专利名称：一种培育矮杆水稻的方法
一种培育矮杆水稻的方法技术领域
本发明属于植物转基因技术领域，具体而言是一种利用转基因抑制水稻中 0sDCL3a基因的表达培育矮杆水稻的方法。
背景技术：
水稻是我国重要的粮食作物，其产量和品质对于我国的粮食生产和粮食安全都至关重要的。最近年来，全球气候多变，台风、飓风增多，水稻倒伏现象严重，大大降低了水稻的产量和品质，我国粮食生产面临着严峻的考验。一般说来，高杆的水稻倒伏现象比较严重，矮杆水稻的抗倒伏能力比较强，因此培育矮杆水稻能够减少水稻的倒伏率、增加产量、 提高品质，是现代水稻育种中的热点问题之一。随着科学技术的进步，分子生物学在水稻育种方面发挥着越来越重要的作用。
小分子RNA是现代分子学研究的热点，具有调节功能的非编码小分子RNA是指长度为21-25 nt左右，大多在进化上具有序列保守的小分子RNA。它们不编码蛋白质，而是以RNA的形式，在转录后水平上通过降解mRNA或抑制其翻译等方式，参与调节真核生物染色体结构的维持、防御病毒及调控生长发育等过程。小分子RNA特别是miRNA的发现是近年来生命科学研究的一个重大突破。
小分子RNA根据其前体及其合成途径可以分为siRNA和miRNA (microRNA)两大类。其中，siRNA是由一种具有RNA酶III活性的Dicer切割长的dsRNA分子产生的，然后组装到一个名为RISC的蛋白复合物中发挥作用。动物中Dicer基因较少，如人、小鼠和线虫中只有一个Dicer基因，因此负责了全部miRNA和siRNA的生物合成。在果蝇中，Dicer-I 和Dicer-2则分别负责miRNA和siRNA的合成和代谢。植物DCL基因相对较多，功能也相对复杂，如拟南芥有四个DCL基因编码的蛋白，各自具有不同的功能。例如，dell突变体导致各种发育缺陷。dell强突变体使胚胎发育停止在球形胚期。dell弱突变体表现出各种不同的发育缺陷，例如，叶片形状改变、开花迟缓以及子房发育不正常等，进一步研究发现， dcll-9miRNA不能正常·积累。
本研究首次提供了一种利用水稻中Dicer的蛋白0sDCL3a培育矮杆水稻的方法， 这不仅提供了一种解决水稻倒伏的方法，而且为利用先进的小分子RNA技术解决现代育种问题提供了一个切实的方案，具有重要的意义。发明内容
本发明的目的是提供一种利用水稻中Dicer蛋白0sDCL3a培育矮杆水稻的方法， 该方法是利用转基因抑制水稻细胞中0sDCL3a基因的表达，从而获得矮杆的水稻。0sDCL3a 基因的脱氧核苷酸序列如序列表中序列2所示。
优选为利用RNA干扰技术抑制水稻中0sDCL3a基因的表达，具体步骤如下1，将a或b构建到pCAMBIA2300 (可购自cambia公司)载体上，得到pCAMBIA2300 — 0sDCL3aIR重组载体。
(a)序列表中序列I所示的核苷酸序列；
(b)由(a)中的核苷酸序列经过突变或替换得到的能够与(a)的反义链相结合的核苷酸序列。2，将 pCAMBIA2300 — 0sDCL3aIR 导入水稻细胞。其中，本发明以pCAMBIA2300为出发载体，携带有本发明水稻矮化相关的0sDCL3a 基因的植物重组表达载体可通过使用原生质体-化学介导法(Ca2+、PEG)、Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、花粉管导入、微注射、电激、基因枪、农杆菌介导等常规生物学方法中的任何一种或几种方法的组合转化水稻细胞、组织或器官，并将转化的水稻细胞、组织或器官培育成植株；所述组织和器官可包括宿主水稻的果荚、愈伤组织、茎尖、叶片和种子等。pCAMBIA2300 一 0sDCL3aIR转基因细胞系和转基因宿主菌均属于本发明的保护范围。
图I 为 pCAMBIA2300_0sDCL3aIR 的物理图谱。图2为0sDCL3a基因通过RNAi敲除后植株表现出的表型。图 3 为 pCAMBIA2300- 0sDCL3aIR转基因植株的 Small RNA Northern 杂交结果。
具体实施例方式下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见 《Molecular Cloning: A Laboratory Manual》(Sambrook, J. , Russell, David ff., Molecular Cloning: A Laboratory Manual,3rd edition,200I,NY,Cold Spring Harbor)。 所用引物及DNA序列均由上海英骏生物技术有限公司合成。
实施例一 PCAMBIA2300 — 0sDCL3aIR载体的构建 1， pUCRNAi载体的改造
PUCRNAi载体是在pUC18载体基础上改造得到，按照如下方法构建将pUC18载体经 BamHl和及^I酶切后，由T4聚合酶将其补平，以马铃薯基因组DNA为模板，利用正向引物 CCT GCA GGC TCG AGA CTA GTA GAT CTG GTA CGG ACC GTA CTA CTC TA 和反向引物CCT GCA GGG TCG ACT CTA GAG GAT CCC CTA TAT AAT TTA AGT GGA AAA 进行 PCR 扩增马铃薯 GA20氧化酶中的内含子。将扩增的产物以平端的方式插入PUC18载体的及丽71和及位点间，得到PUCRNAi载体。2， PCAMBIA2300ACT 载体的改造
PCAMBIA2300ACT是由pCAMBIA2300 (CAMBIA公司)载体基础上构建的，具体方法如下以水稻日本晴的基因组DNA为模板，用引物CGAATTCGAGCTCGGTACCC TCGAGGTCATTCATATGCTTGAGA 和 TCTAGAGGATCCCCGGGTACCTCTTCTACC TACAAAAAAGCTCCGCAC 进行PCR，扩增Actinl。将PCR产物经和油<^1酶切后插入pCAMBIA2300载体的 EcoRl和油a7I位点间，作为驱动的启动子，得到重组载体pCAMBIA2300ACT。3，pCAMBIA2300 — 0sDCL3aIR 载体的构建提取水稻日本晴植株花序的总RNA，用oligo d (T)为引物，反转录成cDNA，用引物 CX0022 (5’-CGCGGATCCAGTTCCAGAAATTGTA-3’)和 CX0023 (5’-CCGCTCGAGCATTAGGTACTTTTG ATCT-3’)进行PCR扩增，得到如许列表中序列1所示的核苷酸序列，该片段命名为OsDCL-3a-399。用XhoI和Bgl II酶切pUCRNAi，回收大片段与经及丽TI和损ol双酶切的PCR产物连接，将fls々aJa-399反向插入pUCRNAi的损ol和勒“/II位点间得到的重组载体命名为 pUCRNAi -0sDCL3a- >m。用 BatnHl 和 Sal\ 双酶切 pUCRNAi-fls々aJa-399，回收大片段与经及m HI和损ol双酶切的PCR产物连接，将0sDCL3a- >m正向插入pUCRNAi-fls々aJa_399 的BamHl和Sal\位点间得到的重组载体命名^\iC-0sDCL3aIR。再将用I3StI酶切 V\iC-0sDCL3aIR 得到的正反方向的茎环片段{0sDCL3a~399a-Qk2Q intron-0sDCL3a_399s) 插入pCAMBIA2300ACT中I3StI酶切位点间，重组载体命名为pCAMBIA2300-fls々aJa/T ，如附图1所示。
实施例二矮杆水稻的获得将重组表达载体pCAMBIA2300-fls々aJa77 通过根癌农杆(Agrobacterium tume faciens)菌株AGLl的介导转入水稻日本晴成熟种子愈伤组织，在愈伤组织分化出的芽长至3-5cm时，切下芽，移入附加25mg/L除草剂草铵膦的生根培养基(MS+25mg/L草铵膦)， 光照培养生根，得到TO代转基因植株；幼苗长至约8-lOcm高，培养瓶开盖炼苗1_2 天，洗去根部植物凝胶，种植于田间，常规管理。
转化获得的植株通过PCR验证新霉素磷酸转移酶II (NPTII)基因是否存在验证转基因是否成功。以植株的基因组DNA为模板，利用引物CX637(5' GATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTT3，)和 CX638 (5，CAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAA 3，) PCR扩增得到666bp的新霉素磷酸转移酶II片段的第一代转基因植株为TO代转基因植株。 结果得到10株TO代转pCAMBIA2300-fls々aJa77 植株。
该10株TO代pCAMBIA2300-fl^aJa77 转基因植株中有两株与野生型(正常未转基因的水稻日本晴)均表现明显异常的表型；pCAMBIA2300-fl^aJa77 转基因水稻植株表现植株变矮，我们得到了矮化的水稻(见附图2)。RT-PCR显示这些转基因株系中0sDCL3a 均有不同程度的过量表达。
实施例三矮杆水稻的检测和验证为了进一步验证pCAMBIA2300-fl^aJa77 转基因水稻植株，我们提取野生型日本晴和pCAMBIA2300-fls々aJa77 转基因苗叶片的总RNA，通过半定量RT-PCR鉴定0sDCL3a基因的表达。结果表明，在pCAMBIA2300-fls々aJa77 转基因水稻中0sDCL3a基因的表达水平相对于野生型日本晴明显下降。而OsDCLl和OsDClA的表达量在pCAMBIA2300-fls々aJa77 转基因水稻和野生型日本晴间没有变化，说明对0sDCL3a基因的敲除是特异的，转基因植株的异常表型是由于0sDCL3a的功能丧失造成的。
同时，提取水稻日本晴植株花序的总RNA，用oligo d (T)为引物，反转录成 cDNA,用引物 CX0022 (5，-CGCGGATCCAGTTCCAGAAATTGTA-3，)和 CX0023 (5，-CCGCTCGAG ATTAGGTACTTTTGATCT-3' ) PCR扩增序列2的自5’末端第1856位至22 位脱氧核糖核普酸，并连入 pGEM-T Easy 载体，得到重组载体 pGEM_0sDCL3a_399。以 pGEM_0sDCL3a_399 为模板，用引物M13 (+) (5’ -GTAAAACGACGGCCAG-3’)和引物CX0023进行PCR扩增。获得的序列是由T7启动子驱动下的序列2的自5’末端第1856位至22M位脱氧核糖核苷酸。以5该序列为模板，在17 RNA聚合酶的作用下，合成32P-UTP标记的RNA探针。所述RNA探针是将序列2的自5’末端第1856位至2254位脱氧核糖核苷酸中的T均替换为U得到的RNA。 分别提取三株TO代转pCAMBIA2300-tt^aJa77 植株植株花序的总RNA，利用如上RNA探针进行小分子RNA Northern杂交，结果表明三株表现为TO代转pCAMBIA2300-tt^aJa77 植株得到较强24nt和22nt的杂交条带(图3中泳道2_4)，而正常未转基因的水稻日本晴 (Nipponbare)植株未得到杂交条带(图3中泳道1，5)。这进一步说明了，我们通过抑制 0sDCL3a基因的表达，获得了矮化的水稻。
权利要求
1.一种培育矮杆水稻的方法，包括通过转基因抑制水稻中0sDCL3a基因的表达而获得矮杆水稻。
2.权利要求I所述的培育矮杆水稻的方法，其中所述转基因是将(a)或(b)序列所示的核苷酸导入水稻细胞中。(a)序列表中序列I所示的核苷酸序列；(b)由(a)中的核苷酸序列经过突变或替换得到的能够与(a)的反义链相结合的核苷酸序列。
3.权利要求2所述的培育矮杆水稻的方法，其中(a)或(b)序列所示的核苷酸是通过植物重组表达载体导入水稻的，优选所述植物重组表达载体是pCAMBIA2300-0sDCL3aIR。
4.植物重组表达载体，包含权利要求2所述的核苷酸序列，优选为 pCAMBIA2300-0sDCL3aIR。
5.经转化的微生物细胞，具有权利要求3所述的重组载体。
6.经转化的水稻细胞，具有权利要求3所述的重组载体。
全文摘要
本发明提供了一种利用水稻中Dicer蛋白OsDCL3a培育矮杆水稻的方法，该方法是利用转基因抑制水稻细胞中OsDCL3a基因的表达，具体地是利用RNA干扰技术抑制水稻中OsDCL3a基因的表达从而获得矮杆的水稻，对于水稻的抗倒伏具有重要的意义，应用前景广阔。
文档编号C12N5/10GK102533757SQ20111000006
公开日2012年7月4日 申请日期2011年1月2日 优先权日2011年1月2日
发明者储成才, 刘斌, 刘春艳, 宋显伟, 曹晓风 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所