专利名称：一种特异检测ApoE4基因型的试剂盒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学的领域，具体是ー种快速、特异性检测ApoE4基因型的试剂盒及其应用。
背景技术：
人类的载脂蛋白E(Ap0lip0pr0tein Ε,ApoE)由19qll. 2所编码，其基因常见有3 种表型，即ε 2、ε 3和ε 4等位基因所编码的3种载脂蛋白Ε2、Ε3和Ε4，构成6种不同的基因型。包括3种纯合子(ε 2/ ε 2、ε 3/ ε 3、ε 4/ ε 4)禾ロ 3种杂合子(ε 2/ ε 3、ε 3/ ε 4、 ε 2/ ε 4)。等位基因的改变造成ΑροΕ4对LDL受体亲和力更大，即ΑροΕ4 > ΑροΕ3 > ΑροΕ2， 从而影响脂蛋白代谢及血脂水平，ΑροΕ4/4基因型已作为心脑血管病发病的独立危险因素。 由于ApoE基因与胰岛素抵抗(IR)、肥胖等相关，因此检测ApoE基因型对医学分子流行病的研究有重要意义。目前，医学分子流行病检测ΑροΕ4基因型的方法主要是PCR-RFLP，首先从外周血抽提基因组DNA，选用ApoE外显子4侧翼序列设计引物进行ΑροΕ4的扩增，Hha I进行酶切， 然后对酶切产物进行垂直非变性PAGE进行分离，以确定其基因型。但是此种方法采样要求高，检测繁琐，不利于流行病学普查的使用，且创伤性的抽血获得基因组DNA并非被每个个体所接受，尤其是正常对照组的个体。ApoE外显子4序列GC含量很高，不易扩增，对基因型的检测结果有很大影响，有必要对扩增条件进行优化。因此，建立一种简单易行、无创伤的抽提基因组DNA，高效特异性扩增ApoE 4基因片段，快速检测ApoE4基因型的方法对ApoE4 基因型相关的分子流行病学和预防医学的研究有重要的意义。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供ー种判定时间短，准确性高的特异性检测ApoE4基因型的试剂盒及其应用。本发明的目的可以通过以下技术方案来实现ー种特异检测ApoE4基因型的试剂盒，其特征在干，该试剂盒由以下试剂组成 4wt%蔗糖水、10mmol/L的NaOH溶液、lmol/L的三羟甲基氨基甲烷(Tris)-HCl (pH 7. 5)溶液、ニ甲基亚砜(DMSO)、试剂I、试剂II、限制性核酸(Hha I)内切酶、IOXM Buffer。所述的试剂盒由表1所述配比的试剂组成，表 权利要求
1.ー种特异检测ApoE4基因型的试剂盒，其特征在干，该试剂盒由以下试剂组成 4wt%蔗糖水、10mmol/L的NaOH溶液、lmol/L的三羟甲基氨基甲烷(Tris)-HCl (pH 7. 5)溶液、分析纯ニ甲基亚砜(DMSO)、试剂I、试剂II、限制性核酸(Hha I)内切酶、IOXM Buffer。
2.根据权利要求1所述的ー种特异检测ApoE4基因型的试剂盒，其特征在干，所述的试剂盒由表1所述配比的试剂组成，表1
3.—种如权利要求1所述的特异检测ApoE4基因型的试剂盒的应用，其特征在干，试剂盒的应用的步骤如下(1)样本的制备和贮存10mL4%蔗糖水漱ロ IOs后3000r/min离心5min收集含有颊粘膜上皮細胞的沉淀，获取的标本若在短时间检测可贮存于-20°C，若在长时间检测可贮存于-80°C或液氮中备用；(2)进行ApoE4基因的PCR扩增；(3)ApoE4PCR产物经HhaI酶切后，酶切产物进行15% PAGE电泳；(4)參照Richard方法即可以简化判定ApoE4基因型。
4.根据权利要求3所述的ー种特异检测ApoE4基因型的试剂盒的应用，其特征在干，所述的ApoE4基因在利用PCR扩增，采用5wt%的ニ甲基亚砜对PCR反应程序进行优化，扩增的退火温度为70°C。
全文摘要
本发明涉及一种特异检测ApoE4基因型的试剂盒及其应用，试剂盒由以下试剂组成4％蔗糖水、10mmol/L NaOH溶液、1mol/L Tris-HCl(pH 7.5)溶液、DMSO、试剂I、试剂II、Hha I内切酶、10×M Buffer。其应用样本的制备和贮存；抽提基因组DNA；ApoE4基因的PCR扩增；ApoE4基因型的鉴定。与现有技术相比，本试剂盒提供的试剂可以无创获取个体的基因组DNA；高效扩增ApoE4基因，快速准确判定ApoE4的基因型，并可同时进行大量个体的基因型判定；判定时间短、准确性高，适用于分子流行病学和预防医学大规模筛查工作。
文档编号C12Q1/68GK102586404SQ20111000277
公开日2012年7月18日 申请日期2011年1月7日 优先权日2011年1月7日
发明者吕立夏, 张介平, 徐国彤, 谷辉杰, 邓佳齐 申请人:同济大学