专利名称：快速检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的特异引物对及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及快速检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的特异引物对及其应用。
背景技术：
黄瓜绿斑驳花叶病毒(CucumberGreen Mosaic Mottle Virus, CGMMV)为烟草花 叶病毒属成员，主要侵染包括葫芦、黄瓜、西瓜、香瓜、甜瓜等在内的葫芦科作物，在生产上 造成严重的危害。该病毒1935年由英国Ainsworth在黄瓜上首次发现，可侵染许多葫芦科 作物，在黄瓜上产生的典型症状为叶片上出现色斑，水泡及变形，植株矮化，受感染的果实 通常没有症状，但有些株系能够导致果实产生严重的色斑和变形，引起的产量损失达15%， 在西瓜上叶片只产生轻微的斑驳和矮化，但在果实中却造成严重的变色或腐烂。有些亚洲 株系叶片上并不表现症状却能引起相当大的产量损失。CGMMV可通过多种方式传播，包括种 子调运、植物间接触、农事操作、汁液、病株残体及含病株残体的土壤、啮齿动物(如兔子、 小白鼠等)的粪便、栽培营养液、河水、灌溉水、被污染的包装容器、用作肥料的牛粪和菟丝子等。黄瓜绿斑驳花叶病毒分布广泛，已报道的地区包括希腊(克里特岛)、罗马尼亚、 中国台湾、巴西、前苏联、伊朗、丹麦、印度、芬兰、德国、英国、沙特阿拉伯、以色列、波兰，乌 克兰等，其中以亚洲的日本、韩国报道较多。CGMMV在我国属于进境检疫性有害生物，自 2004年厦门出入境检验检疫局首次从日本进口的南瓜种子中截获CGMMV以来，我国已发生 多起进口源性CGMMV，2005年在我国的辽宁盖州地区造成西瓜大面积毁灭，引起农业部、质 检总局等相关部门的高度重视，并且在广西、甘肃等地也有CGMMV报道。
发明内容
本发明的目的是提供快速检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的特异引物对及其应用。本发明提供的辅助鉴定黄瓜绿斑驳花叶病毒的特异引物对由序列表的序列1所 示DNA和序列表的序列2所示DNA组成。所述特异引物对可用于制备辅助鉴定黄瓜绿斑驳花叶病毒的试剂盒。本发明还保护一种辅助鉴定黄瓜绿斑驳花叶病毒的试剂盒，包括所述特异引物 对。所述试剂盒还可包括PCR常规试剂(如10XPCR buffer,dNTP mix,Taq DNA polymerase 等)、反转录常规试剂以及电泳常规试剂。所述特异引物对或所述试剂盒可用于辅助鉴定黄瓜绿斑驳花叶病毒。本发明还保护一种辅助鉴定黄瓜绿斑驳花叶病毒的方法，包括如下步骤以待测 病毒的cDNA为模板，用所述特异引物对进行PCR，检测PCR产物；如果得到524bp的PCR产 物，则待测病毒为候选的黄瓜绿斑驳花叶病毒；如果没有得到524bp的PCR产物，则待测病 毒为候选的非黄瓜绿斑驳花叶病毒。所述待测病毒具体可为黄瓜绿斑驳花叶病毒、烟草花叶病毒或齿兰环斑病毒。所 述 PCR 的反应体系具体可由 18. 2μ L ddH20,2. 5μ L 10XPCR buffer、1. 0 μ L IOmmol/LdNTP mix.O. 5μ L 10mmol/L序列表的序列1所示DNA (上游引物)、0. 5 μ L 10mmol/L序列 表的序列 2 所示 DNA (下游引物)、2μ L 模板(cDNA)禾口 0. 3 μ L 5U/μ L Taq DNApolymerase 组成。所述PCR的反应条件具体可为94°C 5min ；94°C 30s, 53°C 30s, 72°C lmin，;34个循环； 72°C IOmin0 IOXPCR buffer具体可为购自北京六合通货号为DRR100A的缓冲液。本发明还保护一种检测待测样本中是否含有黄瓜绿斑驳花叶病毒的方法，包括如 下步骤以待测样本的CDNA为模板，用所述特异引物对进行PCR，检测PCR产物；如果得到 524bp的PCR产物，则待测样本中含有黄瓜绿斑驳花叶病毒；如果没有得到524bp的PCR产 物，则待测样本中不含有黄瓜绿斑驳花叶病毒。所述待测样本可为植物样本。所述植物具体可为可被黄瓜绿斑驳花叶病毒感 染的植物(如葫芦)。所述PCR的反应体系具体可由18. 2μ L ddH20、2. 5yL 10XPCR bufferU. 0μ L 10mmol/L dNTP mix.O. 5μ L lOmmol/L 序列表的序列 1 所示 DNA (上游引 物)、0· 5 μ L 10mmol/L序列表的序列2所示DNA(下游引物)、2 μ L模板(cDNA)禾Π 0. 3 μ L 5U/ μ LTaq DNA polymerase 组成。所述 PCR 的反应条件具体可为94°C 5min -MV 30s, 53°C 30s, 72°C lmin，;34 个循环；72°C IOmin0 10XPCR buffer 具体可为购自北京六合通， 货号为DRR100A的缓冲液。本发明提供的试剂盒，具有较高的灵敏度，可快速有效的进行检疫性病毒CGMMV 的田间检测，特别适合CGMMV 口岸检测和田间疫情的调查。采用本发明的特异引物对或试剂盒检测CGMMV，操作简单、快速、结果可靠、特异性 强、灵敏度高，非常适合应用在口岸现场检测。本发明的特异引物对或试剂盒可用于CGMMV 口岸检测和田间疫情调查，特别适合农业部门的各检疫检查站、各口岸检验检疫局、植物病 毒研究机构等应用。
图1为特异性检测结果；M为Marker，1-9为CGMMV，10为阴性对照(以10XPCR buffer为模板)，11为烟草花叶病毒，12为齿兰环斑病毒。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。PCR仪为Eppendorf PCR扩增仪。ReversejTranscription和 dNTPs 购于 Promega 公司。ExTaq 酶和 DNA Marker DL2000 购自 TaKaRa。10XPCR buffer 购自北京六合通，货号为DRR100A。黄瓜绿斑驳花叶病毒(CucumberGreen Mosaic Mottle Virus, CGMMV) :RNA 病毒；参考文献A Strain of Cucumber Green Mottle Mosaic Virus (CGMMV) from Bottlegourd(葫声)in Saudi Arabia, Ibrahim M. Al-Shahwan, Omer A. Abdalla, Article first published online 1 MAY 2008,Journal of Phytopathology,Volumel34,Issue 2, pages 152-156, February 1992.烟草花叶病毒(tobaccomosaic virus,TMV) :RNA病毒；参考文献Chemical and enzymatic probing of spatial structure of the omega leader of tobacco mosaicvirus RNA. Biochemistry (Mosc). 20IOApr ；75 (4) :405-11. Shirokikh NE, Agalarov SCh, Spirin AS.齿兰环斑病毒(OdontoglossumRingspot Virus，ORSV) :RNA 病毒；参考文献 The use of DIG-Iabelled cRNA probes for the detection of cymbidium mosaic potexvirus(CymMV) and odontoglossum ringspot tobamovirus(ORSV) in orchids.J Virol Methods. 1998 Feb ；70 (2) :193-9. Hu WW, Wong SM.实施例1、特异引物对的设计设计用于辅助鉴定黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)的特异引物对如下上游引物:5，-gaagagtccagttctgtttc-3，(序列表的序列1)；下游引物5，-accctcgaaactaagctttc-3，(序列表的序列2)。该上游引物和下游引物的靶序列如序列表的序列3所示。实施例2、特异引物对在辅助鉴定CGMMV中的应用及其特异性用实施例1设计的特异引物对(序列表的序列1所示上游引物和序列表的序列2 所示下游引物)分别鉴定各种病毒(CGMMV，TMV和0RSV)，具体步骤如下1、提取病毒的总RNA，反转录为cDNA。反转录体系(30 μ L)中，含有 0. 5μ L M-MLV Reverse Transcriptase (200U/ μ L)、 1 μ L RNA 禾口 0· 5 μ L 下游引物(10mmol/L)。2、以步骤1得到的cDNA为模板，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。PCR 扩增体系(25 μ L) :18. 2μ L ddH20, 2. 5 μ L 10XPCR buffer, l.OyL dNTP mix(10mmol/L)，0· 5 μ L 上游引物(10mmol/L), 0. 5 μ L 下游引物(10mmol/L)，2 μ L 模板， 0. 3μ L Taq DNA polymerase (5U/ μ L)。PCR 扩增条件94°C 5min ；94°C 30s，53°C 30s, 72°C lmin，34 个循环；72°C IOmin0将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果见图1。结果表明，只有CGMMV得 到PCR扩增产物(5Mbp)，其它3种病毒都没有得到PCR扩增产物。将PCR扩增产物进行测 序，测序结果表明，只有CGMMV得到524bp的PCR扩增产物，其它3种病毒都没有得到PCR 扩增产物。实施例3、特异引物对在辅助鉴定CGMMV中的灵敏度黄瓜绿斑驳花叶病毒可以使植株矮化、结果延时，果实大部分黄化或变白并产生 墨绿色水疱状的坏死斑，损失产量甚至导致不孕而绝产。黄瓜绿斑驳花叶病毒在葫芦叶片 的感病表征为新叶出现黄色小斑点，然后出现花叶并带有浓绿色突起，叶片上引起色斑、 水泡及变形，叶脉间褪色呈绿带状。用黄瓜绿斑驳花叶病毒接种葫芦叶片，取出现感病表征 的新鲜叶片作为待测样本进行检测。取未接种黄瓜绿斑驳花叶病毒且无感病表征的新鲜葫 芦叶片作为对照样本。1、提取待测样本(或对照样本)的总RNA，得到RNA溶液。2、将RNA溶液进行梯度稀释，得到各种稀释液，具体如下将RNA溶液用水稀释至20倍体积(稀释液A ； 1 20)；将RNA溶液用水稀释至40倍体积(稀释液B ； 1 40)；将RNA溶液用水稀释至80倍体积(稀释液C ； 1 80)；将RNA溶液用水稀释至160倍体积(稀释液D ;1 160)；
将 RNA %§液用水稀释至320倍体积(稀释液E ;1 320)；
将 RNA %§液用水稀释至640倍体积(稀释液F ； 1 640)；
将 RNA %§液用水稀释至1280倍体积(稀释液G ；11280)；
将 RNA %§液用水稀释至2560倍体积(稀释液H ;12560)；
将 RNA %§液用水稀释至5120倍体积(稀释液I ； 15120)。
3、将各个稀释液分别进行反转录，得到cDNA。
反转录体系中，含有 0. 5μ L M-MLV Reverse Transcriptase (200U/ μ L) >0. 3 μ L
稀释液和0. 5 μ L下游引物(10mmol/L)。4、分别以步骤3得到的18种cDNA为模板，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。PCR 扩增体系(25μ L) :18· 2μ L dd H2O, 2. 5 μ LlO X buffer, l.OyL dNTP mix(10mmol/L)，0· 5 μ L 上游引物(10mmol/L), 0. 5 μ L 下游引物(10mmol/L)，2 μ L 模板， 0. 3μ L Taq DNA polymerase (5U/ μ L)。PCR 扩增条件94°C 5min ；94°C 30s, 53°C 30s, 72°C lmin, 34 个循环；72°C IOmin0将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。结果表明，待测样本各个稀释液的泳道 均显示目的条带，即将RNA溶液用水稀释至5120倍体积还能够检测到病毒的存在。对照样 本各个稀释液的泳道均未显示目的条带。
权利要求
1.辅助鉴定黄瓜绿斑驳花叶病毒的特异引物对；所述特异引物对由序列表的序列1所 示DNA和序列表的序列2所示DNA组成。
2.权利要求1所述特异引物对在制备辅助鉴定黄瓜绿斑驳花叶病毒的试剂盒中的应用。
3.一种辅助鉴定黄瓜绿斑驳花叶病毒的试剂盒，包括权利要求1所述特异引物对。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括10XPCRbuffer,dNTP mix 禾口 Taq DNA polymerase。
5.权利要求1所述特异引物对，或权利要求3或4所述试剂盒在辅助鉴定黄瓜绿斑驳 花叶病毒中的应用。
6.一种辅助鉴定黄瓜绿斑驳花叶病毒的方法，包括如下步骤以待测病毒的cDNA为模 板，用特异引物对进行PCR，检测PCR产物；如果得到524bp的PCR产物，则待测病毒为候选 的黄瓜绿斑驳花叶病毒；如果没有得到524bp的PCR产物，则待测病毒为候选的非黄瓜绿斑 驳花叶病毒；所述特异引物对由序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于所述待测病毒为黄瓜绿斑驳花叶病毒、烟草 花叶病毒或齿兰环斑病毒。
8.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于所述PCR的反应体系由18.2yLddH20、 2. 5μ L 10XPCR bufferU. 0μ L 10mmol/L dNTP mix.O. 5μ L lOmmol/L 序列表的序列 1 所示DNA、0. 5 μ L 10mmol/L序列表的序列2所示DNA、2 μ L所述模板和0. 3 μ L5U/ μ L Taq DNA polymerase 组成；所述 PCR 的反应条件为94°C 5min ；94°C 30s, 53°C 30s, 72°C lmin, 34 个循环；72 °C IOmin。
9.一种辅助检测待测样本中是否含有黄瓜绿斑驳花叶病毒的方法，包括如下步骤以 待测样本的cDNA为模板，用特异引物对进行PCR，检测PCR产物；如果得到524bp的PCR产 物，则待测样本中疑似含有黄瓜绿斑驳花叶病毒；如果没有得到524bp的PCR产物，则待测 样本中疑似不含有黄瓜绿斑驳花叶病毒；所述特异引物对由序列表的序列1所示DNA和序 列表的序列2所示DNA组成。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于所述PCR的反应体系由15.2yLddH20、 2. 5μ L 10XPCR bufferU. 0μ L 10mmol/L dNTP mix.O. 5μ L lOmmol/L 序列表的序列 1 所示 DNA、0. 5 μ L 10mmol/L 序列表的序列 2 所示 DNA、2 μ L 模板和 0. 3 μ L 5U/μ L TaqDNA polymerase 组成；所述 PCR 的反应条件为94°C 5min ；94°C 30s, 53°C 30s, 72°C lmin，34 个 循环；72°C IOmin ；所述待测样本为植物样本。
全文摘要
本发明公开了一种快速检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的试剂盒及其应用。本发明提供的特异引物对由序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成。采用本发明的特异引物对或试剂盒检测CGMMV，操作简单、快速、结果可靠、特异性强、灵敏度高，非常适合应用在口岸现场检测。本发明的特异引物对或试剂盒可用于CGMMV口岸检测和田间疫情调查，特别适合农业部门的各检疫检查站、各口岸检验检疫局、植物病毒研究机构等应用。
文档编号C12Q1/68GK102140536SQ201110020249
公开日2011年8月3日 申请日期2011年1月18日 优先权日2011年1月18日
发明者丁建云, 张永江, 朱水芳, 李明福, 李桂芬, 田永蕾, 赵竹, 陈笑瑜, 马洁, 魏梅生 申请人:中国检验检疫科学研究院