专利名称：Leber遗传性视神经病变线粒体DNA突变G10680A的快速检测方法
技术领域：
本发明涉及一种Leber遗传性视神经病变线粒体DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)突变G10680A的快速检测方法，属Leber遗传性视神经病研究技术领域。
背景技术：
Leber 遗传性视神经病(Leber hereditary optic neuropathy, LHON ；MIM 535000)是经典的线粒体遗传性疾病，即该病为母系遗传性疾病，主要由mtDNA的点突变引 起发病。LHON有两大临床特1、性别偏好，即男性青壮年是易发人群；2、不完全外显现象， 即携带mtDNA原发突变的个体不一定发病。目前对于LHON的研究开展较多，但是对于该病 的流行病学调查较少有报道，欧洲人群调查表明LHON人群频率为1/50000-1/25000，而在 亚洲人群特别是我国未见流行病学调查数据。超过95%的LHON患者携带mtDNA的三个原发突变G11778A、G3460A, T14484C之 一，少数患者会同时携带两个原发突变。临床上对LHON的诊断除依据典型的临床症状和 家族遗传史外，最终的确诊还包括对原发突变的检测。报道表明，在欧洲和我国LHON人群 中，三个常见原发突变的分布频率具有较大差异，G11778A在国人LHON患者中的频率高达 90%, G3460A的频率只在左右，T14484C占到约9%的病人，而在欧洲LHON患者中，这 三个突变的频率分别约为57%，20%和23%。临床上除确诊的LHON患者外，还存在大量的 疑似LHON患者，这些患者具有较典型的LHON临床症状，有或缺乏家族母系遗传史，不携带 三个常见原发突变。我们近期研究表明，在收集的16 例(疑似)LHON患者中，有843例 不携带三个常见的原发突变，同时我们还发现突变G3635A是我国LHON人群的一个稀有原 发突变，这也进一步说明我国LHON患者与欧洲LHON人群的mtDNA突变图谱存在差异。针 对这些疑似LHON病例进行研究，有望进一步丰富国人LHON患者mtDNA的突变谱，为我国 LHON疾病的遗传咨询和临床诊治提供依据。2009年，Yang等人报道了一个携带原发突变 T14484C的我国LHON大家系，该家系表现出完全外显率，这提示除T14484C外，一定存在其 它的影响因素导致家系所有母系患者的发病，经对先证者mtDNA全序列分析后发现，该家 系同时携带突变G10680A。该突变位于线粒体ND4L基因，在脊椎动物中具有较高的保守性， 因此该突变很可能与T14484C协同作用，导致了该LHON家系完全临床外显。我们在对10 个无常见原发突变的国人LHON家系研究后，在一个家系中检测到G10680A的存在。通过进 化医学分析方法，我们排除了其它mtDNA变异位点致病的可能性，同时未在检索的来自一 般人群5000多例个体中发现该突变的存在，因此我们提出突变G10680A是该LHON家系发 病的致病因素。我们未发表的数据表明，突变G10680A在我国LHON患者中占有一定的比例 (约为0. 5% )，这些研究提示G10680A是国人LHON患者的一个稀有致病突变。由于目前缺乏对LHON的有效治疗措施，因此通过分子遗传学检测对该病进行遗 传咨询及临床预防有着极其重要的作用。因此，对无原发突变Gl 1778A、G3460A、T14484C和 G3635A的LHON患者/家系进行G10680A突变检测，无疑对于该病的遗传研究、遗传咨询和预防具有重要的意义。目前有很多检测DNA突变的技术方法，如序列测定、单链构象多态性分 析(SSCP)、变性高效液相色谱(DHPLC)、及等位基因特异PCR。其中，等位基因特异 PCR(Allele-specific PCR, AS-PCR)方法操作简便、快速，所需实验器材简单，实验试剂经 济，因此该方法被广泛的应用于DNA突变或单核苷酸多态性(SNP)的检测。等位基因特异 PCR的原理是将一条引物的3'末端碱基设计成特异的突变碱基，配合适当的反向引物，有 突变的DNA因3 ‘末端与引物配对从而扩增得到突变特异的PCR产物，而无突变的DNA模 板不能与突变特异性引物配对，因此不能扩增得到PCR产物。通过常规的琼脂糖电泳检测 PCR产物的有无，进而来判断检测样本DNA是否存在突变。经文献检索，未见与本发明检测突变位点相同的公开报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速、简易、经济的Leber遗传性视神经病变线粒体 DNA突变G10680A的快速检测方法。本发明基于AS-PCR的原理，将突变特异的引物3'端第一位设计成A碱基(见 表1，L10680A)，用于扩增突变型DNA;在引物3'端第二位引入一个错配碱基(碱基A突 变成碱基T，形成T/T错配)，增强引物对突变DNA模板扩增的特异性；在mtDNA序列上远 离G10680A突变的区域，即包含4866-5461范围，设计了一对内参引物(见表1，L4887/ H5442)，用于监测PCR扩增反应体系是否合适及反应是否正常进行扩增。采用上述两对引 物(L10680A/H10972和L4887/H544》，在一个PCR反应中对待测标本DNA样品进行扩增。 无论检测的标本DNA是否含有G10680A突变，内参引物L4887/H5442都会扩增出PCR产物， 这样就避免了由于PCR失败而造成的突变G10680A假阴性的检测结果。PCR扩增产物经琼 脂糖电泳检测，依据突变特异的电泳图谱对G10680A突变进行基因分型，实现基因突变的 方便快速检测。由于线粒体DNA突变具有异质性，即突变的与正常的mtDNA共存的现象，如果检 测方法的灵敏度不够高，则会在有突变异质性的患者中不能检测到突变，从而导致假阴性 结果。本发明通过将正常人与含有G10680A突变病人的DNA样品按不同比例混合，进行 AS-PCR，以检测本技术方法的灵敏度，并提供本技术检测到的最低水平的突变DNA的技术参数。本发明利用等位基因特异PCR(Allele-specific PCR, AS-PCR)方法检测Leber遗 传性视神经病变线粒体DNA突变G10680A，具体步骤如下(I)DNA提取使用常规酚/氯仿法或试剂盒法从临床样本中提取基因组DNA。(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，进行PCR反应。PCR反应引物扩增引物序列及产物大小见表1表IAS-PCR所用引物组成、序列及产物大小引物名称引物位置引物序列5' -3'产物大小用途L10680A10661-10680ntAGTCTTTGCCGCCTGCGAta312 bp检测10680AH1097210972-10952ntTCAGGTAGTTAGTATTAGGAGL48874866-4887ntTGACAAAAACTAGCCCCCATCT596 bp内参H54425461-5442ntGCGATGAGTGTGGGGAGGAAPCR 反应体系总体系为 20 μ L，包含 30ng 基因组 DNA，IOmM Tris-HCl(pH 8.3)， 1. 5mM MgCl2, 50mM KCl，0. 5U TaKaRa rTaq, 175μΜ dNTP，突变特异引物 L10680A和 H10972 及内参引物L4887和H5442各0. 3 μ M。PCR 反应程序94°C，预变性 3min ；94°C变性 20s，61°C退火 20s，72°C延伸 30s，重 复30个循环；72°C延伸5min。(3) PCR产物检测取PCR产物3 μ L在1. 5%的琼脂糖凝胶上电泳，电泳缓冲液为 IX TAE, 150V恒压电泳15min，溴化乙啶染色5min，凝胶成像系统下观察拍照。(4)灵敏度检测能检到的最低水平的突变DNA的浓度以lng、2. 5ng、5ng、IOng和15ng的含有 G10680A突变的DNA为模板，用与步骤(2)和(3)相同的PCR反应体系和程序扩增并检测。能检到的最低水平的突变异质性将正常人DNA样本与含有G10680A突变的患者 DNA样本在总量为30ng的情况下按设定比例混合，使突变的DNA样本比例分别为5%、10% 和20%，将混合好的DNA模板按照与步骤(2)和(3)相同的PCR反应体系和程序扩增并检 测。本发明与其它现有技术相比，具有快速、简单、经济、准确、灵敏的特点，仪器设备 要求不高，适合于在大规模的临床样本检测中推广应用。本发明对于Leber遗传性视神经 病变的遗传研究及咨询具有重要的意义。
图1为用本发明方法进行等位基因特异PCR检测LHON线粒体突变G10680A的电 泳图谱。图2为本发明方法的灵敏度检测电泳图谱。
具体实施方案1、引物设计根据mtDNA G10680A突变，将突变特异的引物3'端第一位设计成A碱基(见表1， L10680A)，用于扩增突变型DNA，同时在引物3'端第二位引入一个错配碱基(碱基A突变 成碱基T，形成T/T错配)，以增强引物对于突变位点的特异性，在下游设计另一个引物(表 1，H10972)，和突变特异性引物一起扩增出一条312bp的突变特异的片段。同时，在mtDNA 4866-5461区段设计了 一对内参引物(见表1，L4887/H5442)，无论有无G10680A突变，内参 引物都能扩增得到一条596bp的片段。引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列
5及产物大小见表1。2、样本采集采集3例经过DNA序列测定证实携带有G10680A突变的DNA样本和3例正常人全 血样本。3、样品基因组DNA提取使用酚/氯仿法提取全血样本中基因组DNA。4、PCR 扩增PCR 反应体系总体系为 20 μ L，包含 30ng 基因组 DNA，IOmM Tris-HCl (pH 8. 3)， 1. 5mM MgCl2, 50mM KCl，0. 5U TaKaRa rTaq, 175μΜ dNTP，突变特异引物 L10680A和 H10972 及内参引物L4887和H5442各0. 3 μ M。PCR 反应程序94°C，预变性 3min ；94°C变性 20s，61°C退火 20s，72°C延伸 30s，重 复30个循环；72°C延伸5min。5、PCR产物检测PCR产物检测取PCR产物3 μ L在1. 5 %的琼脂糖凝胶上电泳，电泳缓冲液为 IX TAE, 150V恒压电泳15min，溴化乙啶染色5min，凝胶成像系统下观察拍照。6、灵敏度检测能检到的最低水平的突变DNA浓度以lng、2. 5ng、5ng、IOng和15ng的含有 G10680A突变的DNA为模板，用与步骤4和5相同的PCR反应体系和程序扩增并检测；能检到的最低水平的突变异质性将正常人DNA样本与含有G10680A突变的患者 DNA样本在保持总量为30ng模板DNA的情况下按一定比例混合，使突变的DNA样本比例分 别为5%、10%和20%，将混合好的DNA模板用与步骤4和5相同的PCR反应体系和程序扩 增并检测。用本发明方法进行等位基因特异PCR检测LHON线粒体突变G10680A的电泳结果 (见图1)。其中泳道1为未加DNA模板进行PCR扩增的阴性对照，泳道2-4为无突变G10680A 的正常人DNA样本扩增结果，泳道5-7为有G10680A突变的LHON患者DNA样本扩增结果， 泳道M为2000bp的核酸分子量标准。图中596bp的条带为内参条带，除了阴性对照外，所 有的检测样本都有此条带，表明PCR体系和条件合适，扩增成功；312bp的条带为突变特异 条带，只有G10680A突变存在的样本才会扩增出此条带。本发明方法的灵敏度检测结果(见图2)。其中泳道1为未加DNA模板进行PCR 扩增的阴性对照；泳道2-6分别为以lng、2. 5ng、5ng、10ng和15ng含有G10680A突变的 DNA为模板进行扩增的结果；泳道7-9为突变的与正常的DNA在总量为30ng模板DNA的情 况下混合，使突变的DNA比例分别为5%、10%和20%，再进行扩增的结果；泳道10为含有 G10680A突变的LHON患者DNA样本扩增结果；泳道M为2000bp的核酸分子量标准。如图所 示，本发明提供的实验条件最少能采用5ng的DNA为模板进行有效的扩增检测。在DNA模 板总量为30ng的情况下，本发明能检测到低至10%的G10680A突变的异质性水平。
权利要求
1. 一种Leber遗传性视神经病变线粒体DNA突变G10680A的快速检测方法，包括基因 组DNA提取、引物设计、PCR扩增、电泳检测步骤，其特征在于本快速检测方法的具体步骤如 下(1)使用酚/氯仿法或试剂盒提取法从临床样本中提取基因组DNA；(2)以步骤⑴提取的基因组DNA为模板，进行PCR反应，PCR反应引物为
全文摘要
本发明涉及一种Leber遗传性视神经病变线粒体DNA突变G10680A的快速检测方法，属Leber遗传性视神经病变研究技术领域。本发明基于AS-PCR的原理，将突变特异的引物3′端第一位设计成A碱基L10680A，同时在引物3′端第二位引入一个错配碱基(碱基A突变成碱基T，形成T/T错配)，在线粒体DNA序列的4866-5461区域，设计一对内参引物L4887/H5442。采用上述两对引物(L10680A/H10972和L4887/H5442)，在一个PCR反应中对待测标本DNA样品进行扩增。PCR扩增产物经琼脂糖电泳检测，依据突变特异的电泳图谱对G10680A突变进行基因分型，实现突变基因的快速检测。本发明具有简单、快速、经济、灵敏的特点。本发明对于Leber遗传性视神经病变的遗传研究及咨询具有重要的意义。
文档编号C12Q1/68GK102146443SQ20111000171
公开日2011年8月10日 申请日期2011年1月6日 优先权日2011年1月6日
发明者姚永刚, 张阿梅 申请人:中国科学院昆明动物研究所