专利名称：耻垢分枝杆菌il-17a及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)菌株及其制备方法， 尤其涉及一种表达IL-17A的重组耻垢分枝杆菌及其制备方法。
背景技术：
免疫佐剂又称非特异性免疫增生剂，是ー种与抗原同时或预先注射于机体、能够增强机体免疫应答或改变免疫应答类型的辅助物资，其可以增加抗原表面积，使抗原易于被巨噬细胞吞噬、改变抗原物理性状，延长抗原作用时间、增强辅助T細胞的作用、刺激致敏淋巴細胞的分裂和浆细胞的产生、提高机体初次和再次免疫应答抗体的滴变、以及改变抗体产生类型和迟发型变态反应，并使其增强；因此，免疫佐剂在疾病的预防方面有着及其重要的作用。铝盐佐剂是第一个被批准用于人的佐剂，主要功能为缓释作用，同时也具备对免疫细胞的激活作用，但是铝盐佐剂与某些抗原混合注射后会引起局部炎症反应，甚至形成肉芽肿。弗氏佐剂是ー种含有分枝杆菌成分的佐剂，具有较强的免疫增强效应，是应用最广泛的试验用佐剂，由于弗氏佐剂注射部位強烈的副反应，因此该佐剂目前只用于实验目的的免疫研究。細胞因子作为新型免疫佐剂已经在临床应用，IL-2、IFN-γ等重组卡介苗已成功应用于浅表性膀胱癌的治疗研究，如中国专利CN100360668C公开的ー种分泌肿瘤坏死因子-α重组卡介苗，以及中国专利CN1710072A公开的分泌人白介素_2重组卡介苗，均能够有效预防和治疗浅表性膀胱肿瘤；中国专利CN100374M8C公开还公开了ー种重组干扰素卡介苗菌株，在増加免疫效果的同时，还可以减少BCG用量，降低毒副作用。但是，BCG生长缓慢的特性为转基因过程带来诸多不便。耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)是具有与BCG相似抗原的分枝杆菌， 也是常用的細胞免疫佐剂，同BCG相比，耻垢分枝杆菌具有生长快、非致病性的特点，其应用范围更为广泛。目前已有多种细胞因子在耻垢分枝杆菌中得到表达，如表达TNF-α的重组耻垢分枝杆菌应用于膀胱癌，并获得较好的增强免疫应答效果(Int. J. Cancer, 2004, 112(4) :653-660)；如专利CN1339583A公开的重组耻垢分枝杆菌，含有人结核杆菌热休克蛋白70启动子cDNA，也可用来治疗膀胱肿瘤；专利CN101875913A公开了ー种结核分枝杆菌Ag85B和ESAT-6融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌(CCTCC N0:M2010097)可用于预防和治疗结核病；又如表达IL-2和GLS的重组耻垢分枝杆菌可以增强小鼠抗肺結核菌感染的免疫应答(Vaccine, 2007, 25 (4) :638-648)。但是表达 IL-17A (白介素-17A，hterleukin 17A) 的重组耻垢分枝杆菌尚未见有报道。
发明内容
本发明提供了一种表达IL-17A(SEQUENCE No. 4)的重组耻垢分枝杆菌 (Mycobacterium smegmatis) IL-17A，通过穿梭表达载体构建了一种表达IL-17A的重组耻垢分枝杆菌，并制备该重组耻垢分枝杆菌疫苗，使重组疫苗刺激固有免疫和获得性免疫应答能力得到加强，提高免疫保护效カ。本发明耻垢分枝杆菌IL-17A已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC NO. 4446，保藏日期2010年12月10日，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号；其中，表达IL-17A基因的大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体在所述耻垢分枝杆菌 IL-17A中表达。本发明所述耻垢分枝杆菌制备方法如下
步骤1，依据IL-17A基因序列设计扩增引物，经PCR扩增得到IL-17A基因表达片段，然后将所述IL-17A基因表达片段克隆至载体，获得重组载体；
步骤2，电转化所述重组载体至耻垢分枝杆菌，得到所述耻垢分枝杆菌IL-17A。优选地，在所设计的上游引物在IL-17A基因上游引入I酶切位点；使所设计的下游引物在IL-17A基因下游引入Z/i/7d III酶切位点。其中，所述扩增引物由5’端至3’端寡核苷酸序列优选为 上游引物CAGGGATCCGCGGCTACAGTGAAGGC(SEQUENCE No. 1)；
下游引物:AGTAAGCTTTTAGGCTGCCTGGCGGACAAT (SEQUENCE No. 2)。其中，所述上游引物中GGATCC(下划线部分)为BamW I酶切位点；所述下游引物中AAGCTT (下划线部分)为Η η III酶切位点。其中，所述载体优选为大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体(SEQUENCE No. 3)。本发明还提供了所述耻垢分枝杆菌IL-17A在制备增强非特异性抗感染免疫的药物、疫苗或免疫佐剂中的应用。本发明还提供了所述耻垢分枝杆菌IL-17A在制备获得性免疫的药物、疫苗或免疫佐剂中的应用。其中，优选为在制备预防和控制因过敏性哮喘或呼吸道感染导致的哮喘气道损伤药物中的应用，尤其是在制备治疗和预防儿童过敏性哮喘药物中的应用。并进一歩优选为在制备预防和控制因肺炎支原体(mycoplasma pneumoniae, MP)感染导致的炎症损伤的药物中的应用。综上所述，本发明提供了一种表达IL-17A的重组的耻垢分枝杆菌IL-17A及其制备方法，并提供了所述耻垢分枝杆菌IL-17A在制备药物中的应用。IL-17A是ー种调节固有免疫和获得性免疫的重要因子，通过促进趋化因子、炎症細胞因子表达等多种途径參与病原体感染的防御和清除过程；且在唤醒免疫接种后T细胞记忆效应方面具有重要的意义。因此构建表达IL-17A的分枝杆菌疫苗有助于增强疫苗接种激发的非特异性抗感染能力，有助于预防微生物感染导致的哮喘急性加剧；而且外源性IL-17A在低剂量时主要表现为抑制嗜酸性細胞募集和抑制Th2反应，动物实验显示外源性IL-17A剂量低于2. 5μ g/kg时几乎不加重哮喘小鼠中性粒細胞募集；而IL-17A抑制 TNF- α诱导RANTES表达的能力是其激活TNF- α诱导IL_6、IL_8分泌的6倍，因此低剂量表达IL-17A的分枝杆菌疫苗在预防哮喘中具有明显的优势。耻垢分枝杆菌与结核分枝杆菌(Mycobacterium Tuberculosis)具有高度同源性， 可作为抗结核药物的替代菌种，并且耻垢分枝杆菌为快生菌和非致病性菌，有着更好的应用前景。
本发明所述耻垢分枝杆菌IL-17A具有耻垢分枝杆菌和IL-17A的双重作用，使得重组后的分枝杆菌促进非特异性抗感染免疫和抑制过敏原介导的气道免疫炎症损伤的作用得到显著的增强，尤其在预防和控制过敏性哮喘或呼吸道感染导致的哮喘气道损伤中能够起到重要的作用。
图1为耻垢分枝杆菌与本发明耻垢分枝杆菌IL-17A生长曲线图； 图2为WB鉴定IL-17A在本发明耻垢分枝杆菌IL-17A中的表达结果图3为pMFA41-mIL-17a重组质粒在Λ smegmatis表达的PCR鉴定及酶切鉴定结果。
具体实施例方式本发明提供了一种表达重组白介素-17A的耻垢分枝杆菌菌株IL-17A，与已有耻垢分枝杆菌区别在于表达IL-17A基因的大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体在耻垢分枝杆菌中表达。其制备方法如下
步骤1，依据已知IL-17A基因序列设计扩增引物，并在上下游引物中分别引入I 酶切位点和がifld III酶切位点；经PCR反应得到IL-17A基因表达片段；将所述IL-17A基因表达片段克隆至载体(如大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体，PMFA41载体)，获得重组载体；其中，IL-17A基因序列的获取和提纯可根据现有技术进行操作，操作条件在下面内容中介绍，在此不再赘述。步骤2，耻垢分枝杆菌培养和制备感受态細胞，电转化所述重组载体至耻垢分枝杆菌，得到所述耻垢分枝杆菌IL-17A。本发明所述耻垢分枝杆菌IL-17A已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心， 保藏号为 CGMCC NO. 4446。下面以小鼠白介素17-A、大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体PMFA41、和耻垢分枝杆菌I smegmatis mc2155菌株为例，通过具体的实施例对本发明耻垢分枝杆菌IL-17A及其制备方法进行具体介绍，以更好的理解本发明，但下述实施例并不限制本发明范围。实验材料小鼠，I5we^maii1S mc2155 (美国科罗拉多州立大学微生物系分枝杆菌研究室)，pMD 18_T载体(TaKaRa公司)，pET28a载体(Novagen公司)，大肠杆菌^: coli、 T0P10 (市场购得)，PMFA41载体(自制)。步骤1，依据IL-17 A基因序列设计扩增引物，经PCR反应得到IL_17 A基因表达片段；并将所述IL-17 A基因表达片段克隆至载体，获得重组载体；
1. 1.小鼠脾细胞的制备与培养
6周龄雌性BALB/c小鼠的脾脏放入培养基中，并在200目不锈钢细胞筛中轻轻研压，制备细胞悬液。取细胞悬液移入离心管中，1640培养基洗涤、lOOOr/min离心三次；弃上清，加入红细胞裂解液进行裂解，然后加入1640培养基轻轻振荡混勻，低温离心机水平转子离心 IOmin(1000r/min)。弃上清，加入10%胎牛血清及双抗(青霉素100U/ml，链霉素100U/ml)制成细胞悬液，接种于细胞培养板，加入PHA-P刺激细胞活化，培养M小时收获細胞。
1. 2.小鼠IL-17A基因的扩增
Trizol法抽提小鼠脾细胞总RNA，然后制备cDNA。其中cDNA制备方法如下RNA在65°C 下预变性5分钟，立即置于冰上冷却；然后进行逆转录反应，逆转录反应体系如下
权利要求
1.一种耻垢分枝杆菌(Mycobacterium柳叹腳む、)IL-17A，其特征在于，表达IL-17A 基因的大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体在耻垢分枝杆菌IL-17A中表达；该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO. 4446。
2.一种如权利要求1所述的耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumむ)IL-17A的制备方法，其特征在干，步骤如下步骤1，依据IL-17 A基因序列设计扩增引物，经PCR克隆IL-17 A成熟蛋白编码基因片段；将所述IL-17 A基因片段克隆至大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体，获得重组载体；步骤2，电转化所述重组载体至耻垢分枝杆菌，得到所述耻垢分枝杆菌IL-17A。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在干，所述设计引物过程中，使所设计的上游引物在IL-17A基因上游引入I酶切位点；使所设计的下游引物在IL-17A基因下游引入がi/ d III酶切位点。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在干，步骤1中所述扩增引物如下 上游引物5，-CAGGGATCCGCGGCTACAGTGAAGGC-3’ ；下游引物5，-AGTAAGCTTTTAGGCTGCCTGGCGGACAAT-3‘；其中所述上游引物中GGATCC为I酶切位点；所述下游引物中AAGCTT为がi/ d III 酶切位点。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在干，步骤2中所述电转化过程，电转化仪的电击參数为电压2. 5kv,电容25 μ F、电阻1000 Ω。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在干，所述电转化后产物在卡那霉素的LBG 琼脂培养基上筛选和培养。
7.一种如权利要求1所述的耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis) IL-17A在制备增强非特异性抗感染免疫、或制备获得性免疫的药物、疫苗或免疫佐剂中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在干，应用于制备预防和控制因过敏性哮喘的药物、或呼吸道感染导致的哮喘气道损伤药物。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在干，所述哮喘气道损伤为因肺炎支原体感染导致的呼吸道炎症损伤。
10.根据权利要求7所述的应用，其特征在干，所述药物为预防和控制儿童过敏性哮喘的药物。
全文摘要
本发明涉及一种耻垢分枝杆菌IL-17A，其中，表达IL-17A基因的大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体在耻垢分枝杆菌IL-17A中表达；该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.4446。本发明所述耻垢分枝杆菌IL-17A具有耻垢分枝杆菌和IL-17A的双重作用，使得重组后的分枝杆菌促进非特异性抗感染免疫和抑制过敏原介导的气道免疫炎症损伤的作用得到显著的增强，尤其在预防和控制过敏性哮喘或呼吸道感染导致的哮喘气道损伤中能够起到重要的作用。
文档编号C12N15/09GK102586161SQ20111000916
公开日2012年7月18日 申请日期2011年1月17日 优先权日2011年1月17日
发明者吴良霞, 张建华, 范小勇, 郝春莉, 郭盛, 陈凌 申请人:上海市第六人民医院