专利名称：一种有效降低人体胆固醇、血脂水平的脂肪酶及其应用的制作方法
技术领域：
本发明申请涉及一种能够有效降低人体胆固醇、血脂水平的脂肪酶及其应用，属于生物技术领域。
背景技术：
脂肪酶，又称甘油三酯水解酶，是一类能催化长链脂肪酸甘油酯水解的酶，也可以催化该反应的逆反应，许多微生物分泌的脂肪酶还可以催化酯化反应、酯交换反应、醇解反应、酸解反应以及氨解反应等。脂肪肝(Fatty Liver)作为一种病理学概念，系指肝内脂肪含量超过肝湿重的 5%，或肝活检1/3以上肝细胞有脂肪变性且弥漫分布于全肝。其对应的临床概念是脂肪性肝病(Fatty Liver Disease, FLD)系指病变主体在肝小叶，以弥漫性肝细胞脂肪变(多为大泡性脂肪变)为病理特征的临床综合征。目前，按相关专业委员会的疾病诊断标准及有关共识可以明确的是1、脂肪性肝病在临床上根据患者有无过量饮酒史，分酒精性脂肪性肝病(酒精性脂肪肝)和非酒精性脂肪性肝病；2、酒精性肝病临床诊断通常分为轻症酒精性肝病、酒精性脂肪肝、酒精肝炎、酒精性肝纤维化和酒精性肝硬化；3、非酒精性脂肪性肝病一般在病理上分为单纯性脂肪肝以及由其演变的脂肪性肝炎(NASH)和肝硬化三种类型。高胆固醇血症和高脂血症是目前广泛存在于现代人的一种综合病征，并且有逐渐年轻化的趋势，它也是高血压、冠心病和糖尿病的重要的危险因素。目前，在临床上缺乏针对高胆固醇血症和高脂血症的有效的治疗手段和药物，常用的药物的治疗效果也不理想。
发明内容
本发明申请即是针对上述不足之处，提供一种能够应用于临床，并且能够有效降低人体胆固醇和血脂水平的脂肪酶。本发明申请的另一个目的是提供该种脂肪酶在制备降低人体胆固醇、血脂水平的药物中的应用。具体来说，本发明申请所述的一种有效降低人体胆固醇、血脂水平的脂肪酶，其特征在于所述的脂肪酶由以下的方法获得1、获得潮霉素抗性表达盒并克隆至目标质粒上，获得潮霉素抗性的重组质粒；2、分别扩增青霉的脂肪酶基因(PEL)、构巢曲霉的强启动子3-磷酸甘油醛脱氢酶启动子(PgpdA)和构巢曲霉色氨酸合成酶终止子(TtrpC)，得到有强启动子驱动的PEL基因表达盒；3、将该PEL基因表达盒插入到潮霉素抗性的重组质粒中，获得了含潮霉素筛选标记的PEL基因超表达载体；4、将含潮霉素筛选标记的PEL基因超表达载体转化工程农杆菌，利用农杆菌介导转化法将PEL基因表达盒转化到青霉菌株中，获得高表达脂肪酶的青霉基因工程菌；
5、将所述的青霉基因工程菌以菌丝体或孢子悬液接入种子培养基，在25-35°C、 200-300rpm条件下培养对小时后，以5% -20 %接种量转入发酵培养基，在25-35 °C、 150-300rpm条件下发酵2天后，经分离纯化得到所述的脂肪酶。其中，获得潮霉素抗性表达盒的方法包括PCR技术或限制性酶切技术。获得青霉的脂肪酶基因(PEL)、构巢曲霉的强启动子3-磷酸甘油醛脱氢酶启动子 (PgpdA)和构巢曲霉色氨酸合成酶终止子(TtrpC)的方法包括PCR扩增或限制酶克隆或化学合成技术克隆。其中所述的青霉菌为扩展青霉。所述的目标质粒为下列之一pCAMBIA1300、pCAMBIA2300、pCAMBIA3300 或 pHB。其中，所以培养基的成分如下1、种子培养基(% )黄豆饼粉 4，玉米淀粉 0. 8，Na NO3 0. 3，Na2HPO4 0. 2，K2SO4 0. 25，MgSO4 0. 03，FeSO4 0. 003 ；2、发酵培养基(% )黄豆饼粉 6，玉米淀粉 1，NaNO3 0. 4，Na2HPO4 0. 2，K2SO4 0. 3， MgSO4 0. 035，FeSO4 0. 02，CaCO3 0. 5，Na2CO3 0. 02。本发明申请所述的脂肪酶在制备降低人体胆固醇、血脂水平的药物中的应用。
图1为PV2+载体的结构示意图；图2为pCAMBIA2300载体的结构示意图；图3为pCAMBIA2302载体的结构示意图；图4 为 PMD18-T: :gpdA-Lip-TtrpC 载体的结构示意图；图5 为 pCHAMBIA2302: PgpdA-Lip-TtrpC 最终载体的结构示意图；图6为超表达载体pCHAMBIA2302 PgpdA-PEL-TtrpC的构建路线图；图7为构建的超表达载体pCHAMBIA2302: PgpdA-PEL-TtrpC的PCR鉴定图谱；其中，1-6 独立的农杆菌转化子、+ 阳性对照、-阴性对照、M :DL-2000Marker ；图8为青霉转基因菌株的PCR鉴定图谱；其中，1-5 独立的农杆菌转化子、+ 阳性对照、-阴性对照、M :DL-2000Markero
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明申请所述的本发明申请所述的一种有效降低人体胆固醇、血脂水平的脂肪酶进行进一步描述，目的是为了公众更好的理解本发明的技术内容，而不是对所述技术内容的限制，事实上，在本发明精神实质内，对本发明申请所述方法的改进，目标质粒和限制性内切酶的替换都是本领域一般技术人员无需创造性的劳动即可获得的，因此都在本发明申请所要求保护的技术方案之内。实施例一、超表达载体的构建采用如下的步骤(1)利用限制性内切酶Mc I, Kpn I将潮霉素抗性表达盒从质粒PV2+上酶切出来(如图1所示)，片段经凝胶回收，克隆到PCAMBIA2300质粒(如图2所示)的相应酶切位点上，获得具有潮霉素抗性的重组质粒pCHAMBIA2302(如图3所示)；潮霉素表达盒也可来自其它含该序列的任何DNA或者直接合成，用于构建PEL基因超表达载体的质粒除PCAMBIA2300外，还可用能在丝状真菌中表达的质粒如pCAMBIA1300、pCAMBIA3300等 pCAMBIA系列载体和pHB载体；(2)根据扩展青霉菌P. expansium的脂肪酶基因PEL (AF330635)的序列设计引物 (正向引物:TGACTAGT ATGTTGTTCAACTACCAATCTTT下划线的序列为限制性酶Spe I切点；反向引物:TGGATCCGCGGCCGCTTATCAGCTCAGATAGC下划线的序列为限制件酶Not I切点)，利用 PCR 技术扩增全基因序列，PCR 反应条件为95°C 5min ；95°C 30s, 56°C 30s, 72°C 90s, 35 个循环；72 °C IOmin ；(3)根据质粒pPAN7_l(Punt et al. 1987 Gene 56 :117-124)的序列设计引物(正向引物GCTATCTGAGCTGATAAGCGGCCGCGGATCCACTTAACGTTA,下划线的序列为限制性酶Not I 切点；反向引物:GTTTAAACTCGAGTGGAGATGTGGAGTGGGCGC,下划线的序列为限制件酶PmeI切点)，利用PCR技术扩增出色氨酸合成酶终止子TtrpC，PCR反应条件为95°C 5min ；95°C 30s, 56°C 30s, 72°C 60s，35 个循环；72°C IOmin ；(4)取(2)禾Π (3)的反应液各 1 μ L 作为模板，以(TGACTAGTATGTTGTTCAACTACCA ATCTTT)作为正向引物；以(GTTTAAACTCGAGTGGAGATGTGGAGTGGGCGC)作为反向引物，进行 PCR 扩增，PCR 的反应条件为95°C 5min ；95°C 30s, 56°C 30s，72°C 150s，；35 个循环；72°C IOmin0反应结束后，将PCR扩增产物进行凝胶柱回收，并克隆到PMD-18-T 载体，获得中间载体 PMD-18-T: PEL-TtrpC ；(5)根据质粒 pPAN7-l (Punt et al. 1987 Gene 56 :117-124 的序列设计引物(正向引物:GAGTCGAC GAATTCCCTTGTATCTCTACACAC下划线的序列为限制性酶Not I切点；反向引物:GAACTAGTCTGCTCAAGCGGGGTAGCTGTTAGT下划线的序列为限制性酶PmeI切点)利用PCR技术扩增强启动子PgpdA。PCR反应条件为95°C 5min ;95°C 30s, 56°C 30s, 72°C 150 35个循环；721 IOmin0利用限制性内切酶Ml I和Spe I将PgpdA克隆到载体 PMD-18-T: PEL-TtrpC 的相应位点，获得中间载体 PMD-18-T: :PgpdA-PEL_TtrpC(如图 4 所示)；(6)利用限制内切酶I和Rne I对载体PMD-18-T: PgpdA-PEL-TtrpC进行消化，回收表达盒PgpdA-PEL-TtrpC，然后克隆至pCHAMBIA2302相应位点，获得最终载体 PCHAMBIA2302: :PgpdA-PEL_TtrpC(如图5所示)，整个的构建过程如图6所示； (7)对含有最终载体pCHAMBIA2302 PgpdA-PEL-TtrpC的菌进行扩大培养， 并抽提质粒，利用冻融法转化工程农杆菌EHA105，随机挑选6株转化子，以(TGACTAGT ATGTTGTTCAACTACCAATCTTT)作为正向引物；以(TGGATCCGCGGCCGCTTATCAGCTCAGATAGC)作为反向引物，以载体PMD-18-T: =PEL-TtrpC为阳性对照，空EHA105为阴性对照，对这6株菌进行PCR鉴定，结果显示这6株菌均为阳性，见图7。实施例二、青霉基因工程菌的获得所述青霉基因工程菌的活动包括如下的步骤(1)挑取分离纯化后的野生型青霉接种于PDA平板上，于培养20天左右，用无菌水洗下成熟孢子；(2)将实例一中含终载体 pCHAMBIA2302: PgpdA-PEL-TtrpC 的工程农杆菌 EHA105接种于含有链霉素、卡那霉素(均为100μ g/ml)的LB液体培养基中^°C，200rpm过夜培养，用含有链霉素和卡那霉素(均为100yg/ml)的MM培养基重新活化，28°C，220rpm培养 48小时。吸取适量的培养物5000rpm离心去上清，并用IM液体培养基洗涤，最后用IM液体培养基稀释至0D600 = 0. 15，然后在^°C，220rpm的条件下培养6-8小时，至0D600 = 0. 5-0. 6 ；(3)将第(1)步得到的新鲜孢子配制成IX IO7个/mL浓度的悬浮液，随后取上述孢子悬液与步骤O)中的工程农杆菌等体积混合，取200 μ L均勻涂布到铺有玻璃纸的IM 固体培养基(含AS 200yg/mL)之上二8°C共培养60h，然后将玻璃纸反铺到含有潮霉素 (100 μ g/mL转化选择抗生素)、头孢菌素(500 μ g/mL，抑制农杆菌生长抗生素)的PDA培养基上培养2天，揭下玻璃纸，在条件下培养1-3天，将抗潮霉素的转化子挑出接种到二筛培养基上，如稳定传代，即是所述的青霉基因工程菌，如此获得了 30株青霉基因工程菌。随机挑选5株转化子进行扩大培养，并分别抽提基因组DNA，以(TGACTAGTATGTTG TTCAACTACCAATCTTT)作为正向引物；以(GTTTAAACTCGAGTGGAGATGTGGAGTGGGCGC)作为反向引物，以载体PMD-18-T: :PEL-TtrpC为阳性对照，野生型青霉基因组DNA为阴性对照，对这 5株菌进行PCR鉴定，结果显示这5株菌均为阳性，见图8。MM培养基的成分如下所述IM K2HPO4-KH2PO4 (PH7. 0) IOmL, M-N (MgSO4 ‘ 7H20 30g/L, NaCl 15g/L)20mL，l % CaCl2 ·2Η20 111^，20%葡萄糖1011^，0.01% 6504 IOmL, Spore element (ZnSO4 ·7Η20 IOOmg/ L, CuSO4 · 5H20 lOOmg/L, H3BO3 lOOmg/L, MnSO4 · H2O lOOmg/L, Na2MoO4 · 2H20 lOOmg/L) 5mL, 20% NH4NO3 2. 5mL，无菌水 941. 5mL。IM培养基的成分如下所述IM K-buf f er (PH4. 9) IOmL, M-N (MgSO4 ‘ 7H20 30g/L, NaCl 15g/L)20mL，l % CaCl2 ·2Η20 111^，20%葡萄糖1011^，0.01% 6504 IOmL, Spore element (ZnSO4 ·7Η20 IOOmg/ L, CuSO4 · 5H20 lOOmg/L, H3BO3 lOOmg/L, MnSO4 · H2O lOOmg/L, Na2MoO4 · 2H20 lOOmg/L) 5mL, 20% NH4NO3 2. 5mL，50%甘油 10mL，IM MES (PH5. 5)40mL, IOOmM AS(乙酰丁香酮)2mL，无菌 7jC 898. 7mLCM培养基加一半IM培养基的葡萄糖量，外加1. 5%琼脂，其它成份同IM培养基。PDA培养基(g/L)马铃薯，200 ；蔗糖，20 ；琼脂，15 ；PH自然。实施例三、产脂肪酶能力对比实验随机挑选实例2所得的青霉基因工程菌接种到PDA培养基上，培养10天后分别接入种子培养基50mL中，在^°C，210rpm摇床培养Mh，然后以10%的接种量分别转入发酵培养基Q50mL三角瓶装30mL发酵培养基)，在，210rpm条件下发酵48h ；然后将发酵液离心，取上清液进行脂肪酶活力检测。利用酸碱滴定法对脂肪酶活力进行检测。步骤取IOOmL三角瓶20只，分别加入4. OmL ρΗ9· 4的Gly-NaOH缓冲液和5. OmL橄榄油乳化液；放入震荡恒温水浴锅36°C水浴锅预热5分钟.酶液过滤后，用0.05mol/L pH9. 4 的Gly-NaOH缓冲液稀释使酶活为4_5u/mL后测定。往其中两个各加入ImL稀释好的酶液，缓慢振荡(60次/min) 10分钟(精确计时).另外两瓶做空白对照.立即加入95%酒精20mL(空白对照加入ImL稀释好的酶液)，摇勻，加入10mL30%的氯化钠溶液，摇勻；用 0. Olmol/LNaOH溶液滴定样品使其与空白对照的pH相同，记下0. Olmol/LNaOH用量。计算X = AXBXl/TXn式中 X—样品的酶活力(u/g或u/mL)；A——滴定样品时消耗标准0. Olmol/LNaOH的体积(mL)；B——滴定用NaOH的浓度(μ mol/mL)T——酶促反应时间(min)，η—稀释倍数；同时做两份平行，结果取平均值，所得结果表示至整数。平行试验相对误差不得超过 5.0%。PDA培养基(g/L)马铃薯，200 ；蔗糖，20 ；琼脂，15 ；PH自然种子培养基(%)黄豆饼粉 4，玉米淀粉 0. 8，Na NO3 0. 3，Na2HPO4 0. 2，K2SO4 0. 25，MgSO4 0. 03，FeSO4 0. 003发酵培养基(%)黄豆饼粉 6，玉米淀粉 1，NaNO3 0. 4，Na2HPO4 0. 2，K2SO4 0. 3， MgSO4 0. 035，FeSO4 0. 02，CaCO3 0. 5，Na2CO3 0. 02橄榄油乳化液的制取4% PVA溶液和橄榄油为2 1 (ν/ν)，放到小三角瓶里(外包冰块)，调整为转速为10000转/分，一次乳化3分钟，间隔3分钟，共乳化3次。转基因青霉和非转基因青霉的酶活力测定结果见下表
菌林编号WTTlT2T3T4T5酶活力 (IU/mL)3100 + 155320 + 305210 + 256130 + 405460 + 455750 + 50其中，WT为青霉野生型菌株，Tl，Τ2，Τ3，Τ4，Τ5 为独立的青霉转化子，由图可知， 转基因青霉的酶活力显著高于非转基因青霉的酶活力。实施例四、所述脂肪酶防治大鼠非酒精性脂肪肝实验研究一、试验材料1.受试药物及试剂脂肪酶(ZFM)受试药，0. 4g/粒，每瓶40粒，每人每次3 4粒，一日3次，由中国医药工业科研开发促进会提供，批号081223。成人(以60Kg体重计算)日用药量为4800mg， 即人每日每千克体重用量为80mg/kg。实验时先用适量吐温研磨，再用0.5%的羧甲基纤维素钠(CMC)按设计浓度配制。阳性药易善复(多烯磷脂酰胆碱胶囊)，228mg/粒，2粒/次，3次/d，M粒/盒。 塞诺菲安万特(北京)制药有限公司，批号D8139，国药准字H20059010。实验时先用适量吐温研磨，再用0.5%的羧甲基纤维素钠(CMC)按设计浓度配制。胆固醇(分析纯级)，成都科龙化工试剂厂，批号20071229 ；吐温_80(化学纯)，成都科龙化工试剂厂，批号:20050402 ；胆酸钠(Sodium Taurochlate)，上海Solarbio, 批号20060826 ；丙硫氧嘧啶片，50mg/片X 100片/瓶，上海复星朝晖药业有限公司，批号071105，国药准字H31021082，1,2丙二醇(分析纯)，天津市大茂化学试剂厂，批号 20051128 ；羧甲基纤维素钠，上海三浦化工有限公司，批号20010911。2.实验分组及剂量设计剂量分组见表1表1大鼠脂肪肝试验剂量与分组
权利要求
1.一种有效降低人体胆固醇、血脂水平的脂肪酶，其特征在于所述的脂肪酶由以下的方法获得(1)获得潮霉素抗性表达盒并克隆至目标质粒上，获得潮霉素抗性的重组质粒；(2)分别扩增青霉的脂肪酶基因(PEL)、构巢曲霉的强启动子3-磷酸甘油醛脱氢酶启动子(PgpdA)和构巢曲霉色氨酸合成酶终止子(TtrpC)，得到有强启动子驱动的PEL基因表达盒；(3)将该PEL基因表达盒插入到潮霉素抗性的重组质粒中，获得了含潮霉素筛选标记的PEL基因超表达载体；(4)将含潮霉素筛选标记的PEL基因超表达载体转化工程农杆菌，利用农杆菌介导转化法将PEL基因表达盒转化到青霉菌株中，获得高表达脂肪酶的青霉基因工程菌；(5)将所述的青霉基因工程菌以菌丝体或孢子悬液接入种子培养基，在25-35°C、 200-300rpm条件下培养对小时后，以5% -20 %接种量转入发酵培养基，在25-35 °C、 150-300rpm条件下发酵2天后，经分离纯化得到所述的脂肪酶。
2.根据权利要求1所述的一种有效降低人体胆固醇、血脂水平的脂肪酶，其特征在于 其中所述的青霉菌为扩展青霉菌。
3.根据权利要求1所述的一种有效降低人体胆固醇、血脂水平的脂肪酶，其特征在于 所述的目标质粒包括 pCAMBIA1300、pCAMBIA2300、pCAMBIA3300 或 pHB。
4.权利要求1所述的脂肪酶在制备降低人体胆固醇、血脂水平的药物中的应用。
全文摘要
本发明申请提供一种能够有效降低人体胆固醇、血脂水平的脂肪酶及其在制备抗高胆固醇血症和高脂血症的药物中的应用，通过高脂乳液灌胃大鼠，造成大鼠非酒精单纯性脂肪肝模型，考查该脂肪酶对大鼠非酒精单纯性脂肪肝的防治作用，结果表明，脂肪酶剂量组和模型对照组比较，可显著降低ALT活性及肝组织甘油三酯含量，同时也可减轻肝脂肪变性的程度，具有推广应用的价值。
文档编号C12N15/55GK102154238SQ20111000058
公开日2011年8月17日 申请日期2011年1月4日 优先权日2011年1月4日
发明者曹勇, 王剑英 申请人:深圳市绿微康生物工程有限公司