专利名称：一种快速检测肠出血性大肠埃希菌的纳米生物传感器的制作方法
技术领域：
本发明属于生物传感器领域，涉及一种新型基于适配体的光化学生物传感器，以及这种光化学生物传感器用于检测肠出血性大肠埃希菌。
背景技术：
含有丁二炔结构的类脂在形成高度有序而紧密的排列以后，在254nm的紫外光照射下可以聚合形成蓝色的聚丁二炔结构。这种聚丁二炔结构随着所处环境的温度、溶剂、PH 及其受到的机械应力的改变，其颜色会发生相应的变化。基于这一特殊的光学性质，使得具有聚丁二炔结构的类脂成为制备生物传感器的信号传导元件的理想材料。1993年D. H. Charych等人在kience上发表了一篇关于利用功能化聚丁二炔变色薄膜可以识别流感病毒的文章，引起了人们的普遍关注。他们利用10，12-二十五烷基二炔酸(PCDA)为基脂，唾液酸化的PCDA为受体分子，制备功能化LB膜(Langmuir-Blodgett Films)，这种薄膜呈现蓝色。当唾液酸遇到信息源感冒病毒时，引起聚丁二炔结构的电子态和重量的改变，最终导致信息处理部分(聚丁二炔结构)的颜色由蓝变红，这种现象肉眼明显可见，从而开创了聚丁二炔制备生物传感器的先河。适配体是一类具有高度亲和力和能够高度特异性识别结合目标分子的寡核苷酸序列，其靶分子范围广，从小分子药物和染料，到酶分子、多肽以及蛋白质等复杂的生物大分子。这种人工配体是通过一种新的体外筛选技术-SELEX (指数富集配体系统进化)，从随机单链寡聚核苷酸文库中筛选得到的。由于适配体具有与抗体相同或优于抗体的选择性和亲和力，所以在检测系统中以适配体取代抗体进行蛋白质分子识别成为一种趋势。另外，与抗体相比，适配体还具有几个优点，如热稳定性增加、耐广泛的PH值和盐浓度以及合成、修饰和固化方法简便。更重要的是，适配体可以通过核苷酸变性而失去与靶物质结合的能力， 利用这种特性可以制成可重复使用的生物传感器。目前，人们已经发展各种方法将适配体固化在固体表面并将其应用于蛋白捕获分离和生物传感器的制备。然而，现在利用适配体作为分子识别元件进行制备适配体生物传感器，往往修饰过程过于复杂，检测靶分子方法繁琐，不适合快速检测靶分子的要求。
发明内容
本发明目的是提供修饰过程简单的一种新型基于适配体的光化学生物传感器，以及利用所述生物传感器快速检测肠出血性大肠埃希菌。这种新型光化学生物传感器的特征在于用化学、物理或生物学方法将适配体修饰到聚丁二炔结构分子有序组合体，构建成具有特异性识别肠出血性大肠埃希菌功能的光化学生物传感器。含有丁二炔结构的两亲性单体分子，在水溶液中，其亲水基团在水中十分稳定，而疏水基团极不稳定，整体上来说，是一个能量上不稳定体系。两亲性分子在热力学上要处于低能量，首先是使其疏水链浮到水面上指向空气，减少分子在水中的不相溶性。当水表面上
3铺满两亲性分子而水中分子无法进入表面时，则这些分子在水中抱成一团，使分子的亲水基指向水介质，以求得能量上的稳定。将空气-水界面平铺的两亲性分子通过LB技术，转移至固体支持物上，即制成聚丁二炔结构LB膜(Langmuir-Blodgett Films)。而对水中的两亲分子进行超声处理，即可制备成囊泡结构。聚丁二炔LB膜和聚丁二炔囊泡具有相似的结构，只是两种不同形式的分子有序组合体。在实际应用中，由于聚丁二炔囊泡具有空间三维结构，其表面的识别元件更容易与靶分子结合，灵敏度更高。我们可通过合适的功能键将聚丁二炔囊泡修饰到固体支持物上，即制成固化囊泡。本发明所述的化学方法是碳化二胺法，即通过N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐(EDC)的作用活化PCDA游离的羧基形成活泼酯。活泼酯与适配体5’端氨基反应形成酰胺键，从而将肠出血性大肠埃希菌适配体修饰到聚丁二炔结构分子有序组合体，制备成具有特异性识别肠出血性大肠埃希菌功能的光化学生物传感器。本发明是一种基于适配体的光化学生物传感器，包括分子识别元件和信号传导装置，用于分子识别的适配体其修饰在聚丁二炔结构分子有序组合体表面上。上述的分子识别元件为能特异性识别结合肠出血性大肠埃希菌的适配体。上述的信号传导装置是聚丁二炔结构分子有序组合体。上述的将适配体修饰在聚丁二炔结构分子有序组合体表面的方式为共价功能键修饰本发明提供了基于适配体的光化学生物传感器检测靶物质的方法，包括①制备聚丁二炔结构分子有序组合体，其中将用于检测的适配体修饰在上述的聚丁二炔纳米囊泡的表面，以提供上述适配体能够识别结合肠出血性大肠埃希菌的结构；②在修饰适配体的聚丁二炔结构分子有序组合体，暴露在肠出血性大肠埃希菌环境的情况下，测量聚丁二炔纳米囊泡的紫外-可见光吸光度和荧光强度的变化；③基于吸光度和荧光强度的变化检测/鉴定肠出血性大肠埃希菌。本实用新型与以往组装的生物识别元件相比，修饰过程简单，可以进行快速检测， 因此本实用新型基于适配体的光化学生物传感器以及用其检测肠出血性大肠埃希菌，可以广泛应用于生物化学研究、生物反恐、流行病普查以及临床检验诊断等方面。
图1是碳化二胺法介导氨基化适配体修饰到聚丁二炔囊泡表面的示意图；图2是修饰适配体的聚丁二炔囊泡的特征吸收光谱；图3是适配体囊泡比色检测肠出血性大肠埃希菌示意图；图4表示加入肠出血性大肠埃希菌后囊泡变化CR%值随时间变化曲线；图5表示不同浓度肠出血性大肠埃希菌引起聚丁二炔囊泡的CR%值变化及检测线性范围；符号说明X为适配体修饰后的聚丁二炔囊泡的特征吸收光谱；Y为未用适配体进行修饰的聚丁二炔囊泡的特征吸收光谱；Z为微孔板空白对照。
具体实施例方式下面结合具体实施例和附图对本实用新型作进一步说明，但所举实施例不作为对本发明的限定。实施例11.纳米生物传感器的制备(1)肠出血性大肠埃希菌特异性适配体的合成与氨基修饰5’端氨基化修饰的肠出血性大肠埃希菌特异性适配体由柏业贸易(上海)有限公司负责合成并完成氨基修饰。利用Maldi-Tof质谱分析进行质量控制。适配体5，Amine-C6-ATCAAATGTGCAGATATCAAGACGATTTGTACAAGAT上述适配体用灭菌水溶解，分装，_20°C保存。使用之前，95°C变性5min。(2)肠出血性大肠埃希菌光化学生物传感器的制备-聚丁二炔脂质纳米囊泡的制备与修饰将PCDA溶解于氯仿，配成lmmol/L终浓度。取适量该溶液在氮气氛下，真空干燥成薄脂质膜，加入去离子水使溶液终浓度至lmmol/L，使得类脂的总浓度为lmmol/L。避光， 72°C超声乳化15min，直至溶液透明或半透明。将获得的溶液置于4°C过夜，以便于囊泡完全闭合。取出闭合囊泡溶液，待其恢复到室温，用手持式紫外灯OMnm)照射30min，直至出现深蓝色，得到聚丁二炔囊泡，制备好的囊泡置于4°C保存。以上过程在紫外照射聚合前，均需在避光条件下进行。取100 μ L的lmmol/L PCDA囊泡，向其中分别加入4mmol/L NHS水溶液50 μ L禾口 4mmol/L EDC 'HCl水溶液50 μ L，反应2h后，加入IOnmol适配体水溶液，补充双蒸水至lmL。 继续室温反应他。反应结束后，在D-Tube Dialyzer (merck)中充分透析去除未反应的适配体等。2.纳米生物传感器快速检测肠出血性大肠埃希菌(1)细菌的培养与计数在LB液体培养基于37°C条件下培养16 18h，然后用灭菌水将菌体溶液依次稀释成8个浓度梯度，分别装入8个小瓶，从101到108，每瓶1ml，分别标号1 8。细胞计数使用传统的平板计数方法，在分装好的含有活菌的溶液中取50 μ 1平铺在普通琼脂的表面，于37°C培养24h后计数。培养物计数完成后与装有活菌的小瓶在121°C下30min灭活， 于4°C冰箱保存。(2)肠出血性大肠埃希菌光化学生物传感器比色检测肠出血性大肠埃希菌为了定量分析聚丁二炔纳米囊泡的蓝色-红色的颜色变化程度，我们定义比色响应(colorimetric response,简写 CR) CR% = [(PBO-PBf) /ΡΒ0] X 100%其中，PB = Ablue/(Ablue+Ared)，A是蓝色聚丁二炔组份在640nm左右的吸收强度或红色聚丁二炔组份在540nm左右的吸收强度，PBO是加入融合蛋白质之前聚丁二炔对红波吸收所占的百分数，PBf是加入融合蛋白质之后聚丁二炔红波吸收所占的百分数。CR% 值越大，表明囊泡溶液的颜色越红。将上述制备的修饰适配体的聚丁二炔脂质纳米囊泡用移液器分装于96孔 Microtiter-UV微孔板中，每孔各100 μ L。将肠出血性大肠埃希菌菌液稀释后配成一系列的菌液浓度(分别调至 108CFU/ml、107CFU/ml、106CFU/ml、105CFU/ml、104CFU/ml、103CFU/ml)，加入上述含有囊泡的孔中充分混勻后，在37°C或室温孵育30min。采用Varioskan Flash多功能酶标仪(Thermo Scientific)进行400 700nm的全波长扫描，测试孵育前后的可见吸收光谱，同时检测孵育前后的A640和AM0，并计算CR%值，绘制曲线。(3)实验结果碳化二胺法介导氨基化适配体修饰到聚丁二炔囊泡表面的示意图见图1。修饰适配体的聚丁二炔囊泡的特征吸收光谱见图2，图中X曲线为适配体修饰后的聚丁二炔囊泡的特征吸收光谱，Y曲线为未用适配体进行修饰的聚丁二炔囊泡的特征吸收光谱，Z曲线为空白对照的吸收光谱。从结果中可以看出，修饰适配体的聚丁二炔囊泡在^Onm处出现了吸收峰，而这个吸收峰正是核苷酸的特征峰，同时我们可以看到未用适配体修饰的聚丁二炔囊泡在相应位置却没有吸收峰，可以认为适配体已经成功修饰在聚丁二炔囊泡表面。适配体囊泡比色检测肠出血性大肠埃希菌示意图见图3。在微量离心管中比色检测肠出血性大肠埃希菌，加入肠出血性大肠埃希菌会引起聚丁二炔囊泡的变色反应，图4是随着加入肠出血性大肠埃希菌时间的延长，蓝色-红色变色增加，CR%值逐渐增加。且随着加入的肠出血性大肠埃希菌浓度增加，蓝色-红色变色增加，聚丁二炔囊泡的特征吸收光谱亦随着肠出血性大肠埃希菌的加入，最大吸收峰从640nm 处蓝移至540nm处，且加入的肠出血性大肠埃希菌的量越大，640nm处的吸光度值下降越多，而MOnm处吸光度值上升越大。图5用CR%定量地反映了颜色变化的程度，随着肠出血性大肠埃希菌浓度的增加，CR%值逐渐增加，在IO4 108CFU/mL范围内，CR%值与菌液浓度呈良好的线性关系，线性方程为Y = 10. 89X-45. 05，相关系数=0. 9991，检测限为IO4CFU/ mL (S/N = 3)。
权利要求
1.一种基于适配体的光化学生物传感器，包括分子识别元件和信号传导装置，其特征在于用于分子识别的适配体修饰在聚丁二炔纳米囊泡表面上。
2.根据权利要求1所述的基于适配体的光化学生物传感器，其特征在于所述的分子识别元件为能特异性识别结合肠出血性大肠埃希菌的适配体。
3.根据权利要求1所述的基于适配体的光化学生物传感器，其特征在于所述的信号传导装置是聚丁二炔结构分子有序组合体。
4.根据权利要求3的一种基于适配体的光化学生物传感器，其中所述的聚丁二炔结构分子有序组合体为囊泡。
5.根据权利要求1所述的基于适配体的光化学生物传感器，其特征在于将适配体修饰在聚丁二炔结构分子有序组合体表面的方式为共价功能键修饰。
6.一种根据权利要求1 4任一项所述的基于适配体的光化学生物传感器检测靶物质，包括①制备聚丁二炔结构分子有序组合体，其中将用于检测的肠出血性大肠埃希菌适配体修饰在所述的聚丁二炔结构分子有序组合体的表面，以提供肠出血性大肠埃希菌适配体序列；②在修饰适配体的聚丁二炔结构分子有序组合体，暴露在肠出血性大肠埃希菌环境的情况下，测量聚丁二炔纳米囊泡的紫外-可见光吸光度和荧光强度的变化；③基于吸光度和荧光强度的变化检测/鉴定肠出血性大肠埃希菌。
全文摘要
本发明涉及一种新型基于适配体的光化学生物传感器用于检测肠出血性大肠埃希菌，具体涉及一种利用寡核苷酸适配体识别靶分子-肠出血性大肠埃希菌脂多糖的聚丁二炔结构有序分子组合体光化学生物传感器，以及利用上述聚丁二炔纳米囊泡光化学生物传感器检测肠出血性大肠埃希菌。在本发明所述的光化学生物传感器中，所述特异性结合肠出血性大肠埃希菌的适配体结合在聚丁二炔结构有序分子组合体的表面，以便于当所述肠出血性大肠埃希菌暴露于相应适配体时，通过变化的聚丁二炔纳米囊泡的紫外-可见光吸光度或者荧光强度来检测/鉴定特定肠出血性大肠埃希菌。
文档编号C12Q1/68GK102175666SQ201110028770
公开日2011年9月7日 申请日期2011年1月21日 优先权日2011年1月21日
发明者吕建新, 王冠冠, 王安娜, 田际云, 邱盈坡, 靳艺歆, 黄林瑶 申请人:温州医学院