以包括DNA或 RNA寡核苷酸，以及可以通过本领域已知的技术化学合成。在特定的具体实施方式
中，根据这里所描述的方法所使用的探针是多肽-核酸探针(PNA)。PNAs是本领域技术人员所熟知的(见，例如Egholm et al.，(1993)Nature，365 :566_568)。在其他的特定实施方式中，根据这里所描述的方法所使用的探针是锁核酸(LNA)探针。PNAs是本领域技术人员所熟知的。(见，例如 Koshkin et al.，(1998) J. AM. Chem. Soc.，120 :13252-13253)。
一条确定序列的探针可通过本领域普通技术人员所已知的技术产生，例如通过化学或生物化学合成，以及通过重组核酸分子的体外或体内表达，例如细菌或逆转录病毒载体。在杂交的条件下，这里所包括的探针对它们的互补核酸序列表现出特异性，其设计与脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，例如核糖体RNA (rRNA)或信使RNA (mRNA)，进行杂交。
只要发生杂交，根据这里所描述的方法所使用的探针可以与任意长度的核酸序列进行杂交。举个例子，探针可以与这些长度的核酸序列杂交5至15个碱基、5至25个碱基、5至50个碱基、5至100个碱基、5至250个碱基、5至500个碱基、5至1000个碱基、20 至25个碱基、20至50个碱基、20至100个碱基、20至250个碱基、20至500个碱基、20至 1000个碱基。在一个特定的具体实施方中，根据这里所描述的方法所使用的探针与15至 25个碱基长度的核酸序列进行杂交。在另外的特定具体实施方式
中，根据这里所描述的方法所使用的探针与18至22个碱基长度的核酸序列进行杂交。在另外的特定具体实施方式
中，根据这里所描述的方法所使用的探针与大约20个碱基长度的核酸序列进行杂交。
在特定的具体实施方式
中，根据这里所描述的方法所使用的探针长度约为5至 1000个核苷酸，约为5至750个核苷酸，约为5至500个核苷酸，约为5至250个核苷酸， 约为5至200个核苷酸，约为5至150个核苷酸，约为5至100个核苷酸，约为5至75个核苷酸，约为10至100个核苷酸，约为10至75个核苷酸，约为10至50个核苷酸，约为10至30个核苷酸，约为5至20个核苷酸，约为20至100个核苷酸，约为20至75个核苷酸，或约为30至100个核苷酸，或者它们之间的任何长度。在其他的一些具体实施方式
中，探针的长度大约 5，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31， 32，33，34，35，36，37，38，39或40个核苷酸。在特定的具体实施方式
中，根据这里所描述的方法所使用的探针长度为15至25个碱基。在其他的特定具体实施方式
中，根据这里所描述的方法所使用的探针长度为18至22个碱基。在其他的特定具体实施方式
中，根据这里所描述的方法所使用的探针长度为约20个碱基。在其他的特定具体实施方式
中，根据这里所描述的方法所使用的探针长度为约81个碱基。
在特定的具体实施方式
中，根据这里所描述的方法所使用的探针长度至多10个核苷酸，15个核苷酸，20个核苷酸，25个核苷酸，30个核苷酸，35个核苷酸，40个核苷酸， 45个核苷酸，50个核苷酸，55个核苷酸，60个核苷酸，65个核苷酸，70个核苷酸，75个核苷酸，80个核苷酸，85个核苷酸，90个核苷酸，95个核苷酸，100个核苷酸。在其他具体实施方式
中，探针长度少于 10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29， 30，31，2，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55， 56，57，58，59，60，70，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85 或 90 个核苷酸。
在特定的具体实施方式
中，根据这里所描述的方法所使用的探针与它们的互补核酸序列在高度严格、中等严格或低严格杂交条件下进行杂交，其中所使用的杂交条件的选择决定了杂交的严格程度。最适杂交条件取决于探针以及探针杂交核酸的长度和类型(例如RNA或DNA)。本领域技术人员都知晓当探针变短时，为了获得满意的杂交结果，那么就有必要调整它们的长度以达到一个相对均一的熔解温度。核酸严格杂交条件的一般性参数描述于 Sambrook et al.，MOLECULAR CLONING-A LABORATORY MANUAL (2ND ED.)，Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1989)以及Ausubel et al. ,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,vol. 2,Current protocols Publishing, New York(1994)中。在特定的具体实施方式
中，根据这里所描述的方法中使用的探针只有在高度严格的条件下才与它们的互补核酸序列进行杂交。高度严格条件的示例包括低盐浓度(例如，l_250mM Na+)，相对于探针熔解温度的高温(例如，从比溶解温度低5°C至比溶解温度高5°C的范围)，高pH值(例如，高于pHIO)，助溶剂的存在(例如1-20% DMSO或甘油)。
在一些具体实施方式
中，根据这里所描述的方法所使用的探针可以包括一个或多个额外的核酸序列，这些核酸序列不与探针的互补核酸序列杂交。如果第一序列被整合进诸如自杂交的探针(即，具有不同碱基区的探针，在没有互补序列存在的时候，在杂交实验情况下，这些碱基区可以相互杂交)中时，可以包括多于一个额外的核酸序列，如那些在 FRET中使用的那些。在一些具体实施方式
中，探针杂交的核酸序列包括额外的不与探针杂交的核酸。在其他的具体实施方式
中，探针杂交的核酸序列不包括额外的不与探针杂交的核酸。
这里所描述的方法所使用的探针可以以不同的特异性程度与它们的互补核酸序列进行杂交。在特定的具体实施方式
中，探针杂交的核酸序列与探针序列100%互补。在其他具体实施方式
中，探针杂交的核酸序列与探序列针超过90%互补。在其他具体实施方式
中，探针杂交的核酸序列与探针序列超过85%互补。在其他具体实施方式
中，探针杂交的核酸序列与探针序列超过80%互补。在其他具体实施方式
中，探针杂交的核酸序列与探针序列超过75 %互补。在其他具体实施方式
中，探针杂交的核酸序列与探针序列超过70 %互补。在其他具体实施方式
中，探针杂交的核酸序列与探针序列超过60%互补。
根据这里所描述的方法所使用的探针可以以任意浓度或量使用，只要所述探针的浓度或量足以达到该方法所需要的效果。在特定的具体实施方式
中，探针的使用量约为O.001 μ g，约为O. 01 μ g，约为O. I μ g，约为I. O μ g，或大于I. O μ g。为了达到所需要的探针浓度，可以将探针悬浮于适合这里描述的方法的缓冲液中。所使用的示例性的探针浓度包括 O. 0001 μ g/ml, O. 001 μ g/ml, O. 01 μ g/ml, O. I μ g/ml, I. O μ g/ml,以及 10. 0 μ g/ml 探针。在特定的具体实施方式
中，所使用的探针的量为约1.0nM，10nM，50nM，100nM，200nM， 300nM,400nM,500nM,600nM,700nM,800nM,900nM,IOOOnM,2000nM,3000nM,4000nM,5000nM, 或超过5000nM。在其他的具体实施方式
中，探针的量介于1.0恤和50001^之间，101^和 5000nM之间，IOnM和 2500nM之间，IOnM和 IOOOnM之间，50nM和 5000nM之间，50nM至 2500nM 之间，或50nM至IOOOnM之间。
在特定的具体实施方式
中，根据这里所描述的方法所使用的探针包含可检测标记。可检测标记是指基团，例如化学发光，荧光或放射性同位素基团或包含这些的基团，以及非同位素标记，例如酶或染料。在一些具体实施方式
中，可检测标记包含荧光供体基团、 荧光受体基团或者淬灭基团。在特定的具体实施方式
中，根据这里描述的方法所使用的探针包含荧光标记。在其他的特定具体实施方式
中，根据这里所描述的方法所使用的探针包含荧光标记和淬灭基团。可以直接或间接用可检测标记来标记探针。间接标记的方法在本令页域是已知的(见，Current Protocols in Immunology, Coligan et al. , eds. , 1997, John Wiley & Sons, Inc. U. S. A.，pp. 8. 10. 12-1. 10. 21)。直接在探针上连接可检测标记的方法对于本领域技术人员是熟知的。例如，由Burdick和Oakes提出的，公开于1990年5月30 日的欧洲专利公开文献NO. EP0370694A2，标题为“使用固相捕捉方法检测核酸的诊断试剂盒和方法”，其中披露了将标记物连接至探针的方法。举个例子，直接标记可通过在合成探针时将荧光染料标记的亚磷酸胺直接整合到探针上来完成。荧光标记的核苷类似物可从商业获得，或者通过本领域已知的合成方法产生(见Brumbaugh et al. , 1988,Proc. Natl. Acda. Sci(USA)，85 :5610_5614)。
在特定的具体实施方式
中，根据这里描述的方法所使用的探针包含荧光标记，当存在互补核酸序列时，发射自该探针的荧光信号比不存在互补核酸序列时发射自该探针的荧光的信号至少高 5%，10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%或 100%。在特定的具体实施方式
中，当存在互补核酸序列时，发射自该探针的荧光信号是不存在互补核酸序列时发射自该探针的荧光的信号至少I倍，I. 5倍，2倍，3倍，4倍，5倍，10倍，15倍，20 倍，50倍，100倍，500倍或1000倍。
在一个具体实施方式
中，探针可以包含一个或多个荧光基团。在另外的具体实施方式
中，探针可以包含一个或多个供体基团。在另外的具体实施方式
中，探针可以包含一个或多个淬灭基团。在另外的具体实施方式
中，探针可以包含一个或多个荧光受体基团。在一个具体实施方式
中，探针可以包含荧光基团和淬灭基团，它们都位于该探针中，以使得当不存在互补核酸序列时荧光基团和淬灭基团可以一起引入。在另外的具体实施方式
中，探针可以包含荧光供体基团和荧光受体基团，它们都位于该探针中，以使得当不存在互补核酸序列时荧光供体基团和荧光受体基团可以一起引入。举个例子，荧光供体基团可以位于探针的一个末端，而淬灭基团或荧光受体基团位于探针的另外一个末端，其中当没有与互补核酸结合或杂交时，该探针采用一种构象或二级结构，如茎环结构或发夹环，而当与互补核酸结合或杂交时，该探针采用一种不同的构象或二级结构。当探针与互补核酸结合时，淬灭基团或荧光受体基团与荧光供体基团分离，导致荧光信号的去淬灭。在其他的具体实施方式
中，探针可以包含荧光供体基团和荧光受体基团，它们都位于该探针中，以使得当探针与核酸序列杂交时，荧光受体基团能够接受来自于杂交到核酸序列上的附近探针的荧光供体基团的能量，以及荧光供体基团能够将能量转移至杂交到核酸序列上的附近探针的荧光受体基团上。
在特定的具体实施方式
中，用一个单独的荧光基团，一个单独的荧光供体基团，一个单独的荧光受体基团和一个单独的淬灭基团标记探针。在其他的具体实施方式
中，用超过一个荧光基团，超过一个荧光供体基团，超过一个荧光受体基团和超过一个的淬灭基团标记探针。在特定的具体实施方式
中，用一个单独的荧光基团和淬灭基团或荧光供体基团或荧光受体基团对来标记探针。在其他具体实施方式
中，使用不同的荧光基团和淬灭基团或荧光供体基团或荧光受体基团对来标记探针。
为了获得发生于荧光供体基团和荧光受体基团或淬灭基团之间的FRET，两个基团必须在空间上互相接近。因此，在特定的具体实施方式
中，探针同时含有荧光供体基团和荧光受体基团或淬灭基团，以使得荧光供体基团和荧光受体基团或淬灭基团相互之间的距离最多有O . 5nm,最多Inm,最多5nm,最多IOnm,最多15nm,或最多20nm。在其他的具体实施方式
中，在一个探针上的淬灭基团或荧光受体基团与荧光供体基团之间的距离约为10，15， 20,30,40,50,60,70,80,90,100，110，105，110，115，120，130，140 或 150A，或者它们中间的任何数值。在其他具体实施方式
中，探针同时包含荧光供体基团和荧光受体基团或淬灭基团，以使得荧光供体基团和荧光受体基团或淬灭基团相互之间的距离为至少2个，至少3 个，至少4个,至少5个,至少6个,至少7个,至少8个,至少9个,至少10个,至少15个， 至少20个，至少50个，至少100个或至少200个核苷酸。在其他的具体实施方式
中，探针同时包含荧光供体基团和荧光受体基团或淬灭基团，以使得荧光供体基团和荧光受体基团或淬灭基团相互之间的距离为2至5，2至10，2至15，2至20，3至5，3至10，3至15，3至 20，5 至 10，5 至 20，5 至 50，5 至 100，5 至 200，10 至 20，10 至 50，10 至 100，10 至 200，10 至 300，10 至 400，10 至 500，50 至 100，50 至 250，50 至 500，100 至 200，100 至 300，100 至 400， 或100至500个核苷酸。
rpoB 探针
根据这里所描述的方法中所使用的探针是分枝杆菌rpoB基因特异性的。分枝杆菌rpoB基因特异性探针可由本领域已知的方法或上面所描述的方法进行制备。在一个特定的具体实施方式
中，分枝杆菌rpoB基因特异性探针是与未突变的rpoB基因核心区杂交的。在其他的具体实施方式
中，分枝杆菌rpoB基因特异性探针与不包含核心区的rpoB基因区杂交。
在特定的具体实施方式
中，将对未突变分枝杆菌rpoB基因核心区特异性的探针设计为当百分之百互补时，未突变分枝杆菌rpoB基因核心区特异性探针只与它们的互补核酸序列进行杂交，即，如果与所述探针互补的rpoB基因核心区核酸序列含有突变，则探针并不会结合到该核酸上。在另外的具体实施方式
中，即便不是百分之百的互补，即，即便核酸序列包含突变，探针仍然能结合到不包含核心区的rpoB基因的核酸序列上，不包含核心区的分枝杆菌rpoB基因区特异性的探针也能与其互补的核酸序列进行杂交。
在特定的具体实施方式
中，选择分析的条件，以使得在特定的杂交条件下(例如， 高严格条件下)，未突变的分枝杆菌rpoB基因核心区特异性探针只会与它们的互补核酸序列进行杂交。在其他的具体实施方式
中，选择分析的条件，以使得即便没有完全互补，不包含核心区的rpoB基因区特异性探针也能与它们互补的核酸序列进行杂交，即，杂交条件是低至中等严格性。本领域技术人员应当可以理解，低、中等和高严格性条件是视相互作用的多种因子而定的，同时还取决于所述探针的特殊的设计。例如，对于典型的探针，高严格性条件可以包括探针熔解温度的上下5°C的温度，低盐浓度(例如，低于250mM)，高共溶剂浓度(例如，1-20%的共溶剂，例如DMS0)。另外一方面，低严格条件可以包括低于探针溶解温度超过10°C的温度，高盐浓度(例如，超过IOOOmM)，以及不存在共溶剂。
这里所描述的方法使用一个，两个，三个，四个或更多未突变分枝杆菌rpoB基因核心区特异性探针。根据这些方法，当rpoB基因核心区不包含能够赋予其抗微生物制剂利福平耐药性的突变时，未突变的分枝杆菌rpoB基因核心区特异性探针与rpoB基因核心区进行杂交，因此整个核心区都被rpoB探针所杂交。举个例子，如果这里所描述的方法使用了一个未突变分枝杆菌rpoB基因核心区特异性rpoB探针，则只要分枝杆菌rpoB基因核心区不含有突变，这个rpoB探针将与整个分枝杆菌rpoB基因核心区进行杂交；如果这里所描述的方法使用了两个未突变分枝杆菌rpoB基因核心区特异性rpoB探针，则只要分枝杆菌 rpoB基因核心区不含有突变，这两个rpoB探针一同将与整个分枝杆菌rpoB基因核心区进行杂交；如果这里所描述的方法使用了三个未突变分枝杆菌rpoB基因核心区特异性rpoB 探针，则只要分枝杆菌rpoB基因核心区不含有突变，这三个rpoB探针一同将与整个分枝杆菌rpoB基因核心区进行杂交；如果这里所描述的一个方法使用了四个未突变分枝杆菌 rpoB基因核心区特异性rpoB探针，则只要分枝杆菌rpoB基因核心区不含有突变，这四个 rpoB探针一同将与整个分枝杆菌rpoB基因核心区进行杂交。图I提供了当分枝杆菌rpoB 基因核心区内存在或不存在突变时，rpoB探针如何与分枝杆菌rpoB基因核心区杂交的示意图。
分枝杆菌检测探针
在特定的具体实施方式
中，使用了分枝杆菌检测探针。分枝杆菌检测探针包含可检测标记，例如，荧光标记，所述标记能够允许鉴定分枝杆菌是否存在在样品中。根据这里所描述的方法所使用的分枝杆菌检测探针包含核酸序列，该核酸序列与分枝杆菌中除rpoB 基因的核酸序列互补，例如，IS6110,16SrRNA, dnaj或85B抗原。
在特定的具体实施方式
中，分枝杆菌检测探针是特异性针对分枝杆菌的核酸序列，该核酸序列在分枝杆菌的多个菌株或品种中是保守的。在另外一个具体实施方式
中，分枝杆菌检测探针特异性针对特定分枝杆菌菌株或品种的核酸序列。
在一些具体实施方式
中，分枝杆菌检测探针特异性针对分枝杆菌中大量提供的核酸序列，例如16S核糖体RNA或23S核糖体RNA。
分枝杆菌除rpoB之外的其他基因的特异性探针
在一些具体实施方式
中，根据这里所描述的方法，使用了特异性结合分枝杆菌的除rpoB基因之外的其他基因的探针。根据此类具体实施例，这些探针对分枝杆菌的除rpoB 基因之外的其他基因是特异性的，其中所述的除rpoB基因之外的其他基因可以包括能够带来一个或多个抗微生物制剂耐药性的突变。示例性的探针设计所针对的分枝杆菌基因包括inhA基因、katG基因、ahpC基因、mabA基因、oxyR基因、pncA基因、rrs基因、rpsL基因、 embA基因、embB基因、embC基因、gyrA基因、gyrB基因或者nor基因(见Drobniewski and Wilson, 1998, J. Med. Microbiol. ,47 :189_196 ；Riska et al. , 2000, Int. J. Tuberc. Lung. Dis. ,4(2) :S4-S10)。在特定的具体实施方式
中，除rpoB基因之外的分枝杆菌其他基因的特异性探针包括荧光基团。在一些具体实施方式
中，除rpoB基因之外的分枝杆菌其他基因的特异性探针包含荧光基团和淬灭基团，其在探针上的位置使得在没有互补核酸序列存在的情况下淬灭基团和荧光基团能够靠在一起。在一些具体实施方式
中，除rpoB之外的分枝杆菌其他基因的特异性探针包含荧光供体基团和荧光受体基团，其在探针上的位置使得在没有互补核酸序列存在的情况下荧光供体基团和荧光受体基团能够靠在一起。在一些具体实施方式
中，除rpoB之外的分枝杆菌其他基因的特异性探针在没有互补核酸序列的情况下能形成发夹环。
在特定的具体实施方式
中，除rpoB之外的分枝杆菌其他基因的特异性探针只有在百分之百互补的情况下才能够与它们的互补核酸序列杂交，即，如果核酸序列含有一个突变，则该探针就不会与核酸序列结合。
封闭探针
在一些具体实施方式
中，这里所描述的方法中还使用了封闭探针。封闭探针设计为杂交到(i)这里所描述的方法中的rpoB探针；(ii)未突变rpoB基因核心区的核酸序列； 或(iii)rpoB基因核心区外的核酸序列。
在特定的具体实施方式
中，封闭探针至少部分地与rpoB探针的一部分互补，因此，在不存在含有与rpoB探针杂交的核酸的核酸样品时，封闭探针与rpoB探针杂交。在其他的具体实施方式
中，封闭探针至少部分地与未突变rpoB基因核心区的核酸序列杂交，因此，在不存在一个或多个rpoB探针时，封闭探针能与未突变的rpoB基因核心区杂交，而如果存在未突变的rpoB基因核心区，rpoB探针则与未突变的rpoB基因核心区杂交而不与封闭探针杂交。当封闭探针与rpoB探针的一部分互补时,只有在不存在rpoB探针杂交的未突变的分枝杆菌rpoB基因核心区时，封闭探针才会与rpoB探针杂交。当封闭探针至少部分与未突变的分枝杆菌rpoB基因核心区的核酸序列互补的时候，只有在不存在与未突变的分枝杆菌rpoB基因核心区杂交的rpoB探针时，封闭探针才会与未突变的rpoB基因核心区的核酸序列杂交。
在一些具体实施方式
中，封闭探针用淬灭基团标记，该淬灭基团能够淬灭封闭探针结合的rpoB探针上的荧光基团(例如，荧光供体基团)。
核酸样品
根据这里所描述的方法中所使用的核酸样品可以分离自，获得自，衍生自或取自任何来源,包括但不限于受试者(例如，人体或动物体)。
在特定的具体实施方式
中，所述来源被怀疑含有分枝杆菌，S卩，怀疑所述来源被分枝杆菌感染和/或污染。在其他的具体实施方式
中，来源被怀疑含有利福平耐药性的分枝杆菌。在其他的具体实施方式
中，来源被怀疑含有多重耐药性的分枝杆菌。
根据这里所描述的方法，核酸样品要被裂解。在特定的具体实施方式
中，核酸样品只含有分枝杆菌。在其他的具体实施方式
中，核酸样品含有来自于受试者的宿主细胞。在一些具体实施方式
中，核酸样品含有来自于受试者的宿主细胞，其中分枝杆菌定位于这些宿主细胞中。根据此类的具体实施方式
，宿主细胞同样被裂解。在一些具体实施方式
中，一种裂解剂被用于裂解核酸样品，例如，可以使用裂解核酸样品中的分枝杆菌和宿主细胞的一种裂解剂。在另一些具体实施方式
中，使用多于一种的裂解剂，例如一种裂解剂可用于裂解核酸样品中的分枝杆菌，而另一种裂解剂则用于裂解核酸样品中的宿主细胞。在特定的具体实施方式
中，将核酸样品裂解，并分离和/或纯化核酸样品中的分枝杆菌核酸。
在特定的具体实施方式
中，在这里所描述的一个或多个方法之前先裂解核酸样品。在其他的具体实施方式
中，裂解核酸的步骤可作为这里所描述的一个或多个方法的一个部分。裂解核酸样品可通过将它们与裂解剂相接触来进行。在一些具体实施方式
中，裂解剂是生物制剂，例如，诸如裂解酶，蛋白酶K或acheromo蛋白酶(acheromopeptidase)等酶类。在其他具体实施方式
中，裂解剂是化学制剂，例如离液剂或去垢剂(例如，异硫氰胺胍和十二烷基磺酸钠)。在进一步的具体实施方式
中，裂解剂包括一种或多种机械过程(例如，吹打，超声，费氏细胞压碎器)。在更进一步的具体实施方式
中，裂解剂是生物和化学制剂以及机械过程的组合。
根据这里所描述的一个或多个方法中使用的核酸样品，在其根据这里所描述的一个或多个方法使用之前，或者其作为这里所描述的一个或多个方法的一个部分之前，可以先对其进行处理/操作。举个例子，可以将核酸样品储藏(例如，在室温下，在37°C，在4°C， 在-20°C，或者在-70°C )，可以洗涤核酸样品(例如，移除那些不需要的组分)，和/或扩增核酸样品。在特定的具体实施方式
中，核酸样品被分为几个部分，可以以相同或者不同的方式来对它们进行处理/操作。在一些具体实施方式
中，核酸样品被分为几个部分，至少其中一个部分是根据这里所描述的一个或多个方法来使用，而剩下的核酸样品部分则被储藏 (例如，在室温下，在37°C，在4°C，在-20°C，或者在-70°C )。
在特定的具体实施方式
中，核酸样品从来源中分离或获得之后立刻就使用到根据这里所描述的方法中。在另外的具体实施方式
中，核酸样品从来源中分离或获得之后的最多30分钟，I小时，2小时，4小时，6小时，8小时，12小时，24小时就要使用到根据这里所描述的方法中。在一些具体实施方式
中，根据这里所描述的方法使用了核酸样品的一部分，而剩余的核酸样品保藏以便将来使用。根据此类的具体实施方式
，样品的剩余部分可以保藏在室温，或4°C，在_20°C，或者在_70°C。
在特定的具体实施方式
中，核酸样品或其部分可以通过以下处理浓缩核酸样品的所有或部分非液体部分，例如，通过离心。在一些具体实施方式
中，处理大体积的核酸样品来浓缩核酸样品，在之后丢弃不含有分枝杆菌核酸的核酸样品的的全部或部分，剩余的核酸样品则可应用于这里所描述的一个或多个方法中，或者在所述一个或多个方法之前进行处理/操作，例如，核酸样品可以被裂解，洗涤，在其他培养基中重悬，或者扩增。在其他的具体实施方式
中，含有非分枝杆菌的非液体成分的核酸样品，例如，血液成分，也可以被处理，以浓缩不是分枝杆菌的非液体成分。然后分离剩余的核酸样品，丢弃那些不是分枝杆菌的非液体组分。
可以根据这里所呈现的方法从中获得和使用核酸样品的受试者的例子，例如人类，包括但不限于无临床症状的受试者，清楚表现出或展现出1，2，3，4或更多个分枝杆菌感染症状的受试者，临床诊断为分枝杆菌感染的受试者，分枝杆菌易感性受试者(例如，受试者的生活方式使他们倾向于分枝杆菌感染或与分枝杆菌感染者接触的可能性增高，例如，与其他的已知患有结核的受试者接触)，怀疑患有分枝杆菌感染的受试者，正在接受分枝杆菌感染治疗的受试者，有分枝杆菌感染以及至少一种其他症状的受试者(例如，有2， 3，4，5或更多种症状的受试者)，以及已经被确诊为分枝杆菌感染的受试者。
核酸样品可以从受试者的任意组织或器官或者任意分泌物中获得。获得自受试者的代表性核酸样品包括但不限于，支气管肺泡灌洗液、支气管灌洗液、咽喉分泌物、气管吸出物、血液样品、血清样品、血浆样品、骨骼样品、皮肤样品、软组织样品、肠道标本、生殖道标本、母乳、淋巴样品、脑髓液、肋膜液、痰样品、尿液样品、鼻腔分泌物、眼泪、胆汁样品、腹水样品、脓水、大便、滑膜液、玻璃体液、阴道分泌物、精液、或尿道样品。在一些具体实施方式
中，可以从受试者中获得两个、三个或更多的核酸样品。
在一个具体实施方式
中，核酸样品包含为实施这里所描述的一个或多个方法所需要的最低量的分枝杆菌核酸。在其他的具体实施方式
中，核酸样品中的分枝杆菌核酸被扩增直到该样品包含为实施这里所描述的一个或多个方法所需要的最低量的分枝杆菌核酸。
在特定的具体实施方式
中，核酸样品包括至少I个菌群形成单位(CFU)，至少 IOCFU,至少 IO2CFU,至少 IO3CFU,至少 IO4CFU,至少 IO5CFU,至少 IO6CFU,或至少 IO7CFU 的分枝杆菌。
核酸扩增
本领域已知的任何扩增核酸的方法都可以用于扩增分枝杆菌的核酸。举个例子，扩增分枝杆菌核酸的方法可以是聚合酶链式反应(PCR)(见例如Sambrook, et al,. supra)，链置换扩增(SDA)，转录介导扩增(TMA)，基于核酸序列的扩增(NASBA)，滚环扩增， 螺旋置换扩增，或环介导的等温扩增(LAMP)。
在特定的具体实施方式
中，在实施这里所描述的一个或多个方法前扩增分枝杆菌的核酸。举个例子，将含有分枝杆菌的样品进行扩增反应，例如PCR，以便在实施这里所描述的方法前能够扩增分枝杆菌的一个或多个区域的核酸序列。在特定的具体实施方式
中， 扩增的分枝杆菌核酸序列是rpoB基因或rpoB基因的区域，例如，包含rpoB基因核心区的 rpoB基因的区域。在其他的具体实施方式
中，扩增的分枝杆菌核酸序列是非分枝杆菌rpoB 基因的其他基因或者非分枝杆菌rpoB基因的其他基因的区域，例如，inhA基因、katG基因、 ahpC基因、mabA基因、oxyR基因、pncA基因、rrs基因、rpsL基因、embA基因、embB基因、 embC基因、gyrA基因、gyrB基因或者nor基因。
在其他的具体实施方式
中，扩增分枝杆菌核酸的步骤作为这里所描述的一个或多个方法的一个部分。举个例子，将含有分枝杆菌的样品进行扩增反应，例如PCR，以便作为这里所描述的方法的一个部分扩增分枝杆菌的一个或多个区域的核酸序列。在特定的具体实施方式
中，扩增的分枝杆菌核酸序列是rpoB基因或rpoB基因的区域，例如，包含rpoB基因核心区的rpoB基因的区域。在其他的具体实施方式
中，扩增的分枝杆菌核酸序列是非分枝杆菌rpoB基因的其他基因或者非分枝杆菌rpoB基因的其他基因的区域，例如，inhA基因、 katG基因、ahpC基因、mabA基因、oxyR基因、pncA基因、rrs基因、rpsL基因、embA基因、 embB基因、embC基因、gyrA基因、gyrB基因或者nor基因。
5. 3. L I 实时 PCR
实时PCR，也称为动力学PCR，能够同时对一个DNA样品中的特定序列进行检测和定量(为拷贝数的绝对数目或当以DNA载入量或者额外的标准基因进行标准化时的相对量)O
在实时PCR —种方法中，可以使用探针来检测扩增的DNA，所述探针杂交到互补 DNA的时候可以发出荧光。根据该方法，使用荧光探针只能定量包含与所述探针互补的核酸序列的DNA ;因此，使用探针可以显著地提高特异性，甚至可以在存在一些非特异性DNA扩增的时候都可以允许定量。序列特异性探针的使用允许利用带有不同荧光标记的特异性探针在同一个反应中鉴定DNA的多个区域。每个PCR循环中，探针所杂交的核酸序列的增加导致荧光信号的增加。
检湿
根据这里所描述的方法，当供体基团将能量转移到受体基团所导致的荧光发射或者当荧光基团或其它可检测标记所发射的荧光的检测可以通过使用本领域已知的任意测量荧光发射的方法来完成，例如热循环仪/荧光计(实时PCR的装置)，荧光激光扫描仪，或者荧光微孔板阅读仪。
实时PCR装置
所谓的“实时"PCR包括同时扩增和检测PCR产物。最常见的是利用整合了荧光检测的热循环仪来完成该检测。在每个循环中都要进行样品中的荧光激发及检测其导致的荧光发射，使得可以在整个反应过程中累积分析荧光强度。
微孔板阅读仪
微孔板阅读仪是实验室设备，设计用于检测在微量平板中样品的生物学、化学或生理事件。可以在例如6-1538孔的微量平板中分析样品反应。微板分析的一种常用检测模式包括检测荧光密度。
在用微孔板阅读仪检测荧光密度时，第一光学系统(激发系统)用特定波长的光照射样品。由于照射，样品发射光(例如，荧光)，然后第二系统(发射系统)收集这些发射的光，将其与激发光分离开来(使用滤镜或单色仪系统)，以及使用光线检测器，例如一个光电倍增器(PMT)测量信号。
激光扫描
这里所描述的方法中使用的可检测标记可以通过使用激光扫描进行检测例如，使用一个荧光激光扫描仪(见，例如Schena et al.，1996，Genome Res. 6 :639_645)或者激光扫描共聚焦显微镜(例如，共聚焦激光扫描显微镜)。这里所描述的方法中使用的激光扫描方法可以是基于荧光的，例如，激光以一个特定波长激发荧光基团，然后可以检测荧光基团所发射出的荧光。
诊断方法
在特定的具体实施方式
中，这里提供了诊断患有分枝杆菌感染的受试者的方法， 例如人类，所述方法包括用这里所描述的一个或多个方法。在特定的具体实施方式
中，这里所展示的方法可以用于诊断受试者是否患有结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌、牛型分枝杆菌、 牛型分枝杆菌卡介苗或田鼠分枝杆菌感染。在特定的具体实施方式
中，这里所展示的方法可以用于诊断受试者是否患有结核。在其他的具体实施方式
中，这里所展示的方法可以用于诊断受试者是否被利福平耐药性的分枝杆菌感染。在其他的具体实施方式
中，这里所展示的方法可以用于诊断受试者是否被多重耐药性的分枝杆菌感染。
这里还包括监测受试者中分枝杆菌感染的方法，所述受试者已经被诊断为分枝杆菌感染。根据此类方法，可以通过检测受试者体内的分枝杆菌感染来获得该分枝杆菌是否已经获得了利福平耐药性或者变为多重耐药性分枝杆菌。可以通过对分离或获得自受试者的核酸样品实施这里所描述的方法来对感染进行监测。在特定的具体实施方式
中，在感染诊断之后，以特定的间隔(例如，至少每月一次)进行感染监测，直至不再检测到分枝杆菌为止。在特定的具体实施方式
中，患者先施用一次或多次抗微生物制剂，例如利福平或异烟肼，之后再进行感染的监测，例如，每周监测一次感染，两周一次，每月一次，两月一次，每六个月一次或每年一次。
治疗的选择
这里所描述的方法允许确定一个分枝杆菌是否含有一个未突变的分枝杆菌rpoB 基因核心区以及因此而可能对抗微生物制剂利福平敏感。这里所展示的方法还允许鉴定一个分枝杆菌是否对其他用于治疗分枝杆菌感染的抗微生物制剂敏感，例如，其他的利福平衍生物(例如，利福布汀、利福喷丁)、异烟肼、吡嗪酰胺、链霉素、乙胺丁醇、乙硫异烟胺、和环丙沙星。另外，这里所展示的方法可以为诊断患有分枝杆菌感染的患者选择合适的治疗方案提供信息。
举个例子，检测到样品中存在未突变的分枝杆菌rpoB基因核心区可以表明受试者可以用利福平进行治疗，而如果在样品中没有检测到未突变的分枝杆菌rpoB基因核心区则表明该受试者不应当使用利福平进行治疗。此外，确定受试者的样品中的分枝杆菌对一种或多种抗微生物制剂是否具有易感性/耐药性能够为治疗其他受试者提供信息，即， 其他受试者表现出分枝杆菌感染相同的症状，那么可以向他们施用相同的一种或多种抗微生物制剂。
除了能够方便为患者选择合适的治疗方案之外，确定分枝杆菌对一种或多种抗微生物制剂是否具有易感性/耐药性还有助于减少分枝杆菌从一个受试者向其他受试者的传播。
试剂盒
这里还展示了试剂盒，所述试剂盒在容器中包括一种或多种组分，所述组分是根据这里描述的方法，用于确定样品中分枝杆菌对于一种或多种抗微生物制剂具有易感性/ 耐药性所必需的。
在一个具体实施方式
中，这里所展示的试剂盒包括组合物，所述组合物含有一组探针，其中至少五个探针是未突变rpoB基因核心区特异性的rpoB探针，其中(i)第一和第三rpoB探针用荧光供体基团标记，(ii)第二和第四rpoB探针用不同的荧光受体基团标记， 以及(iii)第五探针用荧光基团标记；其中rpoB探针能与未突变的rpoB基因核心区进行杂交以使得荧光受体基团能够接受来自于荧光供体基团的能量转移。
在另外的具体实施方式
中，这里所展示的试剂盒包括一个组合物，所述组合物含有一组探针，其中至少五个探针是未突变rpoB基因核心区特异性的rpoB探针，其中(i)第一和第三rpoB探针用荧光供体基团标记，(ii)第二和第四rpoB探针用不同的荧光受体基团标记，以及(iii)第五探针用荧光基团和淬灭基团标记，其中，当不存在第五rpoB探针特异性杂交的未突变rpoB基因核心区的时候，第五探针能形成发夹环，因此，荧光基团的荧光就被淬灭；其中rpoB探针能与未突变的rpoB基因核心区进行杂交以使得荧光受体基团能够接受来自于荧光供体基团的能量转移。
在一个具体实施方式
中，这里所展示的试剂盒包括一个组合物，所述组合物含有一组探针，其中至少四个探针是未突变rpoB基因核心区特异性的rpoB探针，其中第一和第三rpoB探针用荧光供体基团标记，第二和第四rpoB探针用不同的荧光受体基团标记；其中 rpoB探针能与未突变的rpoB基因核心区进行杂交以使得荧光受体基团能够接受来自于荧光供体基团的能量转移。
在一个具体实施方式
中，这里所展示的试剂盒包括一个组合物，所述组合物含有一组探针，其中至少四个探针是未突变rpoB基因核心区特异性的rpoB探针，其中第一和第二rpoB探针用不同的荧光基团标记，第三探针用荧光供体基团标记，第四探针用荧光受体基团标记；其中第三和第四rpoB探针与未突变的rpoB基因核心区进行杂交以使得荧光受体基团能够接受来自于荧光供体基团的能量转移。
在另外的具体实施方式
中，这里所展示的试剂盒包括一个组合物，所述组合物含有一组探针，其中至少四个探针是未突变rpoB基因核心区特异性的rpoB探针，其中(i)第一和第二 rpoB探针用荧光基团和淬灭基团标记，其中，当不存在第一和第二 rpoB探针特异性杂交的未突变rpoB基因核心区时，rpoB探针会形成发夹环，则荧光基团的荧光就被淬灭，(ii)第三rpoB探针用荧光供体基团标记，以及(iii)第四探针用荧光受体基团标记； 其中第三和第四rpoB探针能与未突变的rpoB基因核心区进行杂交以使得荧光受体基团能够接受来自于荧光供体基团的能量转移。
在另外的具体实施方式
中，这里所展示的试剂盒包括一个组合物，所述组合物含有一组探针，其中至少四个探针是未突变rpoB基因核心区特异性的rpoB探针,其中rpoB 探针包括不同的荧光基团和淬灭基团，其中，在不存在rpoB探针特异性杂交的未突变的 rpoB基因核心区的情况下，rpoB探针会形成发夹环，因此荧光基团中的荧光就会被淬灭。
在其他的具体实施方式
中，这里所展示的试剂盒包括一个组合物，所述组合物含有一组探针，其中至少三个探针是未突变rpoB基因核心区特异性的rpoB探针，其中第一 rpoB探针用荧光基团标记，第二探针用荧光供体基团标记，第三探针用荧光受体基团标记； 其中第二和第三rpoB探针与未突变的rpoB基因核心区进行杂交以使得荧光受体基团能够接受来自于荧光供体基团的能量转移。
在另外的具体实施方式
中，这里所展示的试剂盒包括一个组合物，所述组合物含有一组探针，其中至少三个探针是未突变rpoB基因核心区特异性的rpoB探针，其中(i) 第一 rpoB探针包含荧光基团和淬灭基团，其中，当不存在第一 rpoB探针特异性杂交的未突变rpoB基因核心区时，rpoB探针会形成发夹环，则荧光基团的荧光就被淬灭，(ii)第二 rpoB探针用荧光供体基团标记，以及(iii)第三探针用荧光受体基团标记；其中第二和第三rpoB探针能与未突变的rpoB基因核心区进行杂交以使得荧光受体基团能够接受来自于荧光供体基团的能量转移。
在另外的具体实施方式
中，这里所展示的试剂盒包括一个组合物，所述组合物含有一组探针，其中至少三个探针是未突变rpoB基因核心区特异性的rpoB探针，其中rpoB 探针包括不同的荧光基团和淬灭基团，其中，在不存在rpoB探针特异性杂交的未突变的rpoB基因核心区的情况下，rpoB探针会形成发夹环，因此荧光基团中的荧光就会被淬灭。
在另外的具体实施方式
中，这里所展示的试剂盒包括一个组合物，所述组合物含有一组探针，其中至少两个探针是未突变rpoB基因核心区特异性的rpoB探针,其中rpoB 探针包括不同的荧光基团和淬灭基团，其中，在不存在rpoB探针特异性杂交的未突变的 rpoB基因核心区的情况下，rpoB探针会形成发夹环，因此荧光基团中的荧光就会被淬灭。
在其他的具体实施方式
中，这里所展示的试剂盒包括一个组合物，所述组合物含有一组探针，其中至少两个探针是未突变rpoB基因核心区特异性的rpoB探针，其中第一 rpoB探针用荧光供体基团标记，第二探针用荧光受体基团标记；其中当rpoB探针与未突变的rpoB基因核心区进行杂交以使得荧光受体基团能够接受来自于荧光供体基团的能量转移。
在另外的具体实施方式
中，这里所展示的试剂盒包括一个组合物，所述组合物含有一组探针，其中至少一个探针是未突变rpoB基因核心区特异性的rpoB探针,其中rpoB 探针包括荧光基团和淬灭基团，其中，在不存在rpoB探针特异性杂交的未突变的rpoB基因核心区的情况下，rpoB探针会形成发夹环，因此荧光基团中的荧光就会被淬灭。
在另外的具体实施方式
中，这里所展示的试剂盒包括一个组合物，所述组合物含有一组探针，其中第一探针是未突变rpoB基因核心区特异性的rpoB探针，第二探针与核心区外的rpoB基因区域互补，其中第一探针用荧光供体基团标记，第二探针用荧光受体基团标记，其中第一和第二探针都杂交到rpoB基因上以便荧光受体基团能够接受来自于荧光供体基团的能量转移。
在另外的具体实施方式
中，这里所展示的试剂盒包括一个组合物，所述组合物含有一组探针，其中第一探针与核心区外的rpoB基因区域互补，第二探针和第三探针是未突变rpoB基因核心区特异性探针，其中第一探针用荧光供体基团标记，第二探针用荧光受体基团标记，第三探针用荧光基团标记，其中第一和第二探针都杂交到rpoB基因上以便荧光受体基团能够接受来自于荧光供体基团的能量转移。
在另外的具体实施方式
中，这里所展示的试剂盒包括一个组合物，所述组合物含有一组探针，其中第一探针与核心区外的rpoB基因区域互补，第二、第三和第四探针是未突变rpoB基因核心区特异性探针，其中第一和第三探针用荧光供体基团标记，第二和第四探针用不同的荧光受体基团标记，其中rpoB探针杂交到rpoB基因上以便荧光受体基团能够接受来自于荧光供体基团的能量转移。
在另外的具体实施方式
中，这里所展示的试剂盒包括一个组合物，所述组合物含有一组探针，其中第一探针与核心区外的rpoB基因区域互补，第二、第三、第四和第五探针是未突变rpoB基因核心区特异性探针，其中第一和第三探针用荧光供体基团标记，第二和第四探针用不同的荧光受体基团标记，第五探针用荧光基团标记，其中rpoB探针杂交到 rpoB基因上以便荧光受体基团能够接受来自于荧光供体基团的能量转移。
在一些具体实施方式
中，这里所提供的试剂盒还包括分枝杆菌检测探针。
在特定的具体实施方式
中，这里所提供的试剂盒包括一种或多种用于裂解核酸样品、扩增核酸样品(例如，PCR引物)、分离核酸样品、纯化核酸样品和/或浓缩核酸样品的试剂。
在一个特定的具体实施方式
中，这里所提供的试剂盒包括一组或多组用于扩增分枝杆菌rpoB基因或其区域(例如，分枝杆菌rpoB基因核心区)的引物。在其他的具体实施方式
中，这里所提供的试剂盒包含一组或多组的用于扩增分枝杆菌除rpoB基因外其他基因或其区域的引物，例如，一组或多组的引物用于扩增分枝杆菌的inhA基因、katG基因、 ahpC基因、mabA基因、oxyR基因、pncA基因、rrs基因、rpsL基因、embA基因、embB基因、 embC基因、gyrA基因、gyrB基因或者nor基因或其区域。在另外的具体实施方式
中，这里所提供的试剂盒包括一种或多种缓冲液，例如，用于在杂交中洗涤的缓冲液。
在其他的具体实施方式
中，这里所提供的试剂盒包括一个或多个封闭探针，其中一个或多个封闭探针Q)与杂交到未突变分枝杆菌rpoB基因核心区的rpoB探针至少部分互补，因此在不存在含有rpoB探针杂交的核酸的核酸样品时，封闭探针与rpoB探针进行杂交；或(ii)与分枝杆菌rpoB基因核心区的核酸序列至少部分互补，而如果存在未突变分枝杆菌rpoB基因核心区时，rpoB探针与核心区杂交而不与封闭探针杂交。在一些具体实施方式
中，封闭探针包含一个自互补区域，因此，在不存在含有与封闭探针杂交的核酸的核酸样品时，封闭探针形成发夹环。在一些具体实施方式
中，封闭探针用淬灭基团标记，该淬灭基团能够淬灭封闭探针结合的rpoB探针上的荧光基团(例如，荧光供体基团)。
这里所展示的试剂盒可以包括如何利用试剂盒检测未突变分枝杆菌rpoB基因核心区的使用说明。在一个特定的具体实施方式
中，使用说明中推荐将阳性和阴性对照与测试样品平行检测。在一些具体实施方式
中，这里所展示的试剂盒包含样品，所述样品已知并不与试剂盒中所提供的一个或多个探针杂交(即，阴性对照)。在其他具体实施方式
中，这里所展示的试剂盒还包括已知能与试剂盒中所提供的一个或多个探针杂交的样品(即，阳性对照)。在其他的具体实施方式
中，这里所提供的试剂盒中包括已知能与试剂盒中所提供的一个或多个探针杂交的样品(即，阳性对照)以及一个已知并不与试剂盒中所提供的一个或多个探针杂交的样品(即，阴性对照)。
MM
这里展示系统，例如，自动化系统，该系统包括这里所展示的试剂盒或试剂盒中的组分以及能与计算机系统联合使用的计算机程序产品。在此类系统中，计算机程序产品可以包括计算机可读储藏介质和嵌入其中的计算机程序机制。计算机程序机制可以包括指令，以评估是否存在未突变分枝杆菌rpoB基因核心区以及是否存在分枝杆菌，和/或是否在除rpoB基因之外的分枝杆菌其他基因中存在突变。
这里所展示的一些系统包括这里所展示的试剂盒或试剂盒中的组分、具有中央处理单元和与中央处理单元匹配的内存的计算机。这里所展示的一些系统包括这里所展示的试剂盒或试剂盒中的组分、一个计算机可读介质、具有中央处理单元和与中央处理单元匹配的内存的计算机。内存储藏有指令，该指令用于评估是否存在未突变分枝杆菌rpoB基因核心区以及是否存在分枝杆菌，和/或是否在除rpoB基因之外的分枝杆菌其他基因中存在突变。在一些具体实施方式
中，内存包括能将这里所展示的方法得到的结果传递至远程计算机的指令，以及远程计算机包括能评估是否存在未突变分枝杆菌rpoB基因核心区以及是否存在分枝杆菌，和/或是否在除rpoB基因之外的分枝杆菌其他基因中存在一个突变的指令。
在一些具体实施方式
中，这里所展示的是一个计算机系统，该计算机系统包括一个计算机可读介质，所述可读介质包括评估是否存在未突变分枝杆菌rpoB基因核心区以及是否存在分枝杆菌，和/或是否在除rpoB基因之外的分枝杆菌其他基因中存在突变的结果。在一些具体实施方式
中，这里所展示的计算机系统包括
中央处理单元；
主要非易失性储存单元，例如，硬盘，用于储藏软件和数据，由存储控制器所控制的存储单元；
系统内存，例如高速随机读写内存(RAM)，用于存储系统控制程序，数据和应用程序，包括由非易失性储存单元装载的程序和数据，还可以包括只读内存(ROM)；
使用者界面，包括一个或多个输入装置(例如，键盘)以及显示或其它输出设备；
网络接口卡，用于连接任何有线或无线交流网络(例如，广域网，如因特网);
内部总线，用于连接前面所述的系统中的元件；以及
电源，用于为前面所述的元件提供电源。
计算机的操作主要通过操作系统来控制，所述系统由中央处理单元执行。操作系统可以存储在系统储存中。除了操作系统，执行系统可以包括文件系统，用于控制这里所展示的不同文件和数据结构的读取；训练数据，用于根据这里所展示的方法建立一个或多个决定规则；数据分析算法模块，用于处理训练数据，构建决策规则；一个或多个决策规则；数据评测模块，用于评估是否存在未突变分枝杆菌rpoB基因核心区以及是否存在分枝杆菌，和/或是否在除rpoB基因之外的分枝杆菌其他基因中存在突变。
该计算机可以包括软件程序模块和数据结构。每一个数据结构可以包括任何形式的数据存储系统，包括，但不限于，flat ASCII或二进制文件，Excel电子数据表格，相关的数据库(例如SQL)，或在线分析进程(OLAP)数据库(例如MDX和/或其变体)。在一些具体实施方式
中，此类的数据结构每一个都是以一个或多个包括等级结构的数据库的形式 (例如，星型架构)。在一些具体实施方式
中，此类的数据结构每一个都是以不包括明确的等级(例如，没有等级安排的维度表)的数据库形式。
在一些具体实施方式
中，每一个存储或能够访问计算机系统的数据结构是单一的数据结构。在其他的具体实施方式
中，此类数据结构实际上包括一群数据结构(例如，数据库，文件，档案)，所述数据结构可以或者不可以全部由同一台计算机控制。举个例子，在一些具体实施方式
中，一套训练数据可以包括一群Excel电子数据表，所述电子数据表可以存储在计算机中和/或在那些能通过广域网被其他计算机定位找到的计算机中。在另一个的例子中，一套训练数据可以包括一群Excel电子数据表，所述电子数据表可以存储在计算机中和/或可以分布于一个或多个计算机，所述计算机可以通过广域网被其他计算机定位找到。
上面所提到的一些模块和数据结构可以定位于一个或多个远程控制计算机中。举个例子，在一些具体实施方式
中，可使用网络服务类型的执行方式。在此类具体实施方式
中，评估模块可以位于一台客户端计算机中，该计算机能够通过网络与其他计算机进行交流。在一些具体实施方式
中，数据评估模块可以是一个交换网页。
在一些具体实施方式
中，一套训练数据和/或决策规则是位于同一台计算机中的，在其他的具体实施方式
中，一个或多个此类数据结构和模块可以被一台或多台远程计算机控制。数据结构和软件模块在一台或多台计算机中的任何安排都落在这里所展示的系统的范围之内，只要这些数据和软件模块对于其他计算机是通过网络或其他电子手段可以通过寻址而获得的。
在一些具体实施方式
中，装载在一个载体波上的数字信号包括关于这里所展示的方法的数据。在一些具体实施方式
中，装载在一个载体波上的数字信号包括对于是否存在未突变分枝杆菌rpoB基因核心区以及是否存在分枝杆菌，和/或是否在除rpoB基因之外的分枝杆菌其他基因中存在一个突变的确定。在一些具体实施方式
中，提供了一个图形用户界面用于确定是否存在未突变分枝杆菌rpoB基因核心区以及是否存在分枝杆菌，和/或是否在除rpoB基因之外的分枝杆菌其他基因中存在突变。该图形用户界面可以包括显示域，用于显示装载在一个载体波上的数字信号，而该载体波是从远程计算机接收的。
等同方式
本领域技术人员只需使用常规的实验可以意识到，或者能够确定许多对于这里所描述的发明的特定具体实施方式
的等同方式。此类的等同方式打算包括在下述的权利要求之中。
在说明书中提到的所有的公开文献，专利和专利申请在这里通过参考文献以相同的程度而引入本申请说明书中，如同每篇独立的公开文献、专利和专利申请都被特定地、单独地作为参考文献而被引入。
这里所引用或讨论的参考文献并不应当被解释为承认这些文献是作为本发明的现有技术。
权利要求
1.一种鉴定未突变分枝杆菌rpoB基因核心区存在的方法，包括(a)将核酸样品与含有一组探针的组合物接触，其中有至少四个探针是在允许rpoB探针与核心区杂交的条件下，特异性结合未突变rpoB基因核心区的rpoB探针，其中第一和第三rpoB探针用荧光供体基团标记，第二和第四rpoB探针用不同的荧光受体基团标记，其中 rpoB探针与未突变rpoB基因核心区杂交以使得荧光受体基团能够接受来自于荧光供体基团的能量转移；以及(b)分析当两个供体基团将能量转移到两个受体基团时所导致的荧光发射是否存在， 其中，如果存在当两个供体基团将能量转移到两个受体基团时所导致的荧光发射，表明存在未突变的rpoB基因核心区；而如果当两个供体基团将能量转移到两个受体基团时所导致的荧光发射不存在或减少，表明不存在未突变的rpoB基因核心区。
2.一种鉴定分枝杆菌存在以及未突变分枝杆菌rpoB基因核心区存在的方法，包括(a)将核酸样品与含有(i)分枝杆菌检测探针，和(ii)一组探针的组合物接触，其中有至少四个探针是在允许rpoB探针与核心区杂交以及检测探针与互补分枝杆菌核酸序列杂交的条件下，特异性结合未突变rpoB基因核心区的rpoB探针,其中第一和第三rpoB探针用荧光供体基团标记，第二和第四rpoB探针用不同的荧光受体基团标记；其中rpoB探针与未突变rpoB基因核心区杂交以使得荧光受体基团能够接受来自于荧光供体基团的能量转移；以及(b)分析杂交的检测探针和当两个供体基团将能量转移到两个受体基团时所导致的荧光发射是否存在，其中，(i)存在杂交的检测探针和存在当两个供体基团将能量转移到两个受体基团时所导致的荧光发射，意味着存在分枝杆菌和存在未突变的rpoB基因核心区； ( )杂交的检测探针不存在，以及当两个供体基团将能量转移到两个受体基团时所导致的荧光发射不存在或减少，意味着不存在分枝杆菌；(iii)杂交的检测探针存在，以及当两个供体基团将能量转移到两个受体基团时所导致的荧光发射不存在或减少，意味着存在分枝杆菌，但不存在未突变的rpoB基因核心区。
3.如权利要求I或2所述的方法，其中分枝杆菌是结核分枝杆菌，非洲分枝杆菌，牛型分枝杆菌，牛型分枝杆菌卡介苗或田鼠分枝杆菌。
4.如权利要求I或2所述的方法，其中未突变rpoB基因核心区的存在表明分枝杆菌对利福平是敏感性的，而如果未突变rpoB基因核心区不存在表明分枝杆菌对利福平是耐药性的。
5.如权利要求I或2所述的方法,其中该组探针进一步包括至少与rpoB探针部分互补的封闭探针，以使得在不存在含有与rpoB探针杂交的核酸的核酸样品时，封闭探针与rpoB 探针杂交。
6.如权利要求5所述的方法，其中封闭探针含有淬灭基团,其中该淬灭基团淬灭rpoB 探针上荧光供体基团或荧光受体基团上发射出来的荧光。
7.如权利要求I或2所述的方法,其中该组探针进一步包括封闭探针,所述封闭探针与未突变rpoB基因核心区的核酸序列至少部分互补，其中当rpoB探针不存在时，封闭探针与未突变rpoB基因核心区杂交，而当未突变rpoB基因核心区存在的时候，该未突变rpoB基因核心区与rpoB探针而不与封闭探针进行杂交。
8.如权利要求I或2所述的方法，其中至少一个rpoB探针包含自互补区域，当含有杂交到rpoB探针的核酸的核酸样品不存在的情况下，rpoB探针形成发夹环。
9.如权利要求I或2所述的方法，其中核心区包括81个核苷酸。
10.如权利要求I或2所述的方法，其中核酸样品是从受试者中分离或获得的。
11.如权利要求I或2所述的方法，其中核酸样品是从受试者的生物体液或组织中分离或获得的。
12.如权利要求11所述的方法，其中受试者是人类。
13.如权利要求12所述的方法，其中生物体液或组织是支气管肺泡灌洗液、支气管灌洗液、咽喉分泌物、气管吸出物、血液样品、血清样品、血浆样品、骨骼样品、皮肤样品、软组织样品、肠道标本、粪便样品、生殖道样品、母乳、淋巴样品、脑髓液、肋膜液、痰样品、尿样品、鼻腔分泌物、眼泪、胆汁样品、腹水样品、脓水、滑膜液、玻璃体液、阴道分泌物、精液或尿道样品。
14.如权利要求I或2的方法，其中核酸样品包括扩增的核酸。
15.如权利要求14所述的方法，其中扩增的核酸通过使用PCR、SDA、TMA,NASBA、滚环扩增、螺旋置换扩增或LAMP而产生。
16.如权利要求I或2所述的方法，其中步骤(a)包括在核酸样品中扩增核酸。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述的扩增使用PCR、SDA、TMA、NASBA、滚环扩增、 螺旋置换扩增或LAMP进行。
18.如权利要求I或2所述的方法，其中核酸样品进一步包括裂解剂。
19.如权利要求18所述的方法，其中裂解剂是裂解酶、加热、超声、压力或离液剂。
20.如权利要求I或2所述的方法，其中所述的荧光受体基团或荧光供体基团选自于下述FITC、ROX、GFP、Cy5、Cy5. 5、Cy3、Cy3B、GFP、YFP、RFP、CFP、若丹明红、德克萨斯红、氟硼突、IDR700、LightCycler610> LightCycler640> LightCycler670> LightCycler705> 以及 TAMRA0
21.如权利要求I或2所述的方法，进一步包括检测分支杆菌rpoB基因的非核心区中是否有突变。
22.如权利要求I或2所述的方法，进一步包括检测分支杆菌的inhA基因、katG基因、 ahpC基因、mabA基因、oxyR基因、pncA基因、rrs基因、rpsL基因、embA基因、embB基因、 embC基因、gyrA基因、gyrB基因或nor基因中的突变。
23.如权利要求4所述的方法，其中对利福平的耐药性意味着分支杆菌是多重耐药性分支杆菌。
24.一种试剂盒，包括含一组探针的组合物，其中至少四种探针是特异性结合分支杆菌未突变rpoB基因核心区的rpoB探针，其中第一和第三rpoB探针用荧光供体基团标记，第二和第四rpoB探针用两种不同的荧光受体基团标记，其中rpoB探针与未突变的rpoB基因核心区杂交以使得荧光受体基团能够接受来自于荧光供体基团的能量转移。
25.如权利要求24所述的试剂盒，其中分枝杆菌是结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌、牛型分枝杆菌、牛型分枝杆菌卡介苗或田鼠分枝杆菌。
26.如权利要求24所述的试剂盒，其中至少一个rpoB探针包括自互补区域，在不存在包含与rpoB探针杂交的核酸的核酸样品时，rpoB探针形成发夹环。
27.如权利要求26所述的试剂盒,其中至少一个rpoB探针包括淬灭基团。
28.如权利要求24所述的试剂盒，其中该组探针进一步包括一个或多个封闭探针。
29.如权利要求28所述的试剂盒，其中一个或多个封闭探针(i)至少部分与rpoB探针互补，以使得不存在包含与rpoB探针杂交的核酸的核酸样品时，封闭探针与rpoB探针进行杂交；和/或(ii)至少与所述核心区的核酸序列部分互补，其中当不存在rpoB探针时，封闭探针与未突变rpoB基因核心区杂交，而当存在分枝杆菌未突变rpoB基因核心区时，未突变rpoB基因核心区与rpoB探针杂交而不与封闭探针杂交。
30.如权利要求29所述的试剂盒，其中与rpoB探针至少部分互补的封闭探针包含淬灭基团，其中淬灭基团淬灭由rpoB探针上的荧光供体基团和/或荧光受体基团所发射的荧光。
31.一种自动化系统，其包含如权利要求24至30中任一项所述的试剂盒，以及与计算机系统联合使用的计算机程序产品。
32.如权利要求31所述的系统，进一步包括计算机可读存储介质以及嵌入其中的计算机程序机制，其中计算机程序机制包括评估是否存在未突变分枝杆菌rpoB基因核心区的指令。
33.一种自动化系统，其包含如权利要求24至30中任一项所述的试剂盒、以及含有中央处理单元和与中央处理单元匹配的内存的计算机。
34.一种自动化系统，其包含如权利要求24至30中任一项所述的试剂盒、计算机可读介质、以及含有中央处理单元和与中央处理单元匹配的内存的计算机。
35.如权利要求34所述的系统，其中内存中存储有用于评估是否存在未突变分枝杆菌 rpoB基因核心区的指令。
36.如权利要求35所述的系统，其中内存包括将这里所展示的方法的结果传递到远程计算机上的一个指令，远程计算机包括评估是否存在未突变分枝杆菌rpoB基因核心区的指令。
全文摘要
这里所展示的是确定未突变分枝杆菌rpoB基因核心区存在的方法。例如，这里所公开的方法通过确定分枝杆菌rpoB基因核心区是否包含突变，从而允许确定分枝杆菌是否是利福平抗性的。根据此类的方法，可以鉴定多重耐药性的分枝杆菌菌株。
文档编号C12Q1/68GK102947465SQ201080064378
公开日2013年2月27日 申请日期2010年12月17日 优先权日2009年12月21日
发明者托宾·J·赫利尔, 詹姆斯·G·纳多 申请人:贝克顿·迪金森公司