猪脂肪组织特异性嵌合启动子的制作方法

专利名称：猪脂肪组织特异性嵌合启动子的制作方法
技术领域：
本发明属于动物基因工程技术领域。具体涉及一个猪脂肪组织特异启动子的构建，功能验证及应用，并通过组建嵌合启动子的方法提高其转录活性，构建成两个嵌合启动子，但同时又不破坏它的脂肪组织特异性。
背景技术：
启动子(promoter)是基因的一个组成部分，在遗传学中是指一段能使基因进行转录的脱氧核糖核酸(deoxyribonuclein acid, DNA)序列。启动子能够被核糖核酸 (ribonuclein acid,RNA)聚合酶,转录调节因子等识别并与之结合形成转录起始复合物区域，从而起始基因转录。启动子通常位于基因上游，它控制基因转录的起始位点和表达的程度，是RNA聚合酶进行精确有效转录所必需的[1]。与RNA聚合酶亲和力高的启动子，其起始频率和效率均高，也称为强启动子。一个典型的启动子包括CAAT-box和TATA-box，它们分别依赖于DNA的RNA聚合酶的识别和结合位点，一般位于转录起始位点上游几十个碱基处。 在核心启动子上游通常会有一些特殊的DNA序列，即顺式作用元件(ciselement)，转录因子与之结合从而激活或抑制基因的转录[1]。一旦RNA聚合酶定位并结合在启动子上即可启动基因转录，因此启动子是基因表达调控的重要元件，它与RNA聚合酶及其他蛋白辅助因子等反式作用因子的相互作用是启动子调控基因转录的实质。对于外源基因能否在哺乳动物细胞中高水平表达，启动子则是一个非常关键的因素。在转基因动物研究中如何选配设计启动子是决定外源基因在受体细胞中能否正确表达的关键环节，一般对非特异性表达基因而言，只能用组成型或广谱型与之重组，而对特异性表达基因而言，所选用的启动子必须具有严格的时空作用特异性，如组织细胞特异性启动子、生长发育时期特异性启动子和诱导特异性启动子等。有时为了增强基因的特异性表达， 还必须设计出单一型增强子或复合型增强子与之匹配。有许多报道表明，采用增加启动子数目能提高外源基因的表达效率。章倩倩等[2]学者将骨骼肌中特异高效表达的启动子序列和巨细胞病毒(CMV)启动子组合在一起大大地提高外源基因在肌肉组织的表达效率。同时增强子作为远端调控区也可增强启动子的转录活性，其中最先被研究描述的是SV40。动物和人类病毒基因转录调控机制与高等真核细胞的基因转录调控机制类同，研究病毒的启动子为了解真核生物基因组调控提供了模型，应用病毒的启动子等基因转录调节原理构建各类基因工程载体，能够有效提高目的基因的转录以及表达效率。人的CMV早期基因增强子与其它病毒增强子如疱疹病毒，劳氏肉瘤病毒和肝炎B 病毒相比是活性最高的一个增强子[3]。在许多研究试验中通常将CMV增强子与启动子组合从而达到增强基因的转录活性^4’5’6’7’8’9’1'最新研究报道[11]从猪BAC库中分离得到 adiponectin基因5’侧翼区序列，经过5’ -RACE确定3个转录起始位点。在该试验中通过构建一系列缺失片段，发现启动子区-1671-+263是猪adiponectin基因转录活性的有效区，其中-1671—1455是促使adiponectin基因高表达所必需的。荧光素酶报告载体和EMSA 分析在-1150—1130区存在一个重要的顺式作用元件cAMP-responsive element (CRE)，与cAMP-responsive element binding protein (CREB)结合，结果表明 CREB是猪adiponectin 基因转录活性的重要调控因子。但该片断是否可作为脂肪组织特异的高效表达启动子并不是很清楚。在转基因动物的制备过程中，需要能在特异组织中高效表达的启动子，而可用的启动子又很少。因此本研究在于选取猪的猪adiponectin基因的-1671-+263区域，将其与 CMV增强子和SV40增强子分别嵌合，从而改造成适合转基因生产所需要的启动子。为后续的转基因动物对脂肪组织特异启动子的需求提供素材。

发明内容
本发明的目的在于确定猪脂肪组织特异性调控元件adi-ρ 并验证其活性，之后通过组建嵌合启动子的方法，最终构建保留其组织特异，且能具有高效转录活性的嵌合启动子。在本发明中，申请人扩增了猪adiponectin基因第一外显子之前启动子区域中含有 CRE结合位点的640bp片段，将其命名为adi-ρ ，构建pGL3-Basic双荧光素酶报告载体， 与pRL-TK质粒瞬时共转染分化7天后小鼠前体脂肪细胞3T3-L1和小鼠骨骼肌细胞C2C12， 验证其活性。之后扩增了 pCMV IE启动子片段(其序列见序列表SEQ ID NO :2，片段长度为548bp)和SV40增强子片段(其序列见序列表SEQ ID NO :3，片段长度为237bp)，分别与adi-pro调控元件进行组合,构建pGL3-CMV_adi-pro启动子(见序列表SEQ ID NO -A, 长度为1188bp)和pGL3-SVenh-adi-pro (见序列表SEQ ID NO :5，长度为877bp)嵌合启动子，将这两个启动子片断分别与pRL-ΤΚ质粒瞬时共转染未分化以及分化7天的3T3-L1和 C2C12，最终得到两个活性较高的脂肪组织特异性嵌合启动子(其序列如SEQ ID NO :4和5 所示)。本发明是这样实现的由图I的技术流程，首先利用PCR方法扩增出adi-pro片段(电泳结果如附图2 所示)，其核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:1所示，序列长度为640bp，测序后利用美国国家生物技术信息中心NCBI (http://blast, ncbi. nlm. nih. Rov/Blast. crD进行序列比对,确定所扩增的序列是正确的。接下来，扩增带有Kpn I与Mlu I酶切位点的adi-pro片段,并将这条序列克隆到PMD-18T载体上(图22)。随后用限制性内切酶Kpn I与Mlu I双酶切 pMD-18T-adi-pro载体(双酶切电泳图如图3所示)与pGL3_Basic载体(图23所示)。将从pMD-18T-adi-pro载体中酶切出的adi-pro片段与pGL3_Basic载体进行连接反应。将构建好的双荧光素酶报告载体命名为pGL3-adi-pix)，用限制性内切酶Kpn I与Mlu I双酶切该载体电泳检测adi-pro片段是否成功构建于该载体(双酶切电泳结果如图4所示)。 之后将pGL3-adi-pro与pRL_TK(图26所示)瞬时共转染分化7天的小鼠前体脂肪细胞和小鼠骨骼肌成肌细胞(图5所示)，通过酶标仪测定荧光值，用荧光比值确定adi-pro调控元件是否在成熟的脂肪细胞中表现出的活性要高于在肌细胞中表现出的活性。同时将已构建好的pGL3-adi-pix)双荧光素酶报告载体与pRL-ΤΚ瞬时共转染未分化与分化7天的小鼠前体脂肪细胞，观测adi-pro调控元件活性的变化情况。试验结果表明,adi-pro调控元件在成熟的脂肪细胞中表现出的活性要高于在肌细胞中表现出的活性(图6所示)；同时 adi-pro调控元件在未分化的脂肪细胞中活性较低，而在成熟的脂肪细胞中则表现出较高的活性(图7所示)。第二步，以真核表达载体pIRES2-EGFP (图25所示)为模板扩增带有Kpn I与MluI酶切位点的PCMVIE启动子片段(电泳结果如图9所示)，将该片段命名为CMV，序列长度为548bp。将这条序列克隆到pMD-18T载体，随后用限制性内切酶Kpn I与Mlu I双酶切 PMD-18T-CMV与pGL3-Basic载体(电泳结果如图11所示)，将从pMD_18T_CMV载体中切出的CMV片段与线性pGL3-Basic载体进行连接反应。将构建好的双荧光素酶报告载体命名为PGL3-CMV。用限制性内切酶Kpn I与Mlu I双酶切该载体电泳检测CMV片段是否成功构建于该载体(电泳结果如图12所示)；同时扩增带有Mlu I与Xho I酶切位点的adi-pro 片段(电泳结果如图10所示)，与含有pCMV IE启动子的双荧光素酶报告载体进行连接反应。将构建好的双荧光素酶报告载体命名为pGL3-CMV-adi-pro。用限制性内切酶Mlu I与 Xho I双酶切该载体电泳检测adi-pro片段是否成功构建于该载体(电泳结果如图13所示)，说明成功组建嵌合启动子CMV-adi-pro,其核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:4所示。第三步，以真核表达载体pGL3_Enhancer (图24所示)为模板扩增带有Kpn I与 Mlu I酶切位点的SV40增强子片段(电泳结果如图14所示)，将该片段命名为SVenh，片段长度为237bp。将这条序列克隆到pMD-18T载体，之后用限制性内切酶Kpn I与Mlu I双酶切 pMD-18T-SVenh载体(电泳结果如图15所示)与双荧光素酶报告载体pGL3-CMV_adi-pro， 将从pMD-18T-SVenh载体中切出的SVenh片段代替pGL3-CMV-adi-pro双荧光素酶报告载体中的CMV片段，将构建好的双荧光素酶报告载体命名为pGL3-SVenh-adi-pix)，限制性内切酶Kpn I与Mlu I双酶切该载体电泳检测SVenh片段是否成功构建于该载体(双酶切电泳结果如图16所示)，说明成功组建嵌合启动子SVenh-adi-pro,其核苷酸序列如序列表 SEQID N0:3所示。最后用限制性内切酶Kpn I与Mlu I双酶切pMD-18T_adi-pro载体与 pGL3-Enhancer真核表达载体,将切出的adi-pro片段与pGL3_Enhancer载体进行连接反应。将构建好的双荧光素酶报告载体命名为pGL3-Enhancer-adi-pr0，限制性内切酶Kpn I 与Mlu I双酶切该载体电泳检测adi-pro片段是否成功构建于该载体(电泳结果如图8所示)O第四步，将pGL3-CMV-adi-pro载体报告系统以及pGL3_adi-pro载体报告系统, 以pGL3-Basic作为阴性对照，与pRL-ΤΚ质粒瞬时共转染分化7天的小鼠前体脂肪细胞与分化7天的小鼠骨骼肌成肌细胞。转染实验结束后收集细胞，用酶标仪测定荧光值，观察 CMV-adi-pro是否表现出高活性，并且在成熟的脂肪细胞中表现的活性要高于在肌细胞中表现出的活性。之后将pGL3-CMV-adi-pro嵌合启动子载体报告系统同样以pGL3-Basic作为阴性对照，与pRL-ΤΚ质粒瞬时共转染未分化以及分化7天的小鼠前体脂肪细胞，测得荧光比值，观测CMV-adi-pro嵌合启动子活性的变化情况。试验结果CMV-adi-pro嵌合启动子的活性要高于非嵌合启动子adi-pro的活性，在成熟的脂肪细胞中表现的活性要高于在肌细胞中表现出的活性(图17所示)；并且CMV-adi-pro在未分化的脂肪细胞中活性很低而在成熟的脂肪细胞中则活性较高(图18所示)。结果表明嵌合启动子CMV-adi-pro不仅使单一调控元件adi-pro的活性增强同时还保留了 adi-pro调控元件的组织细胞特异性。第五步，将pGL3-SVenh-adi-pro嵌合启动子载体报告系统以及 pGL3-Enhancer-adi-pro载体报告系统，以pGL3_Enhancer作为阴性对照，与pRL-TK质粒瞬时共转染分化7天的小鼠前体脂肪细胞与分化7天的小鼠骨骼肌成肌细胞，通过荧光比值观测嵌合启动子SVenh-adi-pix)所表现出的活性是否要高于非嵌合启动子，并且 SVenh-adi-pro嵌合启动子在成熟的脂肪细胞中表现出的活性是否也高于在肌细胞中表现出的活性。接下来将pGL3-SVenh-adi-pro载体报告系统同样以pGL3_Enhancer作为阴性对照，与PRL-TK质粒瞬时共转染未分化以及分化7天的小鼠前体脂肪细胞，测得荧光比值， 观测SVenh-adi-pro嵌合启动子活性的变化情况。试验结果SVenh_adi-pro嵌合启动子的活性要高于非嵌合启动子的活性，在成熟的脂肪细胞中表现的活性要高于在肌细胞中表现出的活性(图19所示)；SVenh-adi-pro嵌合启动子在未分化的脂肪细胞中表现的活性较低，而在成熟的脂肪细胞中则表现出较高活性(图20所示)。同样可得出SVenh-adi-pix) 嵌合启动子不仅使单一调控元件adi-pro的活性增强同时还保留了 adi-pix)调控元件的组织细胞特异性。第六步，将载体报告系统pGL3-CMV_adi-pro 和 pGL3-SVenh_adi-pro,与 pRL-TK 质粒瞬时共转染分化7天的小鼠前体脂肪细胞，通过测得的荧光比值，比较两个不同嵌合启动子的活性。试验结果在成熟的脂肪细胞中，CMV-adi-pro嵌合启动子的活性远远高于 SVenh-adi-pro嵌合启动子的活性(图21所示)。本发明的优点在于(I)本发明详尽的验证了 adi-pix)调控元件的活性，通过嵌合的方法构建了含有 pCMV IE启动子和SV40增强子的不同嵌合启动子，使adi-ρ 调控元件的活性大大提高。(2)本发明获得了在成熟脂肪细胞活性较高且具有组织细胞特异的两个嵌合启动子，为基因工程和分子育种提供了新的特异表达的启动子资源。更详细的技术方案参见《具体实施方式
》的内容。


序列表SEQ ID NO: I是本发明中选取猪adiponectin基因第一外显子之前启动子区中含有CRE结合位点的adi-pro核苷酸序列，其长度为640bp。序列表SEQ ID NO 2是本发明中扩增的pCMVIE启动子片段，其长度为548bp。序列表SEQ ID NO 3是本发明中扩增的SV40增强子片段，其长度为237bp。序列表SEQ ID NO 4是本发明的嵌合启动子CMV-adi-pix)的核苷酸序列，其长度为 1188bp。序列表SEQ ID NO 5是本发明的嵌合启动子SVenh-adi-pro的核苷酸序列，其长度为877bp。图I :是本发明的技术路线图。图2 :是本发明中利用Adi-F、Adi-R引物对所扩增的选取猪adiponectin基因第一外显子之前启动子区含有CRE结合位点的adi-pro序列电泳检测图。图中泳道M =DNA 分子标准(DL20001adder)。图3 :是本发明中利用Adi-FUAdi-Rl引物扩增出的adi-pro基因片段，将该片段连入到PMD-18T载体，之后用限制性内切酶Kpn I和MluI双酶切pMD_18T载体的电泳检测图。图中泳道M =DNA分子标准(DL20001adder)。图4 :是本发明中带有Kpn I和Mlu I酶切位点的adi-pro基因片段与用限制性内切酶Kpn I和Mlu I双酶切pGL3-Basic进行连接反应构建出pGL3_adi-pro载体报告系统后，进行Kpn I和Mlu I双酶切鉴定的电泳检测图。图中泳道M:DNA分子标准 (DLlOOOOladder)。
图5 :是本发明中分别培养的未分化的小鼠前体脂肪细胞、未分化的小鼠骨骼肌成肌细胞、分化7天的小鼠前体脂肪细胞以及分化7天的小鼠骨骼肌成肌细胞在倒置显微镜下拍摄的细胞图片。图中细胞放大倍数为10X20。图6 :是本发明中adi-pro调控元件在不同细胞中的活性比较分析，即在分化7天的小鼠前体脂肪细胞和分化7天的小鼠骨骼肌成肌细胞。图中pGL3-BasiC为阴性对照， 荧光比值结果均值用Excel电子表格的STDEV函数计算标准偏差。图7 :是本发明中adi-pro调控元件在同一种细胞不同时期中的活性分析，即在未分化与分化7天的小鼠前体脂肪细胞。图中荧光比值结果均值用Excel电子表格的STDEV 函数计算标准偏差。图8 :是本发明中带有Kpn I和Mlu I酶切位点的adi-pro基因片段与用限制性内切酶Kpn I和Mlu I双酶切pGL3_Enhancer进行连接反应构建出pGL3-Enhancer-adi-pro 载体报告系统后的电泳检测图。图中泳道M =DNA分子标准(DL20001adder)。图9 是本发明中利用CMV-F、CMV-R弓丨物扩增出的pCMVIE启动子序列电泳检测图。图中泳道M =DNA分子标准(DL20001adder)。图10 :是本发明中利用Adi-F2、Adi-R2引物扩增出的adi-pro序列电泳检测图。 图中泳道M DNA分子标准(DL20001adder)。图11 :是本发明中限制性内切酶Kpn I和Mlu I双酶切pGL3_Basic与连入带有 Kpn I和Mlu I酶切位点pCMV IE启动子的pMD_18T载体的电泳检测图。图中泳道M:DNA 分子标准(DLlOOOOladder)，泳道I和2 :限制性内切酶Kpn I和Mlu I双酶切pGL3_Basic 载体；泳道3和4 :限制性内切酶Kpn I和Mlu I双酶切的pMD_18T_CMV载体。图12 :是本发明中带有Kpn I和Mlu I酶切位点的CMV片段与用限制性内切酶Kpn I和Mlu I双酶切pGL3-Basic进行连接反应构建出pGL3-CMV_adi-pro载体报告系统后，进行Kpn I和Mlu I双酶切鉴定的电泳检测图。图中泳道M:DNA分子标准(DL20001adder)。图13 :是本发明中带有Mlu I和Xho I酶切位点的adi-pro片段与用限制性内切酶Mlu I和Xho I双酶切pGL3-Basic进行连接反应构建出双荧光素酶载体报告系统后，进行Mlu I和Xho I双酶切鉴定的电泳检测图。图中泳道M:DNA分子标准(DL20001adder)。图14 :是本发明中利用SVenh-F、SVenh-R引物扩增出的SV40增强子序列电泳检测图。图中泳道M =DNA分子标准(DL20001adder)。图15 :是本发明中利用SVenh-F、SVenh-R引物扩增出的SVenh片段，将该片段连入到pMD-18T载体，之后用限制性内切酶Kpn I和Mlu I双酶切pMD-18T_SVenh载体的电泳检测图。图中泳道M =DNA分子标准(DL20001adder)。图16 :是本发明中带有Kpn I和Mlu I酶切位点的SVenh片段与用限制性内切酶 Kpn I和Mlu I双酶切pGL3-CMV_adi-pro进行连接反应构建出pGL3-SVenh_adi-pro载体报告系统后，进行Kpn I和Mlu I双酶切鉴定的电泳检测图。图中泳道M =DNA分子标准 (DL20001adder)。图17 :是本发明中CMV-adi-pro嵌合启动子在不同细胞中的活性比较分析，即在分化7天的小鼠前体脂肪细胞和分化7天的小鼠骨骼肌成肌细胞，同时与非嵌合的adi-pro 调控元件进行活性比较。图中pGL3-BasiC为阴性对照，荧光比值结果均值用Excel电子表格的STDEV函数计算标准偏差。
图18 :是本发明中CMV-adi-pro嵌合启动子在同一种细胞不同时期的活性分析, 即在未分化和分化7天的小鼠前体脂肪细胞。图中pGL3-BasiC为阴性对照，荧光比值结果均值用Excel电子表格的STDEV函数计算标准偏差。图19 :是本发明中SVenh-adi-pro嵌合启动子在不同细胞中的活性比较分析， 即在分化7天的小鼠前体脂肪细胞和分化7天的小鼠骨骼肌成肌细胞，同时与非嵌合的 adi-pro调控元件进行活性比较。图中pGL3_Enhancer为阴性对照,突光比值结果均值用 Excel电子表格的STDEV函数计算标准偏差。图20 :是本发明中SVenh-adi-pro嵌合启动子在同一种细胞不同时期的活性分析，即在未分化和分化7天的小鼠前体脂肪细胞。图中pGL3-Enhancer为阴性对照，荧光比值结果均值用Excel电子表格的STDEV函数计算标准偏差。图21 :是本发明中嵌合启动子CMV-adi-pro与嵌合启动子SVenh-adi-pro在分化7天的小鼠前体脂肪细胞中的活性分析。图中荧光比值结果均值用Excel电子表格的 STDEV函数计算标准偏差。图22 :是本发明中用于克隆的T载体结构示意图。图23 :是本发明中用于分析猪adi-pro调控元件与嵌合启动子CMV-adi-pro、 SVenh-adi-pro活性的pGL3_Basic双突光素酶报告载体结构示意图。图24 :是本发明中用于扩增SVenh序列以及分析嵌合启动子SVenh-adi-pro活性的pGL3-Enhancer双突光素酶报告载体结构示意图。图25 :是本发明中用于扩增CMV启动子序列的pIRES2_EGFP真核表达载体结构示意图。图26 :是本发明中用于分析猪adi-pro调控元件与嵌合启动子CMV-adi-pro、 SVenh-adi-pro活性所用的pRL_TK内参载体结构示意图。图27 :是本发明中用于计算荧光比值标准偏差所用的STDEV函数推导公式图。图28 :是本发明获得的第一个启动子的原序列，长度为1188bp。图29 :是本发明获得的第二个启动子的原序列，长度为877bp。
具体实施例方式实施例I :猪脂肪组织特异表达基因adiponectin第一外显子前启动子区含有CRE 结合位点序列adi-pro的获取。I.主要试剂苯酚(国药集团化学试剂有限公司)、氯仿(国药集团化学试剂有限公司)、异戊醇(国药集团化学试剂有限公司)、质粒提取试剂盒(购自OMEGA公司)、pMD-18T载体 (宝生物工程大连有限公司)、LA Taq聚合酶(宝生物工程大连有限公司)、dNTP (购自 Fermentas 公司)、DL_2000Marker (购自 Fermentas 公司)、UNIQ-10 柱式 DNA 胶回收试剂盒(购自北京百泰克生物技术有限公司)2.主要溶液的配制(I)血液样品采集相关溶液的配制IM Tris. cl储备液称取121. 4g Tris碱溶于800mL双蒸水中，加浓盐酸调至pH =8. O,定容至lOOOmL。高压灭菌,室温保存。
O. 5MEDTA (pH = 8. O):称取 186. lgNa2EDTA · 2H20 溶于 800mL 双蒸水中，加入 NaOH(约20g)调至pH = 8. O,定容至lOOOmL。高压灭菌,室温保存。(2)基因组DNA提取相关溶液的配制蛋白酶K :200mg蛋白酶K溶于IOmL双蒸水中，以2mL分装，_20°C冷冻保存。饱和平衡酚溶液市售酚经180°C重蒸馏，冷至室温后加入8-羟基喹啉至终浓度 O. 1%,加入等体积的O. 5mol/L Tris · Cl (pH8. O)，充分摇动混匀。静置分层移去上层缓冲液，加入等体积的O. lmol/L Tris ·Η(1(ρΗ8.0)，摇动20min，再吸去上层水相，重复直至酚相pH值达7. 9以上，置于棕色瓶中，室温保存。氯仿/异戊醇(体积比24 I):量取480mL 氯仿，加入20mL异戊醇，混匀。10 X SET 缓冲液15m mol/L Tris*Cl(pH8. 0), 15m mol/L EDTA，5mmol/L 氯化钠。10% SDS :称取50gSDS加热溶于400mL双蒸水中，定容至500mL。高压灭菌，室温保存。TE 缓冲液100mmol/L Tris · Cl (pH = 8. 0), lmmol/L EDTA (pH = 8· 0)。 (3) 琼脂糖凝胶电泳及检测相关溶液的配制50XTAE储备液称取242gTris碱溶于750mL双蒸水中，加入57. ImLHAC, IOOmL 0. 5M EDTA (pH = 8. 0)，加水定容至 IOOOmL05XTBE储备液称取54gTris碱和27. 5g硼酸溶于750mL双蒸水中，加入20mL 0. 5M EDTA (pH = 8. 0)，加水定容至 IOOOmL06X上样缓冲液0· 25%溴酚兰。0. 25%二甲苯青，15% Ficoll聚蔗糖。溴化乙锭(EB，10mg/mL) :IOOmL双蒸水中加入0. lgEB，搅拌使完全溶解，转入棕色试剂瓶，锡纸包裹。(4)相关溶液的配制LB液体培养基取细菌培养用胰蛋白胨10g，细菌培养用酵母提取物5g，NaCl 5g 溶于950mL双蒸水中，摇动容器直至溶质完全溶解，用5mol/L NaOH(约0. 2mL)调节pH值至7. 0，加水定容至IOOOmL,高压灭菌，室温保存。LB固体培养基按上述方法配制液体培养基，每IOOmL加入I. 5g琼脂粉，在121°C 高压蒸汽下灭菌30min，在无菌状态下铺平板，冷却后封口备用。0. lmol/L CaCl2溶液取I. Ig无水CaCl2溶于90mL双蒸水中，加入双蒸水定容至 IOOmL,在121°C高压蒸汽下灭菌30min,于室温下保存。3.组织样品收集“大白猪”(为外国猪血缘)与“梅山猪”(为中国猪血缘)的血样，利用常规的酚/氯仿抽提法提取猪基因组DNA，详细步骤如下4.猪基因组DNA的提取(I)每头猪前腔静脉采血20mL左右，加入一预装有ImL抗凝剂(0. 5mol/LEDTA)的 50mL离心管中。(2)用高速冷冻离心机3000rpm, 4°C离心IOmin,弃上层血清。(3)加I. 5倍体积的双蒸水，轻摇lOmin，破碎红细胞。(4) 5000rpm, 4°C离心IOmin,弃去上层红细胞衆。(5)加入20mL 0. 9% NACl溶液洗涤，5000rpm，4°C离心lOmin，弃去上清，获得白细
胞沉淀。
(6)加入I X SET缓冲液悬浮白细胞，加入蛋白酶K (10mg/L)至浓度ΙΟΟμ g/mL，再加入10% SDS至终浓度O. 5%，55°C消化过夜。(7)加入等体积的饱和酚，盖紧管盖，轻轻上下颠倒混匀约20min，5000rpm，4°C离心 IOmin0(8)用剪掉尖嘴的大口径吸头吸取上清液，移入新的50mL离心管，弃去下层苯酚。(9)重复上述步骤7、8两次。(10)加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(体积比25 24 I)混合液，轻轻倒转离心管，混勻15min, IOOOrpm, 4°C离心15min,再按照步骤8收集上清。(11)加入等体积的氯仿/异戊醇(体积比24 I)，同上再抽提一次。(12)加入2. 5倍体积预冷的无水乙醇，轻轻摇动离心管，即有DNA呈絮状析出。(13)用巴斯德吸管吸出絮状的DNA于一新干净的I. 5mL的离心管中，用70%乙醇洗漆一次，3000rpm离心5min,弃去上层乙醇。(14)将离心管于真空干燥泵中37°C抽真空干燥DNA，加入300 μ L TE溶解DNA，于 4°C保存。5.猪基因组DNA的浓度鉴定和质量检测利用Pharmacia公司的DNA/RNA浓度测定仪测定DNA浓度，根据浓度的大小以及稀释倍数，换算成待测DNA浓度，并把管中的DNA作相应的稀释，以50ng/ μ L分装，_20°C保存。根据记录的A260/A280比值，估测DNA质量，一般A260/A280在I. 6-1. 8之间，蛋白质含量为零时可以满足本试验的要求。6. adi-pro 片段的扩增利用 NCBI 网站(http://www. ncbi. nlm. nih. Rov/nuccore/F.T461661. I)获取至丨J猪 adiponectin基因第一外显子前启动子的序列信息，GenBank登录号FJ461661. I。选取其中含有CRE结合位点的启动子序列，命名为adi-pix)。以大白猪和梅山猪的基因组DNA为模板，利用表I中引物Adi-F和Adi-R进行PCR扩增。PCR反应总体系为25μ L :0. 5μ L dNTP, O. 5μ L特异引物，O. 25 μ L LA Taq 酶，2.5yL Buffer，300_500ng 基因组 DNA 模板，加去离子水至25 μ L0PCR 反应条件94°C 4min ；94°C 45s, 59. 5°C退火 40s, 72°C 45s 共计 35 个循环；最后 72°C延伸 IOmin0PCR产物的回收与纯化PCR产物经I. 5%琼脂糖凝胶电泳检测后，在紫外灯下从琼脂糖凝胶上将含有目的片段的凝胶切下，放入I. 5mL Ependorff管中，然后用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)纯化PCR产物。连接反应将纯化的PCR产物与pMD18-T载体连接，连接反应总体积是10 μ 1，其中包括I. 5 μ 12 X ligationbuffer,0. 3 μ I载体，5 μ I纯化PCR产物，4°C过夜连接。转化无菌状态下取50 100 μ I感受态细胞于I. 5ml Ependorff管中，将 5 10 μ I的连接产物加入轻轻混匀，在冰上放置30min后42°C热激90s，其间不要摇动 Ependorff管，取出后迅速冰浴2 3min，加入400 μ I无抗生素的LB培养液，37°C，220rpm/ min温浴复苏45-60min。然后6000rpm/min离心6min,去除适量的上清,将剩余的菌体与培养基轻轻混匀，含100μ g/mL氨苄青霉素(Amp)的平板上，涂匀，37°C正置培养Ih后倒置培养，14-16小时后观察有无菌落长出。
阳性克隆子的鉴定及测序从平板上挑取单克隆接入I. 5mL含500 μ L氨苄青霉素 (Amp)浓度为100 μ g/mL的LB培养液中，并于37°C摇床220rpm/min培养约4_6h左右。以菌液为模板，选用特异性引物Adi-F与Adi-R(表I所示)进行PCR扩增。电泳检测，挑取阳性克隆子的菌液送去测序，序列测定由北京奥科生物技术有限责任公司完成。测序结果显示为正确的adi-pro片段序列(见SEQ ID NO 1所示，序列长度为640bp)。实施例2 :调控元件adi-pro转染载体的构建I.主要试剂DLIOOOOMarker，T4DNA连接酶购自宝生物工程大连有限公司；限制性内切酶 KpnI, Mlu I购自NEB公司；质粒小量快速提取试剂盒购自原平皓生物公司；Endo-free Plasmid Mini KitII质粒小提试剂盒购自OMEGA公司；pGL3_Basic真核表达载体购自 Promega 公司2.双荧光素酶报告载体pGL3-Basic双酶切用Kpn I、Mlu I 双酶切 pGL3_Basic 载体，双酶切体系 20 μ I :2 μ I Buffer 2， O. 5μ I Kpn 1,0. 5μ I Mlu I，I μ lpGL3_Basic 载体，O. 2 μ I BSA，补灭菌超纯水至 20 μ I。 酶切4-6h。酶切产物用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒(购自北京百泰克生物技术有限公司)回收纯化。3.含adi-ρ 片段的TA克隆载体双酶切利用表I中引物Adi-Fl与Adi-Rl扩增出带有Kpn I和Mlu I酶切位点的adi-pro 片段，与PMD-18T载体连接。用Kpn I、Mlu I双酶切pMD-18T_adi-pro载体，双酶切体系 20 μ I 2 μ I Buffer 2,0. 5μ I KpnI, 0. 5 μ IMlu Ι，6 μ I 含有目的片段的 TA 克隆载体， 0. 2μ I BSA，补灭菌超纯水至20 μ I。酶切4-6h。酶切产物用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒(购自北京百泰克生物技术有限公司)回收纯化。3.重组载体的构建将双酶切回收后的adi-ρ 片段连入双酶切后的pGL3-Basic载体上，所构建的载体分别命名为 pGL3-adi-pro。连接体系 10μ 1:1 μ I 10 X Buffer, 0. 5 μ I 5U/μ I Τ4 ligase, 2 μ I双酶切的pGL3_Basic载体,6 μ I adi-pro片段,补灭菌超纯水至10 μ I。16°C 过夜连接。然后连接产物转化入大肠杆菌DH5a。利用PCR来检测阳性克隆，阳性克隆送北京奥科生物技术有限责任公司进行测序。序列经测序确认正确后，对阳性克隆进行扩大培养，并抽提质粒。质粒提取用OMEGA公司的质粒提取试剂盒提取，质粒纯度与浓度纯度利用 NanoDrop2000 Spectrophotometer (美国 NanoDrop 公司)检测，所测的样品的 0D260/280 值在I. 8-2. O才可用于后续的实验。另外，所提取的质粒再次进行双酶切鉴定，双酶切鉴定结果如图4所示。双酶切鉴定结果显示所构建的重组载体正确。实施例3 adi-pro调控元件的活性分析I.主要试剂胎牛血清(FBS，购自美国GIBCO公司)；马血清(HBS，购自美国GIBCO公司)；DMEM 高糖培养基(购自美国GIBCO公司);脂质体Lipofectamine2000 (购自invitrogen公司)； Dual-Luciferase Reporter AssaySystem(购自 Promega 公司)2.主要耗材细胞培养24孔板(美国Corning公司)、细胞培养瓶、一次性塑料移液管、0. 22 μ m孔径的一次性滤器、一次性针头注射器、封口膜(Parafilm公司)、橡胶手套，酶标板(美国Corning公司)3.主要试剂的配制(I) I XPBS 配制称取 NaCl 8g，KCl O. 2g，Na2HPO4 · 12H20 I. 54g, KH2PO4 0. 19g 溶解于IOOOmL蒸懼水中，调节pH至7. O,高压灭菌。(2)油红O染液称取O. 5g油红0(购自Amersco公司)加入IOOmL异丙醇静置 8-lOmin后滤纸过滤，按照油红O染液与去离子水3 2的比例稀释油红O染液，滤纸过滤 2次,室温放置IOmin,置于棕色瓶4°C避光保存。(3)细胞冻存液的配制无菌容器中加入4mL灭菌胎牛血清，14mL过滤后的无血清培养基，2mLDMS0 (购自Sigma公司)，混匀避光，分装于I. 5mL离心管，_20°C保存。(4)0. 25%胰酶溶液的配制:调至pH至8.0，过滤除菌，分装200yL于1.5mL离心管中，-20°C保存。(5) 10%胎牛血清高糖DMEM培养基的配制50mL规格注射器吸取DMEM高糖培养基，每IOOmLDMEM高糖培养基中加入IOmL胎牛血清，O. 22 μ M过滤器进行过滤除菌，封口
4°C保存。(6) 2%马血清高糖DMEM培养基的配制50mL规格注射器吸取DMEM高糖培养基， 每IOOmL DMEM高糖培养基中加入2mL马血清，O. 22 μ M过滤器进行过滤除菌，封口 4°C保存。(7)胰岛素(Insulin)储存液的配制称取25mg胰岛素(购自Sigma公司)，加入 12. 5mL的稀盐酸(PH2-3)，配制终浓度为I μ g/mL的胰岛素储存液。(8)IBMX(1-甲基-3-异丁醇黄嘌呤)储存液的配制称取IOOmg IBMX(购自Sigma 公司)，加入900 μ LDMSO,配制终浓度为O. 5mol/L的IBMX储存液。(9)地塞米松(Dexamethasone)储存液的配制称取25mg地塞米松(购自Sigma 公司)，加入6. 37mL无水乙醇，配制终浓度为I μ mol/L的地塞米松储存液。4.细胞培养当小鼠前体脂肪细胞3T3-L1与小鼠骨骼肌成肌细胞C2C12的细胞汇合度达到 70%-80%时即可对细胞进行传代培养。首先吸取细胞培养瓶内旧的培养基，用IXPBS冲洗2-3遍，加入O. 25%的胰蛋白酶(Trypsin，购自美国GIBCO公司)200-300 μ L，使胰蛋白酶与贴壁细胞充分接触，置于37°C培养箱消化大约30s，弃去胰蛋白酶，加入新的胎牛血清高糖培养基，用吸管充分吹打混匀，使之成为单细胞悬液，之后接种到细胞培养瓶中，放入二氧化碳培养箱中继续培养。24h后可以更换培养液吸弃未贴壁的细胞。之后培养可每1-2 天换液一次(未分化细胞见附图5未分化的小鼠前体脂肪细胞和未分化的小鼠骨骼肌成肌细胞)。5.细胞的诱导分化培养(1)3T3_L1细胞的诱导分化培养将接种于24孔板生长24h汇合度达到70% _80%的细胞从细胞培养箱中取出，在倒置显微镜下观察细胞的形态以及生长状况。每个孔板细胞数达8X 104-1 X 105。将胎牛血清高糖培养基吸出，之后将诱导培养基按照每孔600 μ L加入。其中诱导培养基为^lmL 胎牛血清高糖培养基中加入O. 5 μ L胰岛素，I μ L ΙΒΜΧ, I μ L地塞米松稀。在分化培养基中诱导分化2天后细胞体积开始变大变圆，局部出现小突起，此时将细胞培养基换为胎牛血清高糖培养基，继续在5% CO2培养箱中进行培养。在小鼠前体脂肪细胞3T3-L1诱导分化7天后，进行转染试验。期间大约每1-2天进行一次换液。(2)油红O染色首先吸弃原有培养液，用PBS缓冲液(商购)洗涤2-3次，加入10%中性甲醛固定 IOmin0之后加入油红O染液进行染色,染色IOmin后吸弃去染色液,置于显微镜下进行观察，及时拍照，如果染色时间过长，脂滴会自发破裂(染色后脂滴见附图5分化7天的小鼠前体脂肪细胞)。(3)C2C12细胞的诱导分化培养将接种于24孔板生长24h汇合度达到70% _80%的细胞从细胞培养箱中取出，置于倒置显微镜下观察细胞形态以及生长情况。每个孔板细胞数达8X 104-1 X 105。吸弃旧的2%马血清高糖培养基，换成新鲜的2%马血清高糖培养基，置于5% CO2培养箱中继续培养。在小鼠骨骼肌成肌细胞诱导分化6-7天后，进行转染试验。期间大约每1-2天进行一次换液。5.瞬时转染试验选用Lipofectamine 2000进行瞬时转染试验。其中选用pRL_TK质粒(普洛麦格 (北京)生物技术有限公司，即美国Promega公司)作为参照，与pGL3_adi-pro质粒共转染。(I)转染试验开始前2h，用10%胎牛血清高糖DMEM培养基(配制方法50mL规格注射器吸取DMEM高糖培养基，每IOOmLDMEM高糖培养基中加入IOmL胎牛血清，O. 22 μ M过滤器进行过滤除菌，封口 4°C保存)进行培养。(2)24孔板每孔按照Iyg质粒转染量进行转染。首先将每个待转染的质粒用 50 μ L的0ΡΤΙ-ΜΕΜΙ低血清培养基来稀释，在室温下静置5min。(3)对于要转染的每孔细胞，用50 μ L的0ΡΤΙ-ΜΕΜΙ低血清培养基(购自 invitrogen 公司)稀释 Lipofectamine 2000，待转染质粒与脂质体 Lipofectamine 2000 按照I : 3 (质量与体积比)来添加,在室温下静置5min,待Lipofectamine 2000稀释完成后，20min之内必须和质粒稀释液进行混合。在混合20min期间，吸弃细胞培养板中原有的培养基，用0ΡΤΙ-ΜΕΜΙ低血清培养基清洗每个孔板，以稀释残留原有培养基，防止影响转染效率。(4) pRL-TK 质粒与 pGL3_adi-pro 质粒共转染。pRL-TK 质粒与 pGL3_adi-pro 质粒按照I : 20的比例进行共转染试验。(5)将 pRL-TK 质粒和 pGL3_adi-pro 与 Lipofectamine 2000 混合物加入到 24 孔板中，并轻轻前后晃动培养板使其混匀。(6)将24孔板置于CO2细胞培养箱中继续培养，培养6h后更换新的培养基，以保证转染后细胞的活性。6.荧光素酶活性测定选用Promega 公司的 Dual-Luciferase Reporter Assay System 双突光素酶报告系统进行试验。(I)在转染后48h之内(24_36h之间)对细胞进行裂解。裂解细胞前，吸弃原培养液，用PBS清洗2-3次，吸取100 μ L的细胞裂解液加入到每个细胞孔中，其中细胞裂解液按照Passive Lysis Buffer :灭菌去离子水为I : 4的比例进行配制。裂解液加完之后,将细胞孔板前后左右晃动20min或进行吹打,使细胞充分裂解。裂解完成后，细胞裂解液可置于-20°C进行保存或可直接进行双荧光素酶活性的测定。(2)将 10mT,的 Luciferase Assay Buffer II 加入到 Luciferase Assay Substrate中，充分混勻。此混合液为BufferI。(3)将 200 μ L 的 Stop&Glo Substrate 50X 加入到 10mT,的 Stop&Glo Buffer 中， 充分混匀。此混合液为BufferII。(4)用多功能酶标仪进行测定。在黑色酶标板中每孔加入10 μ L细胞裂解液，置于多功能酶标仪中。测定过程分两步，首先加入50 μ L Buffer I，待此步骤运行结束之后再加 Λ 50 μ L Buffer II。注意整个测定过程应避光操作。实施例4 :组建嵌合启动子CMV-adi-pro与SVenh-adi-proI.主要试剂同实施例2所用试剂；限制性内切酶Xho 1(购自NEB公司)； PIRES2-EGFP真核表达载体；pGL3-EnhanCer真核表达载体(购自北京普洛麦格(北京)生物技术有限公司，即美国Promega公司)。2.组建嵌合启动子CMV-adi-pro :扩增CMV片段以pIRES2-EGFP(购自北京普洛麦格(北京)生物技术有限公司，即美国Promega公司)真核表达载体作为模板，利用表I中引物CMV-F与CMV-R扩增 548bp(见序列表SEQ ID NO 2)的pCMV IE启动子片段，将该片段命名为CMV。PCR反应总体系为 25μ L :0. 5μ L dNTP，0. 5μ L 特异引物，O. 25μ L LA Taq 酶，2.5yL Buffer,, IuL pIRES2-EGFP (质粒稀释100倍)，加去离子水至25yL。PCR反应条件94°C 4min ; 94°C 45s, 65. 1°C退火45s，7°C 45s共计35个循环；最后72°C延伸lOmin。PCR产物回收纯化，与PMD-18T载体连接，转化，挑取阳性克隆进行测序。pGL3-Basic真核表达载体与pMD_18T_CMV载体的双酶切反应(I)Kpn I 与 Mlu I 双酶切 pMD_18T_CMV 载体8 μ L pMD_18T_CMV 载体，2 μ L buffer 4,0. 7μ L Kpn I 限制性内切酶，0. 6 μ L Mlu I 限制性内切酶，0. 2 μ L BSA,8. 5μ L 去离子水。(2) Kpn I 与Mlu I 双酶切 pGL3_Basic 真核表达载体1 μ L pGL3_Basic 载体,2 μ L buffer 4,0. 7μ L Kpn I 限制性内切酶，O. 6 μ L Mlu I 限制性内切酶，O. 2 μ L BSA, 15. 5μ L
去离子水。放置37 °C恒温培养箱进行酶切反应4_6h。连接反应目的片段回收之后进行连接反应，连接反应体系总体积为10 μ L，其中 6μ L CMV，2y LpGL3-Basic 载体，I μ L Τ4 buffer,0. 5μ L Τ4 连接酶，O. 5 μ L 去离子水。 16 °C过夜连接。连接产物转化,挑取阳性克隆,提取质粒(Endo-free Plasmid Mini KitII质粒小提试剂盒购自OMEGA公司)。扩增带有Mlu I和Xho I酶切位点的adi-pro片段利用表I中引物Adi_F2与 Adi-R2扩增片段。pGL3-CMV载体与pMD-18T_adi-pro载体的双酶切反应(I)Xho I 与 Mlu I 双酶切 pMD-18T-adi-pro 载体8 μ L pMD-18T-adi-pro 载体， 2μ L buffer 3,0. 5μ L Xho I 限制性内切酶，O. 5 μ L Mlu I 限制性内切酶，O. 2 μ L BSA, 8. 8μ L去离子水。
(2) Xho I 与 Mlu I 双酶切 pGL3_CMV 载体:I μ L pGL3_CMV 载体，2 μ L buffer 3，
O.5μ L Xho I限制性内切酶，O. 5μ L Mlu I限制性内切酶，O. 2 μ L BSA，15. 8 μ L去离子水。放置37 °C恒温培养箱进行酶切反应4_6h。目的片段回收，连接，转化，挑取阳性克隆，提取质粒pGL3-CMV-adi-pix)。提取质粒之后限制性内切酶双酶切质粒检测如图12和图13所示，酶切出CMV片段与adi-pix)片段。3.组建嵌合启动子 SVenh-adi-pro :扩增SVenh片段以pGL3_Enhancer真核表达载体为模板，利用表I中引物 SVenh-F与SVenh-R扩增237bp (见序列表SE ID NO 3)的SV40增强子片段，该基因片段命名为SVenh。PCR反应总体系为25 μ L :2 μ L dNTP，I μ L特异引物，O. 25 μ L LA Taq酶，
2.5 μ L Buffer,，O. 2 μ L pGL3_Enhancer，加去离子水至 25 μ L。PCR 反应条件94°C 4min ； 94°C 45s，67°C退火35s，72°C 30s共计35个循环；最后72°C延伸lOmin。回收扩增得到的 SVenh片段，4°C过夜与pMD_18T载体进行连接反应。转化，挑取阳性克隆，测序正确后提取质粒。pGL3-SVenh-adi-pro载体的构建同样用Kpn I与Mlu I这两种限制性内切酶进行双酶切反应。将pGL3-CMV-adi-pro载体中的CMV基因序列切掉，取而代之的是从 pMD-18T-SVenh载体切下的SVenh片段。16°C过夜连接之后，进行转化，挑取阳性克隆等试验，测序正确后用Endo-free Plasmid Mini KitII质粒小提试剂盒提取质粒。表I本发明所设计的扩增序列的弓I物序列信息
权利要求
1.一个猪脂肪组织特异性嵌合启动子，其核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:4所示。
2.一个猪脂肪组织特异性嵌合启动子，其核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:5所示。
3.权利要求I或2所述的启动子在调控基因在猪脂肪组织表达中的应用。
全文摘要
本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及两个猪脂肪组织特异性嵌合启动子的克隆、功能验证及应用。本发明验证了adi-pro调控元件的活性，通过嵌合的方法构建了含有pCMVIE启动子和SV40增强子的不同嵌合启动子，使adi-pro调控元件的活性大大提高，为基因工程和分子育种提供了新的特异表达的启动子资源。所述的启动子的核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO4和SEQ ID NO5所述。
文档编号C12N15/113GK102604947SQ20111002869
公开日2012年7月25日 申请日期2011年1月24日 优先权日2011年1月24日
发明者李芳 , 蒋思文 申请人:华中农业大学