专利名称：一种生产手性纯(2s,3s)-2,3-丁二醇的方法
技术领域：
本发明涉及一种生产手性纯2，3-丁二醇0，3-BD)的方法，尤其涉及一种生产手性纯(2S，3 -2，3-丁二醇(2S，3S-BD)的方法，具体说，是将(2S，3 -2，3-丁二醇脱氢酶 (2S,3S-BDH)基因在大肠杆菌(E.coli)中表达，并以此重组Ε. coli全细胞为生物催化剂， 以双乙酰(DA)和葡萄糖为底物高效生产手性纯2S，3S-BD的方法。
背景技术：
2,3-BD在常温下是一种无色无味透明的液体，有三种同分异构体meSO-2，3- 丁二醇(meso-BD)、(2R，3R)-2，3-丁二醇(2R, 3R-BD)和 2S，3S_BD。2，3_BD 广泛应用于化工、食品、燃料及航天航空等多个领域(Syu M J.，Appl. Microbiol. Biotechnol.，2001， 55 :10-18)。具有光学活性的2R，3R-BD和2S，3S-BD还可用作防冻剂，由于其具有手性碳原子，在不对称合成中也有重要用途(Celinska E. & Grajek W.，Biotechnol. Adv.， 2009,27 :715-725) ο 除此之外，2S，3S-BD 可抑制腺嘌呤环化酶(Adenylyl cyclase) 7，同时刺激Adenylyl cyclase 6和Adenylyl cyclase 9，这对cAMP产生系统具有重要意义 (Hasanuzzaman M. , Yoshimura Μ. , Alcohol. Clin. Exp. Res. ,2010,34 :743-749)。在发酵生产2，3_BD的菌种中，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)和产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)以meso-BD为主要代谢产物，只有少量的2S， 3S-BD (CelinskaE. & Grajek W.，Biotechnol. Adv. ,2009,27(6) :715-725 ；Qin J.et al.， Chinese J. Chem. Eng. ,2006,14 :132-136)；多粘芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa) 发酵主要代谢产物为 2R，3R-BD (Nakashimada Y. et al.，J. Biosci. Bioeng.，2000，90 661-664)。因此，采用菌株进行发酵生产不能得到手性纯的2S，3S-BD。2001 年，Ui 等将解糖短杆菌(Brevibacterium saccharolyticum)中 2S，3S_BDH编码基因在E. coli中表达，以外消旋的乙偶姻(AC)为底物，可生产3. 7g L-1的2S,3S-BD(ee 值为 95 % ) (Ui et al.，Lett. Appl. Microbiol. ,2001,32(2) :93-98)。2004 年，Ui 等 M K. pneumoniae 中 meso—2, 3- 丁二醇脱氧醇(meso—BDH)禾口 B. saccharolyticum 中 2S, 3S-BDH编码基因在E. coli中共表达，以DA为底物，可生产2. 2g Γ1的2S，3S-BD (ee值为 96% ) (Uiet al.，Lett. Appl. Microbiol.，2004，39 (6) :533-537)。2010 年，Xiao 等将枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)中2R，3R-2，3-丁二醇脱氢酶(2R，3R-BDH)和短乳杆菌 (Lactobacillus brevis)中NADH氧化酶编码基因在Ε. coli中表达，拆分混合2，3-BD，可生产 2.4g L-1 的 2S，3S-BD(ee 值> 99% ) (Xiao Ζ. et al.，PLoS One，2010，5 (1)，e8860)。 但由于产物浓度和光学纯度的限制，使上述方法无法满足工业生产需求。因此有必要寻找更好的方法，以实现手性纯2S，3S-BD的高效生产。近年来，生物催化剂由于其具有高立体选择性和底物选择性，更多的被应用于高值化合物合成；全细胞作为一种常用的生物催化剂，在有机合成中被广泛应用。全细胞常被应用于需要辅因子再生的合成反应，比如还原酶催化的反应，只需加入廉价的葡萄糖，就可达到细胞内部辅因子再生(Goldberg K. et al.，Appl. Microbiol. Biotechnol.，2007，76
4249-255)。此外，全细胞催化法产物分离较简单，具有工业化应用前景(Schmid A. et al., Nature, 2001,409 258-268)。
发明内容
针对上述现有方法中，2S，3S_BD的产量低、ee值低，难以大规模生产的不足，本发明要解决的问题是提供一种生产手性纯2S，3S-BD的方法。本发明是利用2S，3S-BDH可催化DA生成S-乙偶姻(S-AC)，同时可催化S-AC禾口 2S，3S-BD之间转化的性质，加入葡萄糖补充该过程消耗的NADH，使细胞中NADH再生。将2S， 3S-BDH基因在E. coli中表达，以此重组E. coli全细胞为生物催化剂，以双乙酰(DA)和葡萄糖为底物，实现手性纯2S，3S-BD的高效生产。本发明所述生产手性纯2S，3S -BD的方法，其特征在于将2S，3S-BDH基因在 E. coli中表达，并以此重组E. coli全细胞为生物催化剂，以双乙酰(DA)和葡萄糖为底物转化生产手性纯2S，3S-BD。其中所述2S，3S-BDH基因来源于肠杆菌属(Enterobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)禾口棒杆菌属(Corynebacterium)、泛菌属(Pantoea)、乳杆菌属 (Lactobacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、链球菌属(Streptococcus)。进一步的，所述2S，3S-BDH基因来源菌株优选是Ε·cloacae ssp. dissolvens SDM、 K. pneumonia ATCC 49790 C. glutamicum ATCC 13032。上述的重组Ε. coli是采用常规(参考科学出版社出版的《精编分子生物学指南) 的方法先克隆到2S，3S-BDH基因，再构建重组质粒，转化到E. coli (优选E. coli BL21)中， 然后经筛选获得；其含有2S，3S-BDH基因，为革兰氏阴性菌，需氧或兼性厌氧生长，较佳培养温度为37 士 1°C，可以在含有100 μ g mL—1氨苄青霉素的LB培养基上生长，可以用于催化双乙酰(DA)和葡萄糖生产手性纯2S，3S-BD。本发明所述生产手性纯2S，3S_BD的方法中以重组E. coli全细胞为生物催化剂， 以双乙酰(DA)和葡萄糖为底物转化生产手性纯2S，3S-BD的具体方法是(1)平板培养将重组E. coli菌株划线到含有质量体积比为1. 5 1. 8%琼脂的并含有ΙΟΟμ gmL—1氨苄青霉素的LB平板上，37士 1°C培养12士 1小时；(2) 一级种子在无菌的条件下，用无菌的牙签挑取步骤(1)平板上的一个单菌落，然后接种到5mL的含有100 μ g mL—1氨苄青霉素的LB液体培养基中，37士 1°C摇床震荡培养12 士 1小时；(3) 二级种子在无菌条件下，取步骤(2)所培养的菌液以体积比1 3%的接种量，接种到30 500mL含有100 μ g ml/1氨苄青霉素的LB液体培养基中，37 士 1°C摇床震荡培养12 士 1小时；(4)发酵罐培养在无菌条件下，取步骤(3)所得的菌液以体积比为6 10%的接种量接种到2 IOL的含有100 μ g mL-1氨苄青霉素的LB液体培养基中，37士 1°C培养5 20小时，然后再加入终浓度为ImM的IPTG，10 37°C诱导5 24小时，停止发酵；其中，上述步骤⑴ (4)中所述的LB培养基配方为1L蒸馏水中含10g蛋白胨，5g酵母粉，IOgNaCl, 121°C条件下灭菌15分钟。(5)收集菌体将步骤(4)培养得到的培养物8，000士500rpm离心15分钟；并用0.85wt%的生理盐水洗涤菌体2 3遍，然后将细胞悬起到pH 7、200mM的Tris-HCl缓冲液中，使细胞的终浓度为2 IOg L—1 ；将菌体置于4°C的冰箱中保藏，即得到重组E. coli全细胞生物催化剂，待用；(6)转化实验制备产物以浓度为2 IOg L—1的生物催化剂，在10 42°C、pH 5. 0 9. 0条件下，180rpm摇床震荡，转化初始浓度为5 20g L—1的DA，并加入5 120g Γ1的葡萄糖以补充反应所需辅因子的消耗；每隔2小时取样，样品以8，000士500印111离心 10 15分钟，去除所加入的生物催化剂，检测上清中DA和葡萄糖浓度，根据DA和葡萄糖浓度补加DA和葡萄糖，使DA浓度达到5 20g L—1，葡萄糖浓度达到5 120g L—1 ；对上清进行气相色谱分析测定转化液中2S，3S-BD的浓度及光学纯度；当2S，3S-BD的浓度不再增加时，停止转化。上述底物DA的检测方法是
样品进行设定的稀释后，取680 μ L样品加入20 μ L 0.5%的3，3' -二氨基联苯胺盐酸盐，室温下，黑暗处理1分钟；加入200 μ L 3Μ的硫酸和100 μ L的水，室温下黑暗处理 10 分钟；366nm 处检测吸光度(Pien J. et al.，Lait, 1937，17 :673_698)。上述底物葡萄糖的检测方法是样品进行设定的稀释后，采用生物传感分析仪SBA_40C(山东省科学院生物研究所)测定。测定原理为利用固定化葡萄糖氧化酶膜专一性测定葡萄糖含量。上述转化产物2S，3S-BD的检测方法是每500mL乙酸乙酯中加入ImL异戊醇，作为萃取剂；利用该萃取剂，对步骤(6)中转化产物的样品进行等体积萃取，利用涡旋振荡器对萃取的样品震荡1分钟，然后静置，取上层样品进行气相检测。具体的气相检测条件如下所用气相色谱仪的型号为Agilent 6820，氮气作为载气，进样器和检测器的温度均设为280°C，检测过程的柱温设定为40°C保持3分钟；然后以每分钟1. 5°C的速率升温到80°C ；以每分钟0. 50C的速率升温到86°C ；以每分钟30°C的速率升温到200°C。进样量
1.5 μ L，进行气相检测。上述生产手性纯2S，3S-BD的方法中，步骤(4)所述诱导培养温度优选10 30°C ；诱导培养时间优选10 20小时。步骤(6)所述转化实验优选以浓度为3.0 8.0g干细胞L—1的生物催化剂，在 20 37°C，pH 6. 0 8. 0,180rpm震荡条件下对底物进行转化。步骤(6)所述初始DA浓度优选10 25g L—1，初始葡萄糖浓度优选20 IOOg L—1。步骤(6)所述转化实验过程中补加DA和葡萄糖，使DA浓度优选达到10 25g Γ1, 葡萄糖浓度优选达到20 IOOg L—1。本发明成功的实现了将2S，3S_BDH基因在Ε. coli中表达，并以此重组E. coli全细胞为生物催化剂，以DA和葡萄糖为底物高效生产手性纯2S，3S-BD。本发明具有以下特点(1)应用表达2S，3S_BDH的重组E. coli全细胞为生物催化剂，催化DA生产手性纯 2S，3S-BD。(2)在转化体系中加入葡萄糖，实现细胞内辅因子的再生。(3)参与菌株要求的培养基简单、成本低。
(4)利用全细胞生产手性纯2S，3S-BD,操作过程简单，产物分离方便。(5)本发明的生物催化剂能转化DA生产手性纯2S，3S_BD，最高产量可达到268广以上，ee值大于99%。
图1重组E. coli的蛋白电泳图，M =Maker ；1 :E. coll ；2 未加IPTG诱导的重组 E. coli ；3 :IPTG 诱导的重组 E. coli ；4 :2S，3S-BDH 纯酶。图2标准品的气相色谱图谱，其中*为内标异戊醇，其他各物质的保留时间分别为=R-AC 14. 240 ；S-AC 16. 036 ；2S，3S_BD 32. 909 ；2R，3R_BD34. 175 ；meso—BD 36.034。图3重组E. coli催化DA生产2S，3S-BD转化液的气相色谱图谱。
具体实施例方式下面通过实施例进一步阐明本发明，但不仅限于此。实施例1 :E. cloacae ssp. dissolvens SDM 中的 2S，3S-BDH 在生产 2S，3S-BD 中的
应用1、重组基因工程菌的构建采用常规的方法制备菌株e. cloacae ssp. dissolvens SDM(CGMCC No. 4230)的基因组DNA，该过程可参考科学出版社出版的《精编分子生物学指南》中细菌基因组的小量制备的方法，提取E. cloacae ssp. dissolvens SDM的基因组DNA ；使用合成的引物从 E. cloacaessp. dissolvens SDM 基因组 DNA 中 PCR 扩增得到 2S, 3S-BDH 基因(budC)。budC基因的来源菌E. cloacae ssp. dissolvens SDM(CGMCC No. 4230)为申请人实验室前期筛选得到的一株高产2，3-BD菌株，其已进行了保藏但未进行基因组测序。根据已测序的Enterobacter sp. 638的基因组序列，设计引物；上游引物5，-GAATTCAATGCAAAAAGTTGCTCTCG-3，，携带一个 EcoRI 位点；下游引物5，-AAGCTTTTAATTGAATACCATCCCACCGT-3，，携带一个 HindIII 位点。上述budC基因序列长度为771个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所不。将PCR扩增得到的片段连接到pEasy-blimt (购自北京全式金生物技术有限公司)上，得到重组质粒pEasy-blunt-budC ；使用EcoRI、HindIII双酶切质粒pETDuet (购自德国默克Merck集团)和pEasy-blunt-budC，回收片段budC及pETDuet，连接，得到重组质粒pETDuet-budC ；将上述重组质粒经过转化导入宿主E. coli BL21，得到工程菌株 E. coliBL21/pETDuet-budC。该菌株在含100 μ g ml/1氨苄青霉素的LB液体培养基中，37°C 培养4小时，加入终浓度为ImM的IPTG，16°C诱导10小时，得到表达有2S，3S-BDH的重组基因工程菌细胞，经12. 5%的SDS-PAGE验证，结果如图1所示。上述重组基因工程菌株为革兰氏阴性菌，需氧或兼性厌氧生长，可以用于催化DA 生产手性纯2S，3S-BD。2、重组E. coli全细胞催化剂的制备(1)平板培养将上述方法得到的重组E. coli菌株划线到含有质量体积比为 1. 5%琼脂的并含有100 μ g mL—1氨苄青霉素的LB平板上，37°C培养12小时；
(2) 一级种子在无菌的条件下，用无菌的牙签挑取步骤(1)平板上的一个单菌落，然后接种到5mL的含有100 μ g mL—1氨苄青霉素的LB液体培养基中，37°C摇床震荡培养 12小时；
(3) 二级种子在无菌条件下，取步骤(2)所培养的菌液以体积比2%的接种量，接种到30 500mL含有100 μ g mL—1氨苄青霉素的LB液体培养基中，37°C摇床震荡培养12 小时；(4)发酵罐培养在无菌条件下，取步骤(3)所得的菌液以体积比为8%的接种量接种到2 IOL的含有100 μ g mL—1氨苄青霉素的LB液体培养基中，37°C培养10小时，然后再加入终浓度为ImM的IPTG，16°C诱导14小时，停止发酵。其中，上述步骤(1) (4)中所述的LB培养基配方为1L蒸馏水中含10g蛋白胨，5g酵母粉，IOgNaCl, 121°C条件下灭菌15分钟。(5)收集菌体将步骤⑷培养得到的培养物8，OOOrpm离心15分钟；并用 0. 85wt%的生理盐水洗涤菌体2 3遍，然后将细胞悬起到pH 7、200mM的Tris-HCl缓冲液中，使细胞的终浓度为8g L—1 ；将菌体置于4°C的冰箱中保藏，即得到重组E. coli全细胞生物催化剂，待用。3、利用重组E. coli全细胞催化剂制备2S，3S-BD选择上述获得的重组E. coli全细胞作为催化剂，以浓度为8g L—1进行如下转化过程在30°C、pH 7. 0条件下，180rpm摇床震荡，转化初始浓度为20g L—1的DA，并加入 40g L—1的葡萄糖以补充反应所需辅因子的消耗；发酵中每隔2小时取样，样品以8，OOOrpm 离心10分钟，去除所加入的生物催化剂，检测上清中DA和葡萄糖浓度，根据DA和葡萄糖浓度补加DA和葡萄糖，使DA浓度达到IOg Γ1,葡萄糖浓度达到20g Γ1 ；对上清进行气相色谱分析测定转化液中2S，3S-BD的浓度及光学纯度，当2S，3S-BD的浓度不再增加时，停止转化。14小时后检测结果显示2S，3S_BD的浓度为26. 8g L—1，其ee值大于99%。该样品的气相色谱图谱见图3，保留时间为32. 909的峰即是2S，3S-BD的峰。实施例2 :K. pneumonia ATCC 49790 中的 2S，3S-BDH 在生产 2S，3S-BD 中的应用方法同实施例1的操作，只是将2S，3S-BDH的来源菌株改为K. pneumonia ATCC 49790，根据已测序的该菌的基因组序列设计引物如下上游引物5，-CCCGGATCCAATGAAAAAAGTCGCAC-3，，携带一个 BamHI 位点；下游引物5，-CCCAAGCTTTTAGTTAAACACCATCCCGC-3，，携带一个 HindIII 位点。上述2S，3S-BDH基因序列长度为771个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。同实施例1的操作获得重组E. coli全细胞作为催化剂，并进行转化反应。对上清进行气相色谱分析测定转化液中2S，3S_BD的浓度及光学纯度，当2S， 3S-BD的浓度不再增加时，停止转化。18小时后检测显示转化产物中2S，3S_BD的浓度为15. 3g L—1，其ee值大于99%。实施例3 :C. glutamicum ATCC 13032 中的 2S，3S-BDH 在生产 2S，3S-BD 中的应用方法同实施例1的操作，只是将2S，3S-BDH的来源菌株改为C. glutamicum ATCC13032，根据已测序的该菌的基因组序列设计引物如下
上游引物5，-AAAGAATTCAATGAGCAAAGTTGCAATGGT-3，，携带一个 EcoRI 位点；下游引物5，-TTTAAGCTTCTAGTTGTAGAGCATGCCGC-3，， 携带一个 HindIII 位点。上述2S，3S-BDH基因序列长度为777个碱基，其核苷酸序列Genebank编号为 3345609。同实施例1的操作获得重组E. coli全细胞作为催化剂，并进行转化反应。对上清进行气相色谱分析测定转化液中2S，3S_BD的浓度及光学纯度，当2S， 3S-BD的浓度不再增加时，停止转化。18小时后检测显示转化产物中2S，3S_BD的浓度为9. Ig L—1，其ee值大于99%。
权利要求
1.一种生产手性纯(2S，3S)-2，3-丁二醇的方法，其特征在于将(2S，3S)-2，3-丁二醇脱氢酶基因在大肠杆菌中表达，并以此重组大肠杆菌为生物催化剂，以双乙酰和葡萄糖为底物转化生产手性纯(2S，3S) -2，3- 丁二醇。
2.如权利要求1所述生产手性纯(2S，3S)-2，3-丁二醇的方法，其特征在于 所述(2S，3S) -2，3- 丁二醇脱氢酶基因来源于肠杆菌属(Enterobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)禾口棒杆菌属(Corynebacterium)、泛菌属(Pantoea)、乳杆菌属 (Lactobacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、链球菌属(Streptococcus)。
3.如权利要求2所述生产手性纯(2S，3S)-2，3-丁二醇的方法，其特征在于所述(2S，3S)-2，3-丁二醇脱氢酶基因来源菌株是 E. cloacae ssp. dissolvens SDM、 Klebsiellapneumonia ATCC 49790 或 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032。
4.如权利要求1所述生产手性纯(2S，3S))-2，3-丁二醇的方法，其特征在于所述以重组大肠杆菌全细胞为生物催化剂，以双乙酰和葡萄糖为底物转化生产手性纯(2S，3S)-2， 3_ 丁二醇的方法是(1)平板培养将重组大肠杆菌菌株划线到含有质量体积比为1.5 1. 8%琼脂的并含有IOOyg πιΓ1氨苄青霉素的LB平板上，37士 1°C培养12士 1小时；(2)一级种子在无菌的条件下，用无菌的牙签挑取步骤(1)平板上的一个单菌落，然后接种到5mL的含有100 μ g mL—1氨苄青霉素的LB液体培养基中，37士 1°C摇床震荡培养 12士 1小时；(3)二级种子在无菌条件下，取步骤(2)所培养的菌液以体积比1 3%的接种量，接种到30 500mL含有100 μ g mL—1氨苄青霉素的LB液体培养基中，37士 1°C摇床震荡培养 12士 1小时；(4)发酵罐培养在无菌条件下，取步骤(3)所得的菌液以体积比为6 10%的接种量接种到2 IOL的含有100 μ g mL—1氨苄青霉素的LB液体培养基中，37 士 1°C培养5 20 小时，然后再加入终浓度为ImM的IPTG，10 37°C诱导5 24小时，停止发酵；其中，上述步骤(1) (4)中所述的LB培养基配方为1L蒸馏水中含10g蛋白胨，5g 酵母粉，IOgNaCl, 121°C条件下灭菌15分钟。(5)收集菌体将步骤⑷培养得到的培养物8，000士500rpm离心15分钟；并用 0. 85wt%的生理盐水洗涤菌体2 3遍，然后将细胞悬起到pH 7、200mM的Tris-HCl缓冲液中，使细胞的终浓度为2 IOg L—1 ；将菌体置于4°C的冰箱中保藏，即得到重组大肠杆菌全细胞生物催化剂，待用；(6)转化实验制备产物以浓度为2 IOgL—1的生物催化剂，在10 42°C、pH 5. O 9. O条件下，ISOrpm摇床震荡，转化初始浓度为5 20g L—1的双乙酰，并加入5 120g L—1的葡萄糖以补充反应所需辅因子的消耗；每隔2小时取样，样品以8，000士500印111离心10 15分钟，去除所加入的生物催化剂，检测上清中双乙酰和葡萄糖浓度，根据双乙酰和葡萄糖浓度补加双乙酰和葡萄糖，使双乙酰浓度达到5 20g厂1，葡萄糖浓度达到5 120g Γ1 ； 对上清进行气相色谱分析测定转化液中(2S，3S)-2，3-丁二醇的浓度及光学纯度；当(2S， 3S)-2，3-丁二醇的浓度不再增加时，停止转化。
5.如权利要求4所述生产手性纯(2S，3S)-2，3-丁二醇的方法，其特征在于，步骤(4) 所述诱导培养温度为10 30°C ；诱导培养时间为10 20小时。
6.如权利要求4所述生产手性纯(2S，3S)-2，3-丁二醇的方法，其特征在于，步骤(6) 所述转化实验是以浓度为3. O 8. Og干细胞L—1的生物催化剂，在20 37°C，pH 6. 0 8. 0，ISOrpm震荡条件下对底物进行转化。
7.如权利要求4所述生产手性纯(2S，3S)-2，3-丁二醇的方法，其特征在于，步骤(6) 所述初始双乙酰浓度为10 25g L—1，初始葡萄糖浓度为20 IOOg L—1。
8.如权利要求4所述生产手性纯(2S，3S)-2，3-丁二醇的方法，其特征在于，步骤(6) 所述转化实验过程中补加双乙酰和葡萄糖，使双乙酰浓度达到10 25g L—1，葡萄糖浓度达到 20 IOOg Γ1。
全文摘要
本发明公开了一种生产手性纯(2S，3S)-2，3-丁二醇的方法，是将(2S，3S)-2，3-丁二醇脱氢酶基因在大肠杆菌中表达，并以此重组大肠杆菌全细胞为生物催化剂，以双乙酰和葡萄糖为底物转化生产手性纯(2S，3S)-2，3-丁二醇。本发明方法中参与菌株要求的培养基简单、成本低，并且生产过程及产物分离方便。生产的手性纯(2S，3S)-2，3-丁二醇最高产量可达到26gL-1以上，ee值大于99％，具有推广应用价值和可观的经济效益。
文档编号C12P7/18GK102154384SQ20111002106
公开日2011年8月17日 申请日期2011年1月19日 优先权日2011年1月19日
发明者李理想, 王钰, 许平, 马翠卿 申请人:山东大学