专利名称：一种制备高三尖杉酯碱的方法及专用菌株的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种制备高三尖杉酯碱的方法及专用菌株。
背景技术：
高三尖杉酯碱是从三尖杉科粗榧属植物中提取的具有多种抗肿瘤功效的四骈环生物碱类药物，属细胞周期特异性药物，对Gl和G2期细胞杀伤作用最强，而对S期细胞作用较小。目前国内已批准临床应用，但未经FDA批准上市。海南粗榧的根、茎、叶和果实都含有高三尖杉酯碱，尤其树皮中高三尖杉酯碱含量较高，是生产此类抗癌药物的主要原料。 但因其生长缓慢、繁殖困难以及过度采伐，资源几近枯竭。药源不足已成为限制高三尖杉酯碱在临床应用的瓶颈。采用微生物发酵生产是降低成本、大量获取高三尖杉酯碱的理想方法。1993年 Mrobel等首次从短叶红豆杉(Taxus breviflia)的树皮中分离出能产生抗肿瘤化合物紫杉醇(Taxol)的内生真菌-安德鲁紫杉菌(Taxomyces andreanae)，这一发现掀起了从药用植物中分离内生菌的热潮。国内外学者纷纷展开了这方面的研究、分离新的可产抗肿瘤代谢产物的内生真菌、进行菌种选育和培养条件的优化。高三尖杉酯碱的化学式=C29H39NO9,结构式如下
权利要求
1.细极链格孢(Alternariatenuissima) CH1307，其保藏编号为 CGMCC No. 4443。
2.细极链格孢(Alternariatenuissima) CH1307 CGMCC No. 4443在制备高三尖杉酯碱中的应用。
3.一种制备高三尖杉酯碱的方法，包括如下步骤发酵细极链格孢(Alternaria tenuissima) CH1307 CGMCC No. 4443，并向发酵体系中添加高三尖杉酯碱合成前体物质，进行生物合成，得到高三尖杉酯碱。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述发酵的方法包括如下步骤(1)将细极链格孢(Alternariatenuissima) CH1307 CGMCC No. 4443 接种于初始发酵培养基中，培养；(2)在步骤(1)的基础上添加补充培养基I，培养；(3)在步骤O)的基础上添加补充培养基II，培养；所述补充培养基I为葡萄糖水溶液和硝酸铵水溶液的等体积比混合液；所述葡萄糖水溶液的浓度为8% -12%或10% (质量百分含量)，所述硝酸铵水溶液的浓度为 0.8%-1.2%或(质量百分含量)；所述补充培养基II为葡萄糖水溶液和硝酸铵水溶液的等体积比混合液；所述葡萄糖水溶液的浓度为4% -8%或6% (质量百分含量)，所述硝酸铵水溶液的浓度为2% -6%或 4% (质量百分含量)。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于所述步骤(1)、(2)和(3)中，所述培养的温度为25°C 48°C，具体为25°C ；和/或，所述步骤(1)、(2)和(3)中，所述培养在转速为160-200r/min，旋转半径为 250mm的条件下进行。
6.根据权利要求3或4或5所述的方法，其特征在于每1升所述初始发酵培养基按照如下方法配制将马铃薯180g-220g或200g与水混合，煮沸15分钟-30分钟或30分钟，过滤，取滤液；向滤液中加入蔗糖20g-30g或25g、牛肉膏0. 5g-l. 5g或lg、蛋白胨0. 5g_l. 5g 或lg、硝酸铵0. 5g-l. 5g或lg，用水定容至lOOOmL，得到所述发酵培养基；和/或，所述步骤(1)中，所述培养的时间为3-5天，具体为4天；和/或，所述步骤⑵中，所述培养的时间为1-3天，具体为3天；和/或，所述步骤(3)中，所述培养的时间为6-10天，具体为8天。
7.根据权利要求3-6中任一所述的方法，其特征在于所述向发酵体系中添加高三尖杉酯碱合成前体物质在所述步骤( 结束后步骤( 开始时进行。
8.根据权利要求3-7中任一所述的方法，其特征在于所述高三尖杉酯碱合成前体物质为酪氨酸和苯丙氨酸。
9.根据权利要求3-8中任一所述的方法，其特征在于所述补充培养基I与所述初始发酵培养基的体积比为10ml-30ml 200ml_600ml，具体为IOml 200ml ；所述补充培养基II与所述初始发酵培养基的体积比为10ml-30ml 200ml-600ml，具体为 10ml 200ml ；所述酪氨酸和苯丙氨酸分别以其水溶液的形式添加；所述酪氨酸水溶液的浓度为0. 05mg/mL-0. 15mg/mL或0. lmg/mL ；所述酪氨酸水溶液与所述初始发酵培养基的配比为anl-5mL 200ml-500ml，具体为3mL 200ml ；所述苯丙氨酸水溶液的浓度为0. 05mg/mL-0. 15mg/mL或0. lmg/mL，所述苯丙氨酸水溶液与所述初始发酵培养基的配比为1. 5mL-3. 5mL 200mL_500ml，具体为2. 79mL 200ml。
10.根据权利要求3-9中任一所述的方法，其特征在于 所述方法中，在所述步骤C3)后，还包括如下提取步骤将发酵物进行分离，得到菌丝体和发酵液；分别从菌丝体和发酵液中提取得到高三尖杉酯碱；从发酵液中提取高三尖杉酯碱的方法包括如下步骤将发酵液的PH值调至3-5，静置 Mh-48h，过滤，取滤液；将滤液的pH值调至9-11，用氯仿萃取，取有机相；去除有机相中的氯仿和水分，得到高三尖杉酯碱；从菌体中提取高三尖杉酯碱的方法包括如下步骤将菌体磨碎，加入氯仿，将体系的 PH值调至9-11，静置Mh-48h，再超声作用30min-60min，过滤，取滤液；去除滤液中的氯仿和水分，得到高三尖杉酯碱。
全文摘要
本发明公开了一种制备高三尖杉酯碱的方法及专用菌株。该菌株为细极链格孢(Alternaria tenuissima)CH1307，其保藏编号为CGMCC No.4443。实验证明，本发明的菌株具有很高的产高三尖杉酯碱的能力。用本发明方法制备高三尖杉酯碱，具有产率高、操作简单、成本低廉的优点。因此，本发明方法解决了高三尖杉酯碱资源紧缺的问题，既保证了高三尖杉酯碱的高效生产，又避免了砍伐树木，保护了自然资源。
文档编号C12R1/645GK102161973SQ20111002819
公开日2011年8月24日 申请日期2011年1月26日 优先权日2011年1月26日
发明者刘四新, 李从发, 蔡坤, 袁牧 申请人:海南大学