专利名称：制备经纤维蛋白遗传修饰的腺病毒的载体及其构建方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于快速制备经纤维蛋白遗传修饰的腺病毒载体及其构建方法
背景技术：
腺病毒载体在基因治疗中具有广阔的应用前景，是目前基因治疗中最常用的病毒载体之一。腺病毒主要通过与靶细胞表面的腺病毒受体(CAR)相互作用来感染细胞。但许多肿瘤细胞及某些组织(如神经细胞，淋巴细胞等)缺乏腺病毒受体，因此限制了腺病毒载体(Ac^)的基因治疗效果。通过对腺病毒纤维蛋白的遗传修饰(如Knob蛋白HI loop及C 端的遗传修饰)可以提高腺病毒载体对细胞面缺乏腺病毒受体的感染效率，从而提供基因转移效率，进而增强基因治疗效果。目前制备经纤维蛋白遗传修饰的腺病毒的载体的方法比较多，但缺乏一种简便快速的构建经纤维蛋白遗传修饰的腺病毒的载体的方法。主要存在的问题是制备周期长，体外连接小肽的效率低，筛选阳性克隆的手段条件繁琐。
发明内容
本发明所要解决的一个技术问题在于克服目前制备纤维蛋白遗传修饰的腺病毒载体方法的缺点，提供一种制备经纤维蛋白遗传修饰的腺病毒的载体。本发明所要解决的另一个技术问题在于提供一种的简单、快速的制备经纤维蛋白遗传修饰的腺病毒的载体的构建方法。解决上述技术问题所采用的技术方案是在El区携带报告基因表达元件，将该表达元件插入Ad5腺病毒基因组352bp与33^bp之间，Ad5腺病毒载体基因组中原有的BamHI 已经突变，突变位点位于Ad5腺病毒基因组序列的第21562碱基，由原来的G突变为C，原来的BamHI位点GGATCC变为序列为CGATCC ；在Ad5腺病毒基因组纤维蛋白的HIloop即第 3^579bp处引入两个单一的酶切位点，在Ad5腺病毒纤维蛋白的C末端引入两个单一的酶切位点，在Ad5载体的两个单一酶切位点之间插入一个用于筛选的表达元件。本发明的携带的报告基因是eGFP、Beta-Gal、荧光素酶、红色荧光蛋白中的任意一种。本发明的在腺病毒纤维蛋白的HI loop或C末端的两端分别引入单一的酶切位点是 BamHI 禾口 SfuI 或是 ClaI 禾口 PmeI 或是 SwaI 禾口 XbaI。本发明的在Ad5载体的BamHI和SfuI酶切位点之间插入一个用于筛选的表达元件是用于蓝白斑筛选的Lacza表达元件或在细菌中表达的用于筛选的荧光蛋白表达元件。本发明的在Ad5腺病毒基因组纤维蛋白的HI loop处引入的两个单一的酶切位点为BamHI及Sful，序列为GGATCCTTCGAA，在腺病毒纤维蛋白C末端引入的两个单一的酶切位点为BamHI及SfuI及终止码，序列为GGATCCTTCGAATAA。制备经纤维蛋白遗传修饰的腺病毒的载体的构建方法，由下述步骤组成
1、在El区携带报告基因表达框的腺病毒质粒载体的构建以报告基因为模板，采用dNTP及DNA聚合酶，通过聚合酶链式反应获得报告基因，将该片段克隆到腺病毒El穿梭载体中，获得的阳性质粒载体命名为pAd5CMV-R印orter-SV40pA-shuttle，将kal线性化的载体 pAd5CMV-Reporter-SV40pA-shuttle 与 ClaI 线性化的载体 pTG602/SwaI 共转化 BJ5183,经酶切及测序后获得的腺病毒质粒载体即为在El区携带CMV-R印orter-SV40pA表达框的腺病毒质粒载体，命名为pAd5CMV-R印orter/Swal。2、BamHI位点突变的腺病毒质粒载体pAd5CMV_R印orter_BamHIM/SwaI的构建以Ad5腺病毒基因组DNA为模板，通过PCR方法扩增获得一个片段长度为1. 2kb 的片段，聚合酶链式反应产物经质量分数为1.0%的琼脂糖电泳后回片段，将此片段克隆到 pGEMT-easy vector中，16°C连接过夜，将连接产物转化感受态的DH5 α细胞，并涂布于含有100 μ g/ml的氨苄青霉素的LB平板中；挑取菌落接种到含有100 μ g/ml的氨苄青霉素的 LB培养液中，14 16小时后，经碱性裂解法提取质粒DNA，通过酶切及测序鉴定阳性克隆， 获得携带BamHI位点的基因片段的载体命名为pGEMT-BamHI F ；采用引物Pl:GACATGACTTTTGAGGTCGATCCCATG GACGAG 及P2 CTCGTCCATGGGATCGACCTCAAAAGTCATGTC,通过基因定点突变的方法，获得携带BamHI突变的基因片段的载体，将此载体命 SSpGEMT-BamHI M F ；通过基因突变，原来的BamHI序列突变为CGATCC ；将EcoRI线性化 WpGEMT-BamHI M F.载体与BamHI线性化的并在纤维蛋白区含有一个单一位点SwaI的腺病毒质粒载体pAd5 CMV-Reporter/Swal共转化BJ5183细菌中，通过酶切及测序鉴定获得 BamHI位点突变的腺病毒质粒载体，命名为pAd5CMV_R印orter-BamHIM/Swal。3、用于腺病毒纤维蛋白遗传修饰穿梭载体的制备 以腺病毒基因组DNA为模板，采用dNTP及DNA聚合酶，通过聚合酶链式反应方法扩增一个长度为3. 5kb的基因片段，该基因片段包括纤维蛋白碳端下游1. 5kb的片段及上游2. Okb的片段，在扩增片段的两段各引入一个I^cI位点，聚合酶链式反应产物经质量分数为1.0%的琼脂糖电泳后回片段，将此片段克隆到pGEMT-easy载体中，16°C连接过夜，将连接产物转化感受态的DH5 α细胞，并涂布于含有100 μ g/ml的氨苄青霉素的LB平板中， 挑取菌落接种到含有100 μ g/ml的氨苄青霉素的LB培养液中，14 16小时后，经碱性裂解法提取质粒DNA，通过酶切及测序鉴定获得阳性克隆，命名为pGEMT/fiber shuttle。通过Overlap PCR方法分别在pGEMT/fiber shuttle载体纤维蛋白的HI loop及 C末端引入单一酶切位点，在所获得的载体的两个单一酶切位点之间克隆用于筛选的表达元件，获得的载体即为用于腺病毒纤维蛋白遗传修饰的穿梭载体。4、用于制备经纤维蛋白遗传修饰的腺病毒的载体制备将SwaI线性化的pAd5CMV_R印orter BamHIM/Swal载体分别与PacI线性化的在纤维蛋白的HI loop及C末端两个单一酶切位点之间插入筛选表达元件的穿梭载体共转化 BJ5183，经过酶切及测序筛选后获得的阳性克隆即为用于快速制备腺病毒纤维蛋白遗传修饰的载体，分别命名为pRGFMAd5HI、pRGFMAd5C-ter。本发明通过构建获得一种新的载体系统，然后通过体外一步高效连接及蓝白斑筛选的方法快速制备获得经纤维蛋白遗传修饰的腺病毒的载体。本发明具有制备周期段、体外连接小肽效率高、筛选阳性克隆的手段条件简单等优点。
图1是pRGFMAd5HI载体结构图。图2是pRGFMAd5C_ter载体结构图。图 3 是 pRGFMAd5HI_RGD 载体结构图。图 4 是 pRGFMAd5C-ter_pK7 载体结构图。
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。实施例1本实施例制备经纤维蛋白遗传修饰的腺病毒的载体如下在El区除携带eGFP报告基因，在腺病毒基因组352bp与33^bp之间插入 CMV-eGFP-SV40pA表达元件，该表达元件序列如下AGCCTGCAGGTCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCA TTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGG TAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCG CCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATG GTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGT CAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGG CGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATGGTACCGTTTAAACTCGAGGT CGACGGTATCGATATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGT AAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTG CACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTAC CCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAG GACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCAT CGACTTCAAG
GAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCC GACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCA CTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTG AGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGA CGAGCTGTACAAGTAAACTAGTTCTAGAGCGGCCGCCACCGCGGGGAGATCCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTT GGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCAT TATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCASGGGGAGGTGTGGGAGGTTTTTTA AAGCAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTATGGCTGATTATGATCCCGGCTGCCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAA CCTCTTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGC GTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCGCAGCCATGAGGTCGACTCTAGTCCCCGCGGTGGC。腺病毒载体基因组中原有的BamHI已经突变，突变位点位于腺病毒基因组序列的第21562碱基，由原来的G突变为C，原来的BamHI位点GGATCC变为序列为CGATCC。在Ad5腺病毒基因组第3^79bp处即纤维蛋白HI loop处，引入两个单一的酶切位点BamHI及Sful，序列为GGATCCTTCGAA，在腺病毒纤维蛋白C末端引入单一的酶切位点 BamHI 及 SfuI 及终止码，序列为 GGATCCTTCGAATAA。在载体的BamHI与SfuI酶切位点之间插入一个用于蓝白斑筛选的Lacza表达元件，所插入的表达元件序列如下ATGACCATGATTACGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCTCCGGGTACCGAGCTCGAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAG。上述的制备经纤维蛋白遗传修饰的腺病毒的载体构建方法步骤如下1、在El区携带CMV-eGFP_SV40pA表达框的腺病毒质粒载体的构建以eGFP基因为模板，采用dNTP及DNA聚合酶，通过聚合酶链式反应获得eGFP片段，将该片段克隆到腺病毒El穿梭载体中，获得的阳性质粒载体命名为 pAd5CMV-eGFP-SV40pA-shuttle。将 kal 线性化的载体 pAd5CMV-eGFP-SV40pA_shuttle 与 ClaI线性化的载体pTG602/SwaI共转化BJ5183，经酶切及测序后获得的腺病毒质粒载体即为在El区携带CMV-eGFP-SV40pA表达框的腺病毒质粒载体，命名为pAd5CMV_eGFP/SwaI
2、BamHI位点突变的腺病毒质粒载体pAd5CMV-eGFP_BamHIM/SwaI的构建以Ad5腺病毒基因组DNA为模板，通过PCR方法扩增获得一个片段长度为1. 2kb 的片段(其中BamHI位点位于上下游500bp)。聚合酶链式反应扩增条件是94°C、30秒， 980C、10秒，550C、15秒，72°C >60秒，30个循环。聚合酶链式反应产物经质量分数为1.0% 的琼脂糖电泳后回片段，将此片段克隆到pGEMT-easy vector中。连接条件是2μ 1酶切纯化片段，Ιμ 10ΧΤ4连接酶缓冲液，0. 5μ 1 T载体，0. 5μ1 Τ4连接酶，6μ 1三蒸水，16°C 连接过夜，将连接产物转化感受态的DH5 α细胞，并涂布于含有I00 μ g/ml的氨苄青霉素的 LB平板中。挑取菌落接种到含有100 μ g/ml的氨苄青霉素的LB培养液中，14 16小时后， 经碱性裂解法提取质粒DNA，通过酶切及测序鉴定阳性克隆，获得携带BamHI位点的基因片段的载体命名为PGEMT-BamHI F。采用引物Pl GACATGACTTTTGAGGTCGATCCCATG GACGAG 及 P2 :CTCGTCCATGGGATCGA CCTCAAAAGTCATGTC，通过基因定点突变的方法，获得携带BamHI突变的基因片段的载体，将此载体命名为PGEMT-BamHI M F。通过基因突变，原来的BamHI序列突变为CGATCC。将 EcoRI线性化的pGEMT-BamHI M F.载体与BamHI线性化的并在纤维蛋白区含有一个单一位点SwaI的腺病毒质粒载体pAd5 CMVeGFP/Swal共转化BJ5183细菌中，通过酶切及测序鉴定获得BamHI位点突变的腺病毒质粒载体，命名为Ad5CMVeGFP_BamHIM/SwaI。3、用于腺病毒纤维蛋白遗传修饰穿梭载体的制备以腺病毒基因组DNA为模板，采用dNTP及DNA聚合酶，用PCR方法扩增一个长度为3. 5kb的基因片段，该基因片段包括纤维蛋白碳端下游1. 5kb的片段及上游2. Okb的片段，在扩增片段的两段各引入一个I^cI位点。聚合酶链式反应扩增条件是94°C、30秒， 980C、10秒，550C、15秒，72°C、180秒，32个循环。聚合酶链式反应产物经质量分数为1.0% 的琼脂糖电泳后回片段。将此片段克隆到PGEMT-easy载体中。纯化片段与pGEMT_T easy 载体连接条件是2 μ 1酶切纯化片段，1μ 1 10ΧΤ4连接酶缓冲液，0.5μ 1 T载体，0.5μ1 Τ4连接酶，6 μ 1三蒸水，16°C连接过夜，将连接产物转化感受态的DH5 α细胞，并涂布于含有100 μ g/ml的氨苄青霉素的LB平板中。挑取菌落接种到含有100 μ g/ml的氨苄青霉素的LB培养液中，14 16小时后，经碱性裂解法提取质粒DNA，通过酶切及测序鉴定获得阳性克隆,命名为 pGEMT/fiber shuttle。通过Overlap PCR方法分别在pGEMT/fiber shuttle载体纤维蛋白的HI loop 及C末端引入单一酶切位点BamHI和Sful，所获得的载体分别命名为pGEMT/fiber-HI-BS 和pGEMT/fiber-C-BS.然后在以上载体的BamHI及SfuI酶切位点之间克隆Lacza表达元件。由此所获得的载体即为用于腺病毒纤维蛋白遗传修饰的穿梭载体，分别命名为 pAd5f iber-HI-BS-Lacza 及 pAd5fiber-C-BS-Lacza。4、用于制备经纤维蛋白遗传修饰的腺病毒的载体的制备将SwaI 线性化的 pAd5CMVeGFP_BamHIM/SwaI 载体与 PacI 线性化的 PAd5fiberHI-BS-Lacza共转化BJ5183，经过酶切及测序筛选后获得的阳性克隆即为用于快速制备腺病毒纤维蛋白HI loop遗传修饰的载体，命名为pRGFMAd5HI.将SwaI线性化的 pAd5CMVeGFP-BamHIM/SwaI 载体与 PacI 线性化的 pAd5f iber-C-Lacza 共转化 BJ5183,经过酶切及测序筛选后获得的阳性克隆即为用于快速制备腺病毒纤维蛋白HI loop遗传修饰的载体,命名为pRGFMAd5C-ter.
实施例2本实施例制备经纤维蛋白遗传修饰的腺病毒的载体如下实施例1中在El区除携带eGFP报告基因，在腺病毒基因组352bp与33^bp之间插入CMV-eGFP-SV40pA表达元件中的eGFP报告基因用Beta-Gal替换。元件的其它结构与实施例1相同，构成制备经纤维蛋白遗传修饰的腺病毒的载体。其构建方法与实施例1相同。实施例3本实施例制备经纤维蛋白遗传修饰的腺病毒的载体如下实施例1中在El区除携带eGFP报告基因，在腺病毒基因组352bp与33^bp之间插入CMV-eGFP-SV40pA表达元件中的eGFP报告基因用荧光素酶替换。元件的其它结构与实施例1相同，构成制备经纤维蛋白遗传修饰的腺病毒的载体。其构建方法与实施例1相同。实施例4本实施例制备经纤维蛋白遗传修饰的腺病毒的载体如下实施例1中在El区除携带eGFP报告基因，在腺病毒基因组352bp与33^bp之间插入CMV-eGFP-SV40pA表达元件中的eGFP报告基因用红色荧光蛋白替换。元件的其它结构与实施例1相同，构成制备经纤维蛋白遗传修饰的腺病毒的载体。其构建方法与实施例1相同。实施例5本实施例制备经纤维蛋白遗传修饰的腺病毒的载体如下在以上的实施例1 4中，在Ad5腺病毒基因组第32679bp处即纤维蛋白HI loop 处，引入单一的酶切位点Clal与Riiel，序列为ATCGATGTTTAAAC，引入的单一酶切位点也可以为Swal与)(bal，序列为ATTTAAATTCTAGA。在腺病毒纤维蛋白C末端引入单一的酶切位点Clal与Rnel，序列为ATCGATGTTTAAACTAA，引入的单一酶切位点还可以为Swal与)(bal， 序列为ATTTAAATTCTAGATAA。元件的其它结构与实施例1相同，构成制备经纤维蛋白遗传修饰的腺病毒的载体。其构建方法与实施例1相同。实施例6本实施例制备经纤维蛋白遗传修饰的腺病毒的载体如下在以上的实施例1 5中，在载体的BamHI与SfuI酶切位点之间插入一个在细菌中表达的用于筛选的荧光蛋白表达元件，所插入的表达元件序列如下AT GAGTAAAGGA
GAAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTGAATTAGATGGTGATGTTAATGGG
CACAAATTTTCTGTCAGTGGAGAGGGTGAAGGTGATGCAACATACGGAAAACTTACCCTT
AAATTTATTTGCACTACTGGAAAACTACCTGTTCCATGGCCAACACTTGTCACTACTTTC
TCTTATGGTGTTCAATGCTTTTCCCGTTATCCGGATCATATGAAACGGCATGACTTTTTC
AAGAGTGCCATGCCCGAAGGTTATGTACAGGAACGCACTATATCTTTCAAAGATGACGGG
AACTACAAGACGCGTGCTGAAGTCAAGTTTGAAGGTGATACCCTTGTTAATCGTATCGAG
TTAAAAGGTATTGATTTTAAAGAAGATGGAAACATTCTCGGACACAAACTCGAGTACAAC
9
TATAACTCAC ACAATGTATA CATCACGGCA GACAAACAAA AGAATGGAAT CAAAGCTAACTTCAAAATTC GCCACAACAT TGAAGATGGA TCCGTTCAAC TAGCAGACCA TTATCAACAAAATACTCCAA TTGGCGATGG CCCTGTCCTT TTACCAGACA ACCATTACCT GTCGACACAATCTGCCCTTT CGAAAGATCC CAACGAAAAG CGTGACCACA TGGTCCTTCT TGAGTTTGTAACTGCTGCTG GGATTACACA TGGCATGGAT GAGCTCTACA AATAA元件的其它结构与实施例1相同，构成制备经纤维蛋白遗传修饰的腺病毒的载体。其构建方法与实施例1相同。实施例7纤维蛋白HI loop经RGD小肽遗传修饰的腺病毒载体的构建方法如下1、pRGFMAd5HI-RGD 载体构建将RGD寡核苷酸退火后与经BamHI及SfuI酶切处理后的pRGFMAd5HI连接，RGD 寡核苷酸为市场上销售的商品，由上海生工生物工程技术服务有限公司销售。连接条件是2μ 1酶切纯化片段，1μ 1 10 X Τ4连接酶缓冲液，2 μ 1 pRGFMAd5HI载体，0. 5μ 1 Τ4连接酶，4. 5 μ 1三蒸水，16°C连接过夜，将连接产物转化感受态的DH5 α细胞，并涂布于含有 100μ g/ml的氨苄青霉素的LB平板中。挑取菌落接种到含有100μ g/ml的氨苄青霉素的 LB培养液中，14 16小时后，经碱性裂解法提取质粒DNA，通过蓝白筛选、酶切及测序鉴定获得阳性克隆，命名为pRGFMAd5HI-R⑶。2、纤维蛋白HI loop经RGD遗传修饰的腺病毒载体的制备将以上构建的pRGFMAd5HI-RGD载体经I^acI线性化后转染HEK293细胞，7_10天后获得病毒原液，然后经过扩增后，通过CsCl梯度纯化后获得纤维蛋白HI loop经RGD遗传修饰的腺病毒载体，命名为Ad5HI-R⑶。实施例8纤维蛋白C末端经pK7遗传修饰的腺病毒载体的制备方法如下1、pRGFMAd5C-ter-pK7 载体构建将pK7寡核苷酸退火后与经BamHI及SfuI酶切处理后的pRGFMAd5Cter连接，ρΚ7 寡核苷酸为市场上销售的商品，由上海生工生物工程技术服务有限公司销售。连接条件是 2μ 1酶切纯化片段，1μ 1 10 X Τ4连接酶缓冲液，2 μ 1 pRGFMAd5C-ter载体，0. 5μ 1 Τ4连接酶，4. 5 μ 1三蒸水，16°C连接过夜，将连接产物转化感受态的DH5 α细胞，并涂布于含有 100 μ g/ml的氨苄青霉素的LB平板中。挑取菌落接种到含有100 μ g/ml的氨苄青霉素的 LB培养液中，14 16小时后，经碱性裂解法提取质粒DNA，通过蓝白筛选、酶切及测序鉴定获得阳性克隆，命名为pRGFMAd5C-ter-pK72、纤维蛋白C末端经pK7遗传修饰的腺病毒载体的制备将以上构建的pRGFMAd5HI-RGD载体经I^acI线性化后转染HEK293细胞，7 10天后获得病毒原液，经扩增，通过CsCl梯度纯化，获得纤维蛋白C-ter经pK7遗传修饰的腺病毒载体，命名为Ad5C-ter-RGD。上述实施例7、8中的用于腺病毒经纤维蛋白遗传修饰的小肽还可以是SIKVAV， NGR, YGRKKRRQRRR。
权利要求
1.一种制备经纤维蛋白遗传修饰的腺病毒的载体，其特征在于在El区携带报告基因表达元件，将该表达元件插入Ad5腺病毒基因组352bp与33^bp之间，Ad5腺病毒载体基因组中原有的BamHI已经突变，突变位点位于Ad5腺病毒基因组序列的第21562碱基，由原来的G突变为C，原来的BamHI位点GGATCC变为序列为CGATCC ；在Ad5腺病毒基因组纤维蛋白的HI loop即第3^79bp处引入两个单一的酶切位点，在Ad5腺病毒纤维蛋白的C末端引入两个单一的酶切位点，在Ad5载体的两个单一酶切位点之间插入一个用于筛选的表达元件。
2.按照权利要求1所述的制备经纤维蛋白遗传修饰的腺病毒的载体，其特征在于所说的携带的报告基因是eGFP、Beta-Gal、荧光素酶、红色荧光蛋白中的任意一种。
3.按照权利要求1所述的制备经纤维蛋白遗传修饰的腺病毒的载体，其特征在于所说的在腺病毒纤维蛋白的HI loop或C末端的两端分别引入单一的酶切位点是BamHI和 SfuI 或是 ClaI 和 PmeI 或 SwaI 和 XbaI。
4.按照权利要求1所述的制备经纤维蛋白遗传修饰的腺病毒的载体，其特征在于所说的在Ad5载体的BamHI和SfuI酶切位点之间插入一个用于筛选的表达元件是用于蓝白斑筛选的Lacza表达元件或在细菌中表达的用于筛选的荧光蛋白表达元件。
5.按照权利要求1所述的制备经纤维蛋白遗传修饰的腺病毒的载体，其特征在于所说的在Ad5腺病毒基因组纤维蛋白的HI loop处引入的两个单一的酶切位点为BamHI及 Sful，序列为GGATCCTTCGAA，在腺病毒纤维蛋白C末端引入的两个单一的酶切位点为BamHI 及SfuI及终止码，序列为GGATCCTTCGAATAA。
6.一种权利要求1制备经纤维蛋白遗传修饰的腺病毒的载体的构建方法，其特征在于由下述步骤组成(1)在El区携带报告基因表达框的腺病毒质粒载体的构建以报告基因为模板，采用dNTP及DNA聚合酶，通过聚合酶链式反应获得报告基因，将该片段克隆到腺病毒El穿梭载体中，获得的阳性质粒载体命名为pAd5CMV-R印orter-SV40pA-shuttle，将kal线性化的载体 pAd5CMV-Reporter-SV40pA-shuttle 与 ClaI 线性化的载体 pTG602/SwaI 共转化 BJ5183，经酶切及测序后获得的腺病毒质粒载体即为在El区携带CMV-R印orter-SV40pA表达框的腺病毒质粒载体，命名为pAd5CMV-R印orter/Swal ；(2)BamHI位点突变的腺病毒质粒载体pAd5CMV_R印orter-BamHIM/Swal的构建以Ad5腺病毒基因组DNA为模板，通过PCR方法扩增获得一个片段长度为1. 2kb的片段，聚合酶链式反应产物经质量分数为1.0%的琼脂糖电泳后回片段，将此片段克隆到 pGEMT-easy vector中，16°C连接过夜，将连接产物转化感受态的DH5 α细胞，并涂布于含有100 μ g/ml的氨苄青霉素的LB平板中；挑取菌落接种到含有100 μ g/ml的氨苄青霉素的 LB培养液中，14 16小时后，经碱性裂解法提取质粒DNA，通过酶切及测序鉴定阳性克隆， 获得携带BamHI位点的基因片段的载体命名为pGEMT-BamHI F ；采用引物Pl:GACATGACTTTTGAGGTCGATCCCATG GACGAG 及P2 CTCGTCCATGGGATCGACCTCAAAAGTCATGTC,通过基因定点突变的方法，获得携带BamHI突变的基因片段的载体，将此载体命名为pGEMT-BamHI M F;通过基因突变，原来的BamHI序列突变为CGATCC ；将EcoRI线性化的pGEMT-BamHI MF.载体与BamHI线性化的并在纤维蛋白区含有一个单一位点SwaI的腺病毒质粒载体 pAd5CMV-Reporter/SwaI共转化BJ5183细菌中，通过酶切及测序鉴定获得BamHI位点突变的腺病毒质粒载体，命名为pAd5CMV-R印orter-BamHIM/Swal ；(3)用于腺病毒纤维蛋白遗传修饰穿梭载体的制备以腺病毒基因组DNA为模板，采用dNTP及DNA聚合酶，通过聚合酶链式反应方法扩增一个长度为3. 5kb的基因片段，该基因片段包括纤维蛋白碳端下游1. 5kb的片段及上游 2. Okb的片段，在扩增片段的两段各引入一个I^cI位点，聚合酶链式反应产物经质量分数为1.0%的琼脂糖电泳后回片段，将此片段克隆到pGEMT-easy载体中，16°C连接过夜，将连接产物转化感受态的DH5 α细胞，并涂布于含有100yg/ml的氨苄青霉素的LB平板中，挑取菌落接种到含有100 μ g/ml的氨苄青霉素的LB培养液中，14 16小时后，经碱性裂解法提取质粒DNA，通过酶切及测序鉴定获得阳性克隆，命名为pGEMT/fiber shuttle ；通过Overlap PCR方法分别在pGEMT/fiber shuttle载体纤维蛋白的HI loop及C 末端引入单一酶切位点，在所获得的载体的两个单一酶切位点之间克隆用于筛选的表达元件，获得的载体即为用于腺病毒纤维蛋白遗传修饰的穿梭载体；(4)用于制备经纤维蛋白遗传修饰的腺病毒的载体制备将SwaI线性化的pAd5CMV-R印orter BamHIM/Swal载体分别与PacI线性化的在纤维蛋白的HI loop及C末端两个单一酶切位点之间插入筛选表达元件的穿梭载体共转化 BJ5183，经过酶切及测序筛选后获得的阳性克隆即为用于快速制备腺病毒纤维蛋白遗传修饰的载体，分别命名为pRGFMAd5HI、pRGFMAd5C-ter。
全文摘要
一种制备经纤维蛋白遗传修饰的腺病毒的载体，在E1区携带报告基因表达元件插入Ad5腺病毒基因组352bp与3326bp之间，Ad5腺病毒载体基因组中原有的BamHI已经突变，由原G突变为C、BamHI位点GGATCC变为序列为CGATCC；在Ad5腺病毒基因组纤维蛋白的HI loop引入两个单一的酶切位点，C末端引入两个单一的酶切位点，Ad5载体的两个单一酶切位点间插入用于筛选的表达元件。其构建方法包括在E1区携带CMV-eGFP-SV40 pA表达框的腺病毒质粒载体的构建、BamHI位点突变的腺病毒质粒载体的构建、用于腺病毒纤维蛋白遗传修饰穿梭载体的制备、用于制备经纤维蛋白遗传修饰的腺病毒的载体的制备步骤。
文档编号C12N15/66GK102174575SQ20111000985
公开日2011年9月7日 申请日期2011年1月18日 优先权日2011年1月18日
发明者夏海滨, 王东阳 申请人:陕西师范大学