专利名称：用于检测恙虫病东方体的引物对和使用所述引物对的检测方法
技术领域：
本发明涉及用于诊断恙虫病东方体(Orientia tsutsugamushi)的引物对和使用所述引物对的诊断恙虫病东方体的方法，更具体而言，本发明涉及能够对恙虫病东方体(弓丨发恙虫病(scrub typhus)的原因)的16s核糖体RNA基因的碱基序列进行扩增的引物对和使用所述引物对通过对恙虫病东方体进行检测的恙虫病检测方法。
背景技术：
恙虫病为一种急性热病(febrile disease)，该病通过感染了恙虫病东方体的恙螨进行传播，并由于系统性血管炎而显示出特征性的临床症状。啮齿动物为主要宿主,幼螨(恙螨)为宿主和媒介。自恙虫病1951年首次在韩国报道以来，这种主要的秋季热病已蔓延至全国各地，特别是在九月至十一月期间。尤其是，已发生了如此之多的病例，以至于秋季中30%的患者都被诊断为恙虫病。恙螨叮咬后的1-2周内将产生如下症状:例如发热、发冷、头疼、肌肉疼痛和红斑性丘疹。对产生的特征焦痂的检测将有助于该疾病的早期诊断。通常，这一疾病的发展并不严重，并且抗生素对该疾病很有效。然而，如果发生延误诊断，则可产生如下形式的并发症:肺炎、急性肾衰竭、脑膜炎、脑炎、上胃肠道出血、多器官功能障碍、或者甚至更糟的心肌梗死或中风。这些并发症可能是致命的，因此快速而准确的诊断是改善患者预后所必不可少的。到目前为止，用于诊断恙虫病的方法包括如下方法:例如，通过培养以确认恙虫病东方体的方法、通过 对患者血清中的抗恙虫病东方体的抗体进行检测的方法、以及通过PCR(聚合酶链式反应)扩增对从患者血液中分离的恙虫病东方体的DNA进行检查的方法。在这些方法中，通过对恙虫病东方体进行培养的诊断方法需要至少几周来培养恙虫病东方体，这表明这一方法实际上不适合用于诊断患者的目的。所以，最常见的诊断方法为间接荧光抗体技术和免疫酶技术，其均为血清学检测方法。然而，上述方法仍具有如下缺点:由与其它病原微生物的交叉反应所造成的假阳性；从疾病症状开始后直至形成抗体需要几天，导致该疾病早期测试的低灵敏度；以及需要额外的跟踪测试来对诊断进行确认。介绍了恙虫病的另一诊断方法，该方法是通过PCR对来自患者血液的恙虫病东方体特异性DNA进行检测、以在恙虫病的早期阶段对其进行快速诊断的方法。PCR的实例包括:常规PCR ;或巢式PCR，巢式PCR通过对常规PCR进行改进而得到，并显示出高于常规PCR100倍的灵敏度；或实时PCR，在实时PCR的过程中，可在2小时内快速确认结果。在恙虫病的常规PCR诊断中，已尝试了使用各种靶蛋白基因(如47kDa、56kDa和groEL等)的PCR，相比常规PCR，更优选巢式PCR或实时PCR。因为当使用47kDa或56kDa基因作为靶标来进行常规PCR时，灵敏度低至至多10%。然而，巢式PCR具有如下缺点:由于将PCR进行了两次来增加灵敏度，因而确实需要比其它PCR更长的测试时间。同时，实时PCR具有如下缺点:由于需要非常昂贵的测试设备，在大多数医疗机构普遍使用方面存在局限。因此，迫切需要开发一种新的诊断方法，所述诊断方法相当简单而且低成本，并呈现高灵敏度和特异性。
发明内容
技术问题本发明人试图开发新的方法来对来自患者血液样品的恙虫病东方体进行方便易行的检测。结果，本发明人通过确认了如下内容而完成了本发明:通过对恙虫病东方体的16s核糖体RNA基因序列的一部分进行特异性扩增，甚至用现有的常规PCR，也能够实现高度准确的诊断。因此，本发明提供了恙虫病东方体的检测方法，该方法通过使用常规PCR对恙虫病东方体的16s核糖体RNA基因进行扩增。本发明的新方法克服了在常规PCR中灵敏度在10%以内的问题，同时还克服了在巢式PCR中进行两次或更多次PCR而导致需要更多工作量和时间以及高的污染潜在可能性的问题，并克服了在实时PCR中需要昂贵设备的问题。因此，本发明的方法在成本-工作量的效益方面是出色的方法，所述方法还提供了可与上述PCR相比拟的诊断准确度。技术方案为了实现上述目的，本发明人设计了恙虫病东方体的检测方法，以对恙虫病东方体的16s核糖体RNA基因序列进行扩增和鉴定。这一方法可通过制备能特异性扩增恙虫病东方体的16s核糖体RNA的引物而实现。以从感染有恙虫病东方体Boryoung菌株(该菌株在韩国非常常见)的患者的血液样品中扩增的16s核糖体RNA基因的碱基序列为基础来设计制备所述引物。因此，本发明的目的是提供用于诊断恙虫病的方法和用于检测恙虫病东方体的方法，其特征在于，所述方法包括在疑似患有恙虫病的患者的血液样品中使用16s核糖体RNA的引物扩增靶蛋白基因的步骤。本发明的另一目的是提供用于对恙虫病东方体进行检测的PCR试剂盒，所述PCR试剂盒包含所述引物。本发明的上述以及其它目的、特征和优点将在以下对优选实施方式和权利要求的描述中变得显而易见。有益效果 本发明涉及用于诊断恙虫病的方法，更具体而言，本发明涉及能够扩增恙虫病东方体(引起恙虫病的原因)的16s核糖体RNA基因的碱基序列的引物和使用所述引物对恙虫病东方体进行诊断和检测的方法。与通过扩增47kDa、56kDa和groEL基因进行分析的传统方法相比，本发明的诊断方法具有出色且高的诊断准确度。同时，当将本发明的引物用于常规PCR时，获得了相对提高的诊断准确度。另外，本发明的方法不仅在诊断准确度方面优于巢式PCR或实时PCR，而
且还简单便宜。
图1 为利用受试者工作特征(receiver operating characteristic, ROC)曲线来阐释对如下检测方法的诊断效率进行比较的图:使用由SEQ.1D.N0.1和SEQ.1D.N0.2表示的序列(来源于本发明的16s核糖体RNA)组成的引物对的恙虫病东方体检测方法；以及比较例1-6中的传统检测方法。
具体实施例方式本发明涉及恙虫病的诊断方法。更准确而言，本发明涉及使用PCR引物对恙虫病东方体(引起恙虫病的原因)的16s核糖体RNA基因的碱基序列进行扩增的恙虫病东方体检测方法。本发明还提供了用于扩增恙虫病东方体(引起恙虫病的原因)的16s核糖体RNA基因的喊基序列的PCR引物。本发明还提供了用于对恙虫病东方体进行检测的PCR试剂盒，所述PCR试剂盒包含所述引物。下文对本发明进行详细描述。本发明的特征在于制备PCR引物对来对恙虫病东方体的16s核糖体RNA基因进行扩增，以及对使用所述引物扩增的16s核糖体RNA基因进行检测。基于从感染有恙虫病东方体Boryoung菌株(该菌株在韩国非常常见)的患者的血液样品中扩增的16s核糖体RNA基因的碱基序列来设计本发明的引物。所述引物还可对其它模式菌株(如Gilliam、Karp、Kato)和各种其它菌株进行检测。本发明的特征 还在于通过使用所述引物扩增靶蛋白基因，所述靶蛋白基因为来自恙虫病疑似病例的血液样品中的16s核糖体RNA基因。PCR为聚合酶链式反应的简称。PCR包括所有PCR:最常见的常规PCR、双重PCR和巢式PCR (连续运行两次PCR)、以及高成本的实时PCR (在实时PCR过程中，可实时确认结果)，最优选包括常规PCR。本文中用于检测的PCR试剂盒可包括用于PCR的材料，例如参与聚合的酶、dNTP、缓冲液、矿物油、标准标记物、染色剂溴酚蓝或二甲苯FF以及用于扩增恙虫病东方体的16s核糖体RNA基因的PCR引物对。实施例如下实施例中所示的本发明实践的以及目前优选的实施方式仅用作说明。然而，可以理解的是，本领域技术人员在基于这一公开的考虑上可进行修改和改进，所述修改和改进在本发明的精神和保护范围之内。实施例1:引物制备基于从感染有恙虫Boryoung菌株(该菌株在韩国非常常见)的患者的血液样品中扩增的16s核糖体RNA基因的碱基序列来设计引物对，然而，还可对其它模式菌株(如Gilliam、Karp> Kato)和各种其它菌株进行检测。更具体而言，将所述引物对制备为用于GenBank登录号banki11356164HM352765:恙虫病东方体Boryoung基因型的正向引物(403-428位)和反向引物(577-601位)，其分别由SEQ.1D.N0.1和SEQ.1D.N0.2表示。还制备了用于其它区域的正向引物和反向引物，所述引物分别由SEQ.1D.N0.3-SEQ.1D.N0.36表示(参见表I)。[表I]
权利要求
1.一种用于对恙虫病进行诊断的引物对，所述引物对由选自于由如下序列所组成的组中的两种序列组成: 由SEQ.1D.N0.1-SEQ.1D.N0.36表示的寡核苷酸序列；以及 与上述序列具有至少90%同源性的、至少为18mer的序列。
2.根据权利要求1所述的用于对恙虫病进行诊断的引物对，所述引物对由SEQ.1D.N0.1和SEQ.1D.N0.2所示的序列组成。
3.一种使用权利要求1所述的引物对的恙虫病诊断方法。
4.根据权利要求3所述的恙虫病诊断方法，其中，所述引物对由SEQ.1D.N0.1和SEQ.1D.N0.2所示的序列组成。
5.根据权利要求3或4所述的恙虫病诊断方法，所述方法包括用聚合酶链式反应(PCR)对恙虫病东方体进行检测。
6.根据权利要求3或4所述的恙虫病诊断方法，其中，所述对恙虫病东方体进行检测包括下列步骤: 对恙虫病东方体 的16s rRNA基因的序列或所述序列的一部分进行扩增；以及 对其进行鉴定。
7.根据权利要求5所述的诊断方法，其中，所述聚合酶链式反应(PCR)为常规PCR。
8.一种用于对恙虫病东方体进行检测的PCR试剂盒，所述试剂盒通过扩增16s rRNA基因的序列或所述序列的一部分对恙虫病东方体进行检测，所述试剂盒包含权利要求1或2所述的引物对。
9.一种用于对恙虫病东方体进行检测的PCR试剂盒，所述试剂盒通过扩增16s rRNA基因的序列或所述序列的一部分对恙虫病东方体进行检测。
10.一种用于对恙虫病东方体进行检测的PCR试剂盒，所述试剂盒通过扩增16srRNA基因的序列或所述序列的一部分对恙虫病东方体进行检测，所述试剂盒包含由SEQ.1D.N0.1和SEQ.1D.N0.2所示的序列组成的引物对。
全文摘要
本发明涉及恙虫病的诊断方法，更具体而言，本发明涉及通过对恙虫病东方体(引起恙虫病的原因)进行检测的诊断方法，所述方法包括如下步骤基于恙虫病东方体的16s核糖体RNA基因序列制备引物对；然后使用所制备的引物对对恙虫病东方体进行检测。本发明的诊断方法不仅显示出高于其它传统方法(对47kDa、56kDa和groEL进行扩增和分析的方法)的诊断准确度，而且还非常简单方便，这表明所述方法在成本效益方面很出色。
文档编号C12Q1/68GK103080312SQ201080068717
公开日2013年5月1日 申请日期2010年8月27日 优先权日2010年6月24日
发明者金东民 申请人:朝鲜大学校产学协力团