专利名称：有机溶剂应答的表达载体及其在生物催化中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是一种生物技术领域的有机溶剂表达载体及其应用，具体为一种用有机溶剂应答启动子Potp构建的有机溶剂应答的表达载体及其在生物催化中的应用。
背景技术：
生物催化在合成精细化学品和生物修复领域具有广泛的应用潜力。作为一钟节能、环境友好、安全和有效的方法，全细胞催化正在吸引越来越多的关注。在生物催化中常常要接触到有机溶剂。比如在生物催化过程中为了增加反应物的溶解性或者避免产物的分解等原因常常要引入含有有机溶剂的双液相反应；在许多需要进行生物修复的污染区域也充斥着各种各样的达到饱和浓度的有机溶剂，比如苯、甲苯、二甲苯等。对于普通微生物而言，有机溶剂是有毒的，因为有机溶剂能够破坏生物大分子的结构，并且能够在细胞膜上积累从而打乱磷脂双层的有序结构，进而破坏细胞膜的结构和功能的完整性。有机溶剂的毒性是生物催化在环境和精细化学品生产领域应用的一大障碍。自1989年第一株耐有机溶剂微生物被分离以来，人们已经从各种生态环境中分离到大量耐有机溶剂微生物，其中以恶臭假单胞菌为多。这些微生物是极端微生物的一种， 它们通过细胞膜的坚固化，表达有机溶剂外排泵等方法来对抗有机溶剂的毒害。耐有机溶剂微生物在生物催化的诸多领域都具有重要的应用潜力，比如生物修复，精细化学品合成等。恶臭假单胞菌具有着诸多让人惊奇的特点，比如恶臭假单胞菌具有强大的代谢能力， 几乎可以降解任意形式的芳香族和脂肪族化合物，包括一些剧毒的化合物。恶臭假单胞菌还是土壤微生物中的主要类群，是一种比较安全的菌株，因而，在重组DNA技术和环境应用中有着较大的发展潜力。尤其值得关注的是，恶臭假单胞菌的某些菌株具有耐受有机溶剂的能力，这使得它们在工业催化和环境领域成为非常有用的菌株。这其中恶臭假单胞菌 (Pseudomonas putida) S12 是一个杰出的代表(Rui jssenaars H, 2007, J. Biotechnol. 131 S205-S206)，这株菌正在被开发成为用糖类化合物生产芳香化合物的平台菌株。然而，这些耐有机溶剂微生物往往不具备人们想要的催化活性，因此要利用有机溶剂耐受菌进行催化或者环境修复就需要使用基因工程的手段对这些微生物进行改造，以赋予其独特的催化能力，扩展微生物的应用范围，使其能够用适合于各种工业和环境需求。异源表达系统是改造微生物，扩展微生物菌株应用范围的有力工具，已经在生物催化中被广泛的应用，比如精细化学品生产、生物修复和生物脱硫。合适的异源表达系统不仅可以使微生物的菌株改造或者构建变得容易，而且可以赋予基因工程菌优良的特性，使得利用生物催化剂进行的大规模生产更经济可行。目前，仅有少量的基因操作工具可以在有机溶剂耐受的恶臭假单胞菌中使用，而且现存的操作工具大都是基于大肠杆菌乳糖操纵子的，诱导时需要使用价格昂贵的IPTG作为诱导物，这限制了它们在工业和环境领域的应用。启动子Ps,p是有机溶剂耐受菌株恶臭假单胞菌(P. putida) S12的有机溶剂外排泵基因的启动子，该启动子可以在多种廉价有机溶剂诱导下启动基因的转录，比如可以在芳香烃、烷烃和醇类的诱导下启动下游基因的转录。而且，该启动子对于普通的环境压力比如 PH、温度、盐浓度或者有机酸没有应答，这一特点将使得其下游基因更容易被人控制。尤其值得注意的是，这些有机溶剂同时也是工业生物催化中常用的溶剂，并且在污染环境中也时常存在。这一启动子用作表达载体的基因表达调控元件，将具有很大的优势，不仅可以用廉价的有机溶剂替代昂贵的IPTG，降低生物催化的诱导成本，还可以方便的直接利用微生物工业和环境中存在的有机溶剂对基因的表达进行诱导，节约操作步骤，降低成本。因此， 该启动子在生物催化尤其是双液相反应和环境生物修复领域降具有很大的应用潜力。
发明内容
本发明针对现有技术中的不足，提出了一种有机溶剂应答的表达载体及其在生物催化中的应用，本发明用有机溶剂应答启动子Potp构建，表现了较好的经济性和有效性，远好于用普通IPTG诱导载体构建的基因工程菌。本发明是通过以下技术方案实现的本发明涉及一种有机溶剂应答的表达载体，具体为有机溶剂应答的宽宿主组成型表达载体。所述的宽宿主组成型表达载体包括载体ρ匪S和载体pMMRS，由DNA元件、复制子 RSF1010、筛选标记基因bla、多克隆位点、基因间序列和有机溶剂应答启动子Ps,p组成，其特征在于，所述载体PMMS的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，所述载体pMMRS的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。所述载体的宿主为假单胞菌(含施氏假单胞菌、恶臭假单胞菌或荧光假单胞菌) 和大肠杆菌。所述的DNA元件，其中启动子Ps,p和调控基因srpRS源自恶臭假单胞菌 (P. puti da) S12，其他元件来自于载体pMMB66EH。所述载体pMMS，即大肠杆菌 DH5 α/pMMS (Escherichia coli DH5 α /pMMS)已被保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2010319，保藏时间为2010年11月四曰。所述载体pMMRS，即大肠杆菌 DH5 α/pMMRS (Escherichia coli DH5 α /pMMRS)已被保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2010320，保藏时间为2010年11月 29日。所述的恶臭假单胞菌，即恶臭假单胞菌DS23 (Psudomonas puti da DS23)，该菌株已被保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2010321，保藏时间为2010年11
月四日。所述的恶臭假单胞菌，即恶臭假单胞菌DT23 (Psudomonas puti da DT23)，该菌株已被保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2010322，保藏时间为2010年11
月四日。中国典型培养物保藏中心地址为武汉市武汉大学，武昌珞珈山，邮编430072。本发明还对上述的有机溶剂应答的表达载体在生物催化中的应用进行了研究，所述的载体PMMS和pMMRS，使用有机溶剂类化合物作为诱导剂，能对有机溶剂作出应答，可用于构建生物催化用工程菌，并适用于包括化合物合成、生物修复、生物转化的生物催化。
在生物催化中的应用，载体ρ匪S和pMMRS用于构建工程菌，所构建的工程菌用于生物催化。本发明以启动子Ps,p为基础，利用实验室已有的一个宽宿主范围载体PMMB66EH， 构建了可以在大肠杆菌和假单胞菌中自主复制，并可以被多种有机溶剂类化合物诱导的载体pMMS和pMMRS，并使用报告基因(氯霉素乙酰转移酶基因，cat)研究了所构建载体的可用性，研究了构建载体在生物催化尤其是双液相生物催化中的应用。本发明所构建的载体pMMS和pMMRS可以在各类假单胞菌菌株中启动基因的表达， 其中pMMRS在所有的菌株中都表现为诱导型表达载体，ρ匪S在恶臭假单胞菌(P.putida) S12中为诱导型，在其他菌株中表现为组成型表达载体。本发明同时用二苯并噻吩的生物脱硫反应为应用实例，考察了所构建表达载体在生物催化尤其是双液相生物催化中的优势。首先用本发明的载体构建了工程菌DS23，用普通载体(IPTG诱导的)构建了重组菌构建了工程菌DT23。然后用这两株菌进行了一系列的双液相反应。发现DS23可以被多种有机溶剂诱导表达脱硫的活力，在双液相反应体系中 DS23比用IPTG诱导的DT23活力更好，表现了较好的经济性和有效性。而且，在高浓度有机溶剂(50%的正己烷)存在条件下，DS23可在Mh内，使得ImM的二苯并噻吩被降解67%， 初始他的平均反应速率为2. 41mmolg (干细胞重Γ 这远好于用普通IPTG诱导载体构建的基因工程菌。
图1载体ρ匪S的构建图2PCR检测载体ρ匪S-cat，Ml, M2 分子量标记物；Cl 对照；Sl 样品图3载体pMMRS的构建图4PCR检测载体pMMRS-cat的构建，M3，M4 DNA分子量标记物；S3 以载体 pMMRS-cat为模板，Placl. f (MluI)和Placl. r (MluI)为引物进行PCR扩增的结果；S4 以载体pMMRS-cat为模板，Placl. f (MluI)和srpR. r (ApaI)为引物进行PCR扩增的结果；分子量单位为bp图5载体pMMS-ABCD的构建图6PCR验证ρ匪S-AB⑶的构建，Ml, M2 分子量标记物；泳道1_5 以重组载体为模板，温度递升PCR得到的dszAB⑶基因；Lane C 以ρ匪S载体为模板的对照PCR图7不同有机溶剂做诱导物和反应介质时菌株的脱硫情况图8DT23和DS23脱硫活力的比较图9高浓度50% (体积比)的有机溶剂存在时DS23的脱硫效果，(▼)二苯并噻吩浓度；(▲ ) 2-羟基联苯(二苯并噻吩降解产物)浓度
具体实施例方式下面结合具体的实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。下面实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法，具体参见《分子克隆实验室手册》(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照试剂和试剂盒制造厂商所建议的条件。本发明所有用到的DNA元件和微生物菌株均来自于已经公开发表文献资料，其序列信息和DNA本身均可以被公众获得， 详见表1和表2 ；其他各种材料均系本发明构建，可以用本发明所述的方法进行再构造；其中载体pMMABCD系本课题组之前的文献和专利中构建(Tao et al. 2006, Appl. Environ. Microbiol. 72 :4604-4609)，本发明使用它作为研究构建载体的可用性的参照。本实施例涉及的菌株列表表 1
菌株简述来源P. putida S12用作宿主CKieboom and de Bont 2001，Microbiology 147:43-51)P. putida Idaho用作宿主CCruden et al. 1992, Microbiol. 58:2723-2729)P. putida KT244(用作宿主(Williams and Murray 1974，J. Bacteriol. 120:416-423)P. fluorescens ACB用作宿主CKamerbeek et al. 2003, Appl. Environ. Microbiol. 69:419-426)本实施例涉及的载体列表表 2
载敝称简述来源pMMB66EHExpress vector, AmprCFiirste et al. 1986, Gene 48:119-131)pBAD322CExpress vector, CmrCCronan 2006, Plasmid 55:152-157)
pMMABCDpMMB66EH with ifeABCD，AmprCTao et al. 2006, Appl. Environ. Microbiol. 72:4604-4609)pMMB66EH-c atpMMB66EH with cat, Ampe本实施例构建pMMS-catpMMB66EH-cat with Psrp replacing Ptoc, Ampr本实施例构建pMMRS-catpMMRS-cat with srpR and srpS, Ampr本实施例构建pMMSpMMS-cat without cat, Ampr本实施例构建pMMRSpMMRS-cat without cat, Ampr本实施例构建pMMS-ABCDpMMS with rfszABCD, Ampr本实施例构建本实施例涉及的引物列表表权利要求
1.一种有机溶剂应答的表达载体，其特征在于，该载体为宽宿主组成型表达载体。
2.根据权利要求1所述的表达载体，其特征是，所述宽宿主组成型表达载体包括载体 pMMS和载体pMMRS，由DNA元件、复制子RSF1010、筛选标记基因bla、多克隆位点、基因间序列和有机溶剂应答启动子Potp组成。
3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征是，所述载体pMMS的核苷酸序列如SEQID No. 1所示。
4.根据权利要求2所述的表达载体，其特征是，所述载体pMMRS的核苷酸序列如SEQID No. 2所示。
5.根据权利要求1所述的表达载体，其特征是，所述载体的宿主为假单胞菌和大肠杆菌。
6.根据权利要求1所述的表达载体，其特征是，所述的有机溶剂应答启动子Psnj和调控基因srpRS源自恶臭假单胞菌S12，其他元件来自于载体pMMB66EH。
7.一种根据上述任一权利要求所述的表达载体在生物催化中的应用，其特征在于，所述载体pMMS和所述载体pMMRS使用有机溶剂类化合物作为诱导剂对有机溶剂作出应答，用于构建生物催化用工程菌、化合物合成、生物修复、生物转化的生物催化。
全文摘要
一种生物技术领域的有机溶剂应答的表达载体及其在生物催化中的应用，其中有机溶剂应答的宽宿主组成型表达载体，包括载体pMMS和载体pMMRS，由DNA元件、复制子RSF1010、筛选标记基因bla、多克隆位点、基因间序列和有机溶剂应答启动子Psrp组成，其特征在于，所述载体pMMS的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述载体pMMRS的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明在生物催化尤其是双液相生物催化中的优势。表现了较好的经济性和有效性且在高浓度有机溶剂存在条件下，用有机溶剂诱导载体构建的工程菌远好于用普通IPTG诱导载体构建的基因工程菌。
文档编号C12N15/78GK102154357SQ20111000401
公开日2011年8月17日 申请日期2011年1月11日 优先权日2011年1月11日
发明者刘艳华, 徐友强, 李福利, 苏斐, 许平, 陶飞, 马翠卿 申请人:上海交通大学