专利名称：一种苗期鉴别辣椒细胞质育性的分子标记方法
技术领域：
本发明属于辣椒育种领域，涉及一种植物分子标记方法，尤其涉及一种苗期鉴别 辣椒细胞质育性的分子标记辅助育种的方法。
背景技术：
辣椒是一种重要的常异花授粉蔬菜作物，杂种优势非常明显。目前我国辣椒杂交 种在生产上已占据主要地位，主要推广品种都是品种间或自交系间一代杂交种。这类杂交 种子在生产上虽然增产潜力很大，但其制种时必须人工去雄，费工费时，而且由于辣椒雌雄 同花同位，种子纯度很难保证，成本较高。辣椒雄性不育性状的利用，解决了杂种优势人工 制种去雄这一难题，降低了生产成本，成为杂交种选育的有效途径。辣椒雄性不育可分为细胞核雄性不育(GMS)和核质互作雄性不育(CMS)，其中利 用核质互作型辣椒雄性不育需要同时选育“三系”，包括雄性不育系，控制育性的基因型为 S (msms)，为不育型细胞质；保持系，控制育性的基因型为N (msms)，为可育型细胞质；恢复 系，控制育性的基因型为N (MsMs)或S (MsMs)。辣椒三系中不育系的不育性由核不育基因 和细胞质内的不育因子互作控制，属于核质雄性不育(CMS)。只有核不育基因与细胞质不育 因子共同存在时，才能引起雄性不育。这种类型的不育性既要筛选到保持系，又要找到恢复 系，才能可以实现三系配套。然而辣椒核质互作雄性不育系在生产上的应用受到很多不利 因素的限制。首先是育性恢复基因的分布不广泛，尤其在灯笼型辣椒类型中分布更少，配组 自由度很低，大大限制了其应用，是目前不育系应用的最大阻碍。其次是不育源较少，选育 周期长。这些已成为辣椒质核互作雄性不育性利用的瓶颈。开展辣椒生物技术的研究，使之与常规育种技术更紧密地结合。辣椒CMS雄性不 育系、保持系和恢复系的选育周期长，如果能找到与不育基因或恢复基因紧密连锁的标记， 必将有助于缩短这个过程。近年来发展起来的DNA分子标记具有量大、中性、可在任何时期 分析、不受植株生长发育环境条件的影响等优点，为利用分子标记辅助选择辣椒雄性不育 系和CMS恢复系提供了可能。
发明内容
针对上述背景技术中存在的缺陷或不足，本发明的目的在于，提供一种苗期鉴别 辣椒细胞质育性的分子标记方法，该方法步骤简单快捷、稳定可靠，鉴别结果与田间花器官 育性鉴定结果准确一致、重复性好，特别适用于辣椒CMS雄性不育分子标记辅助育种，能够 很好地提高选择效率，加速育种进程。为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案
一种苗期鉴别辣椒细胞质育性的分子标记方法，其特征在于，该方法按以下步骤进
行
1)人工设计合成一对特异核苷酸序列作为引物，其中 正向弓丨物5，-CCCACACAAGACACATCACA-3，；反向引物5，-CGTACGAAATTCTTGGGCTTA-3，；
2)提取辣椒线粒体DNA，以步骤1)的引物对辣椒线粒体DNA进行PCR扩增，并对扩增 产物以0. 8%的琼脂糖凝胶进行电泳；
3)对电泳结果进行分析，若电泳结果中出现特异条带，则表示该泳道中的扩增产物是 不育型细胞质植株；若电泳结果中没有出现特异条带，则表示该泳道中的扩增产物是可育 型细胞质植株。上述PCR扩增的具体实现条件是
(1)15μ L PCR 反应体系10 倍 PCR buffer 1.5 μ L、25 mmol Γ1 MgCl2 1.2 μ L、5 U · μ L-1Ta^ DNA 聚合酶 0· 12 μ L、5mmol · L-1 dNTPs 0. 3μ L.20 μ mol · L-1 正向弓|物 1· 0 μ L、20ymol · Γ1 反向引物 L 0μ L、40ng · μ L_1mtDNA 0. 5 μ L 以及 ddH20 9. 38 μ L ；
(2)PCR扩增反应在PCR仪上进行，反应条件是94°C预变性5min；94°C变性lmin，58°C 退火1 min，72°C延伸lmin，进行30个循环；最后72°C延伸IOmin ；于4°C保存备用。上述辣椒线粒体DNA采用高盐-蛋白酶K法提取。本发明的苗期鉴别辣椒细胞质育性的分子标记方法，采用人工设计合成特异核苷 酸分子，以辣椒CMS雄性不育系、保持系线粒体DNA为模板扩增，创建和优化辣椒CMS雄性 不育性状可育型细胞质与不育型细胞质的分子标记技术体系，开发出与辣椒CMS细胞质育 性紧密连锁的分子标记，以期加快辣椒CMS雄性不育分子育种进程。这一方法用于辣椒 苗期细胞质育性筛选，能极大地加速辣椒CMS雄性不育亲本系的选育及杂种一代的育种进 程。
图1是3个辣椒CMS雄性不育系及其3个保持系线粒体DNA PCR扩增产物0. 8 % 琼脂糖凝胶电泳分析示意图。图2是本发明所提供的第一实施例中6个辣椒品系线粒体DNA PCR扩增产物0. 8 %琼脂糖凝胶电泳分析示意图。图3是本发明所提供的第二实施例中6个辣椒品系线粒体DNA PCR扩增产物0. 8 %琼脂糖凝胶电泳分析示意图。以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。
具体实施例方式参见图1，图1是3个辣椒CMS雄性不育系及其3个保持系线粒体DNA经PCR扩增 后，其R扩增产物经0. 8%琼脂糖凝胶电泳分析示意图，其中，图中的标记分别是
M表示Biomed DM09-50 bp Ladder DNA Marker泳道；1表示不育系200A的扩增产物 泳道；2表示保持系200B的扩增产物泳道；3表示不育系201A的扩增产物泳道；4表示保持 系201B的扩增产物泳道；5表示不育系202A的扩增产物泳道；6表示保持系202B的扩增产 物泳道。发明人给出以下的实施例，这些实施例仅是用于理解本发明，本发明不限于这些 实施例。实施例1 1、人工设计合成一对特异核苷酸序列为引物，其中 正向引物5，-CCCACACAAGACACATCACA-3，
反向引物5，-CGTACGAAATTCTTGGGCTTA-3，
2、辣椒线粒体DNA的提取采用高盐-蛋白酶K法(刘光照等，辣椒不育系和保持系线 粒体差异基因获得及SNP分析[J]，中国农业大学学报，2010，15 (5):19 24)分别提取6个 辣椒品系 T130、P65、GS102、PB3、B40、L33 的线粒体 DNA03、以步骤1的引物分别对上述6个辣椒品系线粒体DNA进行PCR扩增，扩增产物 经0. 8%琼脂糖凝胶电泳，参见图2，T130、GS102、L33的植株可出现长度为270bp的特异条 带，鉴别为不育型细胞质；而P65、PB3、B40的植株无此条带，鉴别为可育型细胞质；其中，M 是Biomed DM09-50 bp Ladder DNA Marker泳道；1是T130的扩增产物泳道；2是P65的扩 增产物泳道；3是GS102的扩增产物泳道；4是PB3的扩增产物泳道；5是B40的扩增产物泳 道；6是L33的扩增产物泳道。PCR扩增体系如下
(1)15 μ L PCR 反应体系10 倍 PCR buffer :1. 5 μ L,25 mmol · L-1 MgCl2 1. 2μ L,5 U ‘ μ L-1Ta^ DNA 聚合酶 0. 12μ L,5 mmol .171 dNTPs 0. 3μ L,20ymol .Γ1 正向引物 1. 0 μ L， 20 μ mo 1 · Γ1 反向引物 1· 0μ L，mtDNA 0· 5μ L (40 ng · μ Γ1)，ddH20 9. 38 μ L。(2) PCR扩增反应在ABI 2720型PCR仪上进行，反应条件为94°C预变性5min ； 94°C变性lmin，58°C退火lmin，72°C延伸lmin，进行30个循环；最后72°C延伸lOmin。随 后于4°C保存备用。上述6个辣椒品系在田间测交结果表明品系T130、GS102、L33具有不育型细胞 质，而品系P65、PB3、B40具有可育型细胞质。因此，利用本发明创制的鉴别苗期鉴别辣椒 细胞质育性的分子标记与植株真实性状相一致，适用于辣椒CMS雄性不育分子标记辅助育 种。实施例2:
1、人工设计合成一对特异核苷酸序列作为引物，其中 正向引物5，-CCCACACAAGACACATCACA-3，
反向引物5，-CGTACGAAATTCTTGGGCTTA-3，
2、辣椒线粒体DNA的提取采用高盐-蛋白酶K法(刘光照等，辣椒不育系和保持系线 粒体差异基因获得及SNP分析[J]，中国农业大学学报，2010，15 (5):19 24)分别提取6个 辣椒品系 P121、P134、K12、K35、FG42、MlO 的线粒体 DNA03、以步骤1所述特异核苷酸序列为引物，分别对上述6个辣椒品系线粒体DNA进 行PCR扩增，扩增产物经0. 8%琼脂糖凝胶电泳，参见图3，P134、K35、RM2的植株可出现长 度为270bp的特异条带，鉴别为不育型细胞质；而P121、K12、MlO的植株无此条带，鉴别为 可育型细胞质；其中，M是Biomed DM09-50 bp Ladder DNA Marker泳道；1是P121的扩增 产物泳道；2是P134的扩增产物泳道；3是K12的扩增产物泳道；4是K35的扩增产物泳道； 5是TO42的扩增产物泳道；6是MlO的扩增产物泳道。PCR扩增体系如下
(1) 15 μ L PCR 反应体系10 倍 PCR buffer :1· 5 μ L,25 mmol · L-1 MgCl2 1. 2 μ L,5 U ‘ μ L-1Ta^ DNA 聚合酶 0. 12μ L,5 mmol .171 dNTPs 0. 3μ L,20ymol .171 正向引物 1. 0 μ L，20 μ mo 1 · L-1 反向引物 1. 0μ L, mtDNA 0. 5 μ L (40ng · μ L-1)，ddH20 9. 38 μ L。(2) PCR扩增反应在ABI 2720型PCR仪上进行，反应条件为94°C预变性5min ； 94°C变性lmin，58°C退火lmin，72°C延伸lmin，进行30个循环；最后72°C延伸10 min。随 后于4 °C保存备用。上述6个辣椒品系在田间测交结果表明品系P134、K35、RM2具有不育型细胞质， 而品系P121、K12、M10具有可育型细胞质。因此，利用本发明创制的鉴别苗期鉴别辣椒细胞 质育性的分子标记与植株真实性状相一致，适用于辣椒CMS雄性不育分子标记辅助育种。
权利要求
1.一种苗期鉴别辣椒细胞质育性的分子标记方法，其特征在于，该方法按以下步骤进行1)人工设计合成一对特异核苷酸序列作为引物，其中 正向弓丨物5，-CCCACACAAGACACATCACA-3，；反向引物5，-CGTACGAAATTCTTGGGCTTA-3，；2)提取辣椒线粒体DNA，以步骤1)的引物对辣椒线粒体DNA进行PCR扩增，并对扩增 产物以0. 8%的琼脂糖凝胶进行电泳；3)对电泳结果进行分析，若电泳结果中出现特异条带，则表示该泳道中的扩增产物是 不育型细胞质植株；若电泳结果中没有出现特异条带，则表示该泳道中的扩增产物是可育 型细胞质植株。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的条件是(1)15μ L PCR 反应体系10 倍 PCR buffer 1.5 μ L、25 mmol ‘ Γ1 MgCl2 1.2 μ L、 5U ‘ μ L-1Ta^ DNA 聚合酶 0· 12 μ L、5mmol dNTPs 0.3 μ L、20 μ mol 正向弓|物 1· 0 μ L、20 μ mol · Γ1 反向引物 1.0 μ L、40 ng · μ L-1IIitDNA 0. 5 μ L 以及 ddH20 9. 38 μ L ；(2)PCR扩增反应在PCR仪上进行，反应条件是94°C预变性5min ；94 °C变性lmin， 58°C退火lmin，72°C延伸lmin，进行30个循环；最后72 °C延伸10 min ；于4°C保存备用。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述辣椒线粒体DNA采用高盐-蛋白酶K法 提取。
全文摘要
本发明公开了一种苗期鉴别辣椒细胞质育性的分子标记方法，该方法首先人工设计合成一对特异核苷酸序列作为引物，以引物对辣椒线粒体DNA进行PCR扩增，并对扩增产物以0.8%的琼脂糖凝胶进行电泳，若电泳结果中出现特异条带，则表示该泳道中的扩增产物是不育型细胞质植株；若电泳结果中没有出现特异条带，则表示该泳道中的扩增产物是可育型细胞质植株。其步骤简单快捷、稳定可靠，鉴别结果与田间花器官育性鉴定结果准确一致、重复性好，特别适用于辣椒CMS雄性不育分子标记辅助育种，能够很好地提高选择效率，加速育种进程。
文档编号C12Q1/68GK102140517SQ201110007410
公开日2011年8月3日 申请日期2011年1月14日 优先权日2011年1月14日
发明者吉姣姣, 巩振辉, 逯明辉, 陈儒钢, 黄炜 申请人:西北农林科技大学