专利名称：沙冬青抗寒基因AmGS的制作方法
技术领域：
本发明涉及ー种我国西北荒漠地区的源于远古第三纪的国家ニ级濒危保护植物， 也是至今在亚洲中部荒漠地带唯一保留下来的常绿阔叶木本植物沙冬青的抗寒基因AmGS 的分子克隆和遗传转化。通过低温诱导和差异表达分析，获得了低温诱导上调表达的沙冬青抗冻基因的EST片段，然后通过RACE扩增获得了沙冬青抗寒基因AmGS的全长cDNA序列， 在基因库中进行了注册，注册为DQ519359。AmGS含有完整的ORF区域，ORF全长987个核苷酸，编码3 个氨基酸和一个终止密码子(TAA)。随后构建了沙冬青抗寒基因AmGS的真核表达载体pCAMBIA2300-AmGS，用于转化拟南芥和林木，获得的转基因植株抗寒性有所提高。AmGS是国际上克隆并完成转化木本植物的第一个木本植物抗寒基因，我们拥有完全独立自主的知识产权。它的克隆和成功转化对于木本植物抗寒基因研究和遗传育种具有重要
眉、O
ニ背景技术：
低温是限制植物的生长，发育和分布的重要因素，2007-2008年在我国南方大面积发生的那场冻害，我们还记忆犹新，其中对木本植物造成的危害最重，而且其影响将持续在其后十几年。木本植物抗寒基因的研究落后于草本植物，更落后于原核生物及鱼类和昆虫。 但从另ー个角度来看，由于木本植物具有相同的多年生的特性，具有木质化构造，冬季能够发展出较强的抗寒性，所以从木本植物中应该更容易分离到有较强抗寒效果的基因。把这样的基因转化到需要的木本植物中可能会比转化来自于其它生物的抗寒基因更为有效。所以从木本植物中克隆抗寒基因并研究它们的表达和功能，具有重要的理论意义和应用价值。植物抗寒基因工程与其它抗性基因工程相比起步晚，发展慢，直到八十年代末，才报道了抗寒基因工程方面的研究成果。至今，植物抗寒基因工程主要通过以下五个途径进行①鱼类及昆虫抗冻基因途径；②脂肪酸去饱和代谢关键酶基因途径；③超氧物岐化酶 (SOD)基因途径；④糖类基因途径；⑤本草植物抗冻基因途径。其中用的最早的是鱼类抗冻基因途径，鱼类抗冻蛋白(AFP)吸附于冻晶上，使极地鱼类有抗冰晶化作用，保护极地鱼。 1989年，Cutler用极地鱼黄盖鲽抗冻蛋白处理植物组织，明显改善了马铃薯、草菁和拟南芥属叶子的抗寒性能。George把人工合成的黄盖鲽AFP基因，通过电激法成功导入玉米原生质体，得到表达。Mllis以农杆菌介导，把合成的PHA-AFP (PHF 植物凝集素)融合基因转入到马铃薯中，马铃薯的抗冻与耐冻能力提高了。近年来植物抗冻基因的研究有了较好的进展，美国和中国的科学家分别克隆了拟南芥的抗冻基因并导入番茄，得到良好的表达， 获得了抗寒性提高的转基因植株。美国DNA植物技术公司把抗冻基因导入到蕃茄中，培育出耐寒蕃茄，并且认为抗冻蛋白有可能应用于所有蔬菜品种的改良。但木本植物抗寒基因的克隆和转化方面迄今尚未见成功报道。本研究结果正是希望在这个领域打开突破口而开展起来的。
发明内容
本研究用我国西北荒漠地区一种常绿阔叶的豆科灌木沙冬青为材料，进行了木本植物冷诱导基因的克隆和功能分析研究。通过低温诱导处理和差异表达分析，获得了低温诱导上调表达的沙冬青抗冻基因的EST序列十三个(包括八个全长基因和五个cDNAs的部分序列)。其中的ー个(基因库注册号DQ519359)包含沙冬青抗寒基因AmGS (coding sequence of gaiactinol synthase in Ammopiptanthus mongolicus)的全长 cDNA 序夕IJ, 其ORF区域长987个核苷酸，编码3 个氨基酸和一个终止密码子(TAA)(图1)。随后克隆了相应的核DNA序列，结构分析表明，AmGS基因核DNA序列含有3个外显子和2个内含子。我们用双元克隆载体pCAMBIA2300 (购自公司澳大利亚Cambia公司，其结构见附图2)，构建了 AmGS基因的植物表达载体。在构建目的基因AmGS的表达载体时，将分子克隆得到的AmGS基因片段在)(ba I和Ml I双酶切位点插入到载体pCAMBIA2300中，建成的表达载体被命名为pCAMBIA2300-AmGS (图幻。所用的标记基因是广泛应用的新霉素磷酸转移酶基因(NPTII)，它编码的产物对氨基葡糖苷类抗生素如卡那霉素等具有抗性。在构建本表达载体时考虑到融合基因太大会影响表达，因此没包含报告基因GUS.该基因转化到植物体内后可以抑制冰晶生长及新冰晶的形成，从而保护细胞免受损伤，提高植物的耐寒性。由于AmGS基因来源于木本植物，转化后在木本植物宿主体内更容易表达，转化的植物对环境没有任何影响。
具体实施例方式(一 )以木本植物的离体再生体系作为转化材料，利用农杆菌浸染、花粉管通道、 基因枪等方法进行遗传转化。( ニ )转化操作步骤1.农杆菌转化法(1)通过三亲株杂交法将pCAMBIA2300-AmGS表达载体转化到根癌农杆菌LBA4404 中，用于农杆菌浸染转化实验。(2)菌液制备1)用接种环刮拭含有重组质粒的农杆菌菌株冻结的培养物表面，划线于含有相应抗生素的上述YEP平板上，置于观で恒温培养箱培养2天，待平板上有菌落长出来的时候， 即可用于液体培养。长出菌落的平板置于4°C冰箱保存。一个月后转接到新的YEP平板上， 以保持菌的活性。2)从平板上挑取单菌落，接种于含IOml附加相应抗生素的YEP液体培养基 (pH7. 0)中，在恒温摇床上，于观で，180-200rpm振荡培养过夜。3)次日早晨，当菌液OD6tltl = 0.5-0. 6吋，可用于转化。(经验上一般为头天下午5 点左右进行振荡培养，次日早晨8点左右菌液浓度可达到标准)备注培养基中加入抗生素的时候，一定要等到培养基冷却但未凝固时(即人手所能忍耐的温度)加入，否则抗生素在高温下会失效。(3)农杆菌转化1)预培养将无菌离体再生组织横向切割2-3个切ロ，后接种在分化培养基上进行预培养1-2天。
2)共培养用无菌水将农杆菌菌液稀释5-20倍，将经过预培养的离体再生组织浸泡在稀释液中10-20分钟，取出茎段，用无菌滤纸吸干后，转入分化培养基上暗培养2-4天， 对照处理是将剪伤的离体再生组织在无菌水中浸10-20分钟，其它处理与实验材料一祥。3)选择培养离体再生组织与农杆菌共培养后，即可看到离体再生组织边缘有乳白色的农杆菌菌落出现，用无菌水冲洗茎段，然后用无菌滤纸吸干。将离体再生组织转移到加有选择压的脱菌分化培养基上，在光照4000-100001x，25°C条件下进行选择培养。4)继代选择培养选择培养3-4周后，离体再生组织的转化细胞将分化出抗性不定芽，将这些抗性材料转入相应的加大选择压的脱菌选择培养基中进行培养。5)生根培养待不定芽长到2厘米以上吋，切下并插入含有选择压的脱菌生根培养基上进行生根培养，两周左右长出不定根，获得转化植株。2、花粉管通道、基因枪等转化法(1)从含有pCAMBIA2300-AmGS的根癌农杆菌LBA4404菌液中，提取基因质粒DNA， 配制不同浓度，在植物开花初期利用利用花粉管通道法将目的基因导入受体植株中，获得转基因植株。(2)从含有pCAMBIA2300-AmGS的根癌农杆菌LBA4404菌液中，提取质粒DNA，利用基因枪法将目的基因导入受体植株中，获得转基因植株。(三)PCR分子检测1、植物总DNA的提取(采用CTAB法)(1)称取2克左右植物试管苗新鮮叶片，置研钵中，加入1/10植物材料体积的 PVPP,倒入液氮将植物材料研磨成细末。(2)将此粉末放入大离心管中，加入65°C预热过的与植物材料等体积的2XCTAB 提取液，再加入1 %的β -巯基乙醇，反复颠倒混勻，65°C保温15-20min.(3)取出，冷却到室温，加入等体积的氯仿，轻轻的反复颠倒约lOmin，室温 12000rpm离心15分钟。(4)将上清液置于另ー离心管中，重复上ー步骤1-2次。(5)加入2倍体积无水乙醇，充分混勻，用玻璃钩挠出絮状沉淀，置于预先放满 70%乙醇的Eppendorf管中，洗涤DNA，12000rpm离心，倒掉乙醇。(6)加入2倍体积70 %乙醇，洗涤DNA 2次。(7)吹干，溶于适量TE(ρΗ8· 0)缓冲液中。(8)加入RNase溶液，使终浓度达到10mg/ml，35°C处理20min。然后用酚氯仿 异戊醇04 24 1)，抽提一次，上请液再用氯仿异戊醇04 1)，抽提一次。用两倍体积无水乙醇沉淀出DNA。再用75%乙醇洗两次，吹干，DNA溶于无菌水中放于-20°C备用。2、聚合酶链式反应(PCR)检测(1)反应体系以质粒DNA作为阳性对照，以未经转化的组培苗作为阴性对照，对转化再生苗进行PCR扩增检測。根据AmGS基因序列设计ー对特异性引物。正向引物A12-V-1:5' -TCATGGCACCTGATATCACCACCGCT-3 ‘反向引物A12-V-2:5' -TATTAGGCAGCGGATGGGGCGGGAA-3‘
扩增产物为Ikp正向引物设计在5'端载体序列上，反向引物设计在目的基因的3'端，用这对特异性引物扩增出的PCR产物为1Kb，包含是目的基因的全序列，这样可以保证PCR扩增产物只能来自导入的AmGS基因序列，而不可能来自内源基因序列，提高了检测的特异性和准确性。Southern杂交所用的探针是PCR扩增出的片段，经32P_dCTP标记后用作Southern杂交的探针，PCR和Southern杂交检测双重阳性的则被认为是转基因植株。1)反应液
(MH2O17μ 1
IOX PCR Buffer2. 5μ 1
dNTP2μ 1
正向引物1 μ 1
反向引物1 μ 1
模板DNA1 μ 1
iTaq 酶0. 5μ 1
总体积25 μ 1
2)反应程序
预变性:94°C,5min
在以下条件下扩增35个循环变性，94°C 60sec ；复性，55°C 40sec ；延伸，72°C，
Imin ；最后延伸72°C，5min 4°C，保存备用。五
附图1. AmGS基因的编码序列及推导的氨基酸序列附图2克隆目的基因所用的双元载体PCAMBIA2300的结构示图附图3AmGS基因构建图
权利要求
1.本发明从我国西北荒漠地区的源于远古第三纪的国家ニ级濒危保护植物，也是至今在亚洲中部荒漠地带唯一保留下来的常绿阔叶木本植物沙冬青中克隆了其抗寒基因AmGS。 AmGS含有完整的ORF区域，ORF全长987个核苷酸，编码3 个氨基酸和一个终止密码子 (TAA)。随后构建了沙冬青抗寒基因AmGS的真核表达载体，用于转化林木，获得的转基因林木植株抗寒性有所提高。AmGS来源于木本植物，因此转化木本植物更容易表达，转基因植株对环境没有不良影响。它的克隆和对林木遗传转化的成功对木本植物抗寒研究和遗传育种具有重要意义。
2.克隆的沙冬青抗寒基因AmGS的编码序列全长987个核苷酸，它编码3 个氨基酸和一个终止密码子(TAA)。用pCAMBIA2300为载体构建了 AmGS的的表达载体 pCAMBIA2300-AmGS，在建成的表达载体中CaMV35S启动子、目的基因、终止子OCS和标记基因NPTII整合在一起构建成嵌合基因，有利于转化和表达。
3.所用的标记基因是广泛应用的来源于细菌的新霉素磷酸转移酶基因(NPTII)，它编码的产物对氨基葡糖苷类抗生素如卡那霉素等具有抗性，本表达载体不含报告基因GUS.
4.根据AmGS基因序列设计ー对特异性引物。正向引物A12-V-1 5' -TCATGGCACCTGATATCACCACCGCT-3 ‘反向引物A12-V-2 5' -TATTAGGCAGCGGATGGGGCGGGAA-3‘扩增产物为Ikp正向引物设计在5'端载体序列上，反向引物设计在目的基因的3'端，用这对特异性引物扩增出的PCR产物为1Kb，包含是目的基因的全序列，这样可以保证PCR扩增产物只能来自导入的AmGS基因序列，而不可能来自内源基因序列，提高了检测的特异性和准确性。1)反应液ddH2017μ1IOX PCR Buffer2.5 μdNTP2μ 1正向引物Ιμ 反向引物1 μ 模板DNAΙμ Taq酶0.5 μ总体积25 μ 12)反应程序预变性94°C，5min在以下条件下扩增35个循环变性，94°C 60sec ；复性，55°C 40sec ；延伸，72°C，Imin ； 最后延伸:72°C,5min 4°C，保存备用。
全文摘要
沙冬青抗寒基因AmGS涉及一种我国西北荒漠地区的源于远古第三纪的国家二级濒危保护的常绿阔叶木本植物。该基因的分子克隆，通过低温诱导和差异表达分析获得了低温诱导上调表达的沙冬青抗冻基因的EST片段，然后通过RACE扩增获得了该基因全长cDNA序列。AmGS含有完整的ORF区域，ORF全长987个核苷酸，编码328个氨基酸和一个终止密码子(TAA)；构建了AmGS基因的植物表达载体pCAMBIA2300-AmGS，用pCAMBIA2300-AmGS转化红叶石楠，杏树等木本植物都获得了抗寒性有所提高的转基因植株。
文档编号C12N15/82GK102586269SQ201110008899
公开日2012年7月18日 申请日期2011年1月6日 优先权日2011年1月6日
发明者冯殿齐, 刘静, 宋键, 曹鹏秀, 王斌, 罗磊, 翁曼丽 申请人:泰安市泰山林业科学研究院, 王斌