专利名称：直立密穗基因提高氮肥利用效率的新应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及已知基因的新功能和应用。具体地，本发明涉及直立密穗基因cbpl在提高农作物氮肥利用效率、提高农作物光合作用效率、以及控制株高耐倒伏方面的新功能和应用。更具体地，本发明涉及的直立密穗基因d印1来源于水稻、小麦、大麦、玉米、高粱等农作物。
背景技术：
氮是植物生长所必需的大量营养元素之一，占植物干重的1. 5% -2%以及植物总蛋白的16% (Frink et al. 1999)，是氨基酸、蛋白质、核酸、叶绿素、激素等的组成成分。氮肥是农业生产中需要量最大的化肥品种，它对提高作物产量，改善农产品的质量有重要作用。然而，一般来讲，只有少量氮肥被植物所利用(Frink et al. 1999 ；Socolow 1999)，大部分的氮肥则被释放到大气或流失到水体中，对环境造成了越来越严重的影响，如何提高农作物氮肥利用效率，已成为农业生产面临的一个亟待解决的严峻问题。自上世纪50-60年代，随着人口的不断增加，人们对农作物产量的需求不断提高， 全球氮肥的施用量也随之急剧增加了近10倍(UNEP 1999)。其后果是，过去几十年所培育的主要农作物高产品种大多数都是氮和其他营养元素高依赖性的。例如，著名的“绿色革命”基因sdl 该基因编码赤霉素合成途径中的一个关键酶，在60年代到70年代曾创下了亚洲水稻产量的最高记录。sdl最明显的特征是植株半矮化，增强了抗倒伏性，同时也表现了对氮肥较高的依赖性。这意味着，应用sdl基因追求水稻高产是以不断增施氮肥、增加水稻生产投入为条件，同时加重了环境污染。我国高产粳稻品种育种中一直以来没用应用sdl。 这些品种对外施氮肥不敏感，也表现较高的氮肥利用效率，例如东北高产品种千重浪2号。目前，有关植物中氮的吸收和利用途径的研究进展较快，例如，氮的转运蛋白 (Crawford and Glass 1998 ；Forde 2000 ；Howitt and Udvardi 2000 ；Glass et al.2001 ； Williams and Miller 2001)，以及负责将氮转变为氨基酸和其他化合物的酶类的研究 (Campbell 1988 ；Lam et al. 1996 ；Hirel and Lea2001)。近些年来，随着植物基因组学和分子遗传学的迅速发展，利用数量性状位点(Quantitative trait locus, (QTL)分析这一有力的工具鉴定了多个氮代谢调控相关的遗传因子。例如，在玉米中检测到的在低氮胁迫和正常氮条件下的一些QTL位点(Agrama et al. 1999)；在水稻中，检测到了几个参与氮同化的酶(Yamaya et al. 2002 ；Obara et al. 2001，2004)、不同氮水平下植物剑叶中蛋白及氮含量、植物株高以及幼苗期耐低氮胁迫等相关的QTL位点(Fang and Wu 2001 ；Lian et al,2005)等。并且，在水稻和玉米中已获得了几个氮高效利用相关的候选基因(Gallais and Hirel，2004 ；Martin et al.，2006 ；Obara et al. 2001 ；Tabuchi et al. ,2005)。但是， 在不同的施氮条件下，氮吸收和利用调控的遗传基础还不得而知。水稻是重要的粮食作物，为世界上大约一半的人口提供粮食。在农业生产中，大量施用氮肥一直是水稻高产的重要措施之一。由于土壤蓄水系统中的挥发和反硝化作用， 与其他农作物相比，水稻的氮肥利用率比较低。我国的氮肥消费量占世界氮肥总消费量的30%,水稻生产所消耗的氮肥占世界水稻氮肥总消耗量的37%。然而，我国水稻的氮利用效率远远低于世界平均水平，大部分的氮分别以队、N2O等形式排入环境而损失，造成大气污染及江河湖泊的富营养化。然而，氮肥的使用量逐年增加并未带来水稻产量的大幅提高，经济效益和生态效益反而呈下降趋势。那么，如何提高氮肥的利用效率来提高水稻的产量，实现我国水稻生产“少投入、多产出”可持续的发展模式？ 一个可行的途径是，利用遗传学和分子生物学方法从氮高效的水稻资源品种中分离并克隆氮高效相关基因，研究其提高氮利用效率的分子机制，通过改变这些关键基因的表达(或功能)进而使农作物在较低养分水平下保持较高的产量，是降低水稻生产投入成本、减少水稻生产对环境造成的污染、稳定提高水稻产量的有效手段。本发明人的研究将为包括水稻在内的主要农作物氮高效利用和高产分子育种提供基因资源。
发明内容
本发明涉及已知基因的新功能和应用。具体地，本发明涉及直立密穗基因d印1在提高农作物(例如，水稻、小麦、大麦、玉米、高粱等)氮肥利用效率、提高光合作用效率和控制株高耐倒伏方面的新功能和应用。更具体地，本发明涉及的直立密穗基因cbpl来源于水稻、小麦、大麦、玉米、高粱等农作物。所述水稻直立密穗基因cbpl由本发明人最先发现并已申请专利，可以参见本发明人于2008年6月5日提交的发明专利申请No. 200810111529. 5，发明名称为“直立密穗基因及其应用”，和于2009年6月5日提交的PCT/US09/46465，发明名称为“Dense and Erect Panicle Gene and Uses Thereof，，。本发明在水稻氮高效利用的研究工作中发现了一个水稻氮高效利用和耐高肥抗倒伏的基因，将其命名为qNGR9，经进一步鉴定其为已知的直立密穗基因d印1 (SEQ ID NO 1，其编码的d印1蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO :2)，位于水稻第9号染色体上，编码一个包含TNFR/NGFR结构域的未知功能蛋白。换言之，本发明人发现了该水稻直立密穗基因 cbpl基因具有提高氮肥利用效率、增强光合作用效率和控制株高抗倒伏方面的新功能，在此基础上，本发明人完成了本发明。水稻直立密穗基因Cbpl对应的野生型DEPl基因的CDNA序列参见SEQ ID NO :3， 该基因编码的野生型DEPl蛋白的氨基酸序列参见SEQ IDNO :4。本发明人在前期研究中发现有些东北高产粳稻品种，如千重浪2号是氮肥高效利用的品种，而且株高对外施氮肥不敏感；籼稻品种南京6号是株高和产量对外施氮肥很敏感的品种。本发明人将千重浪2号与南京6号杂交并自交六代获得重组自交系(RIL)， 通过QTL分析，在水稻第9号染色体SSR标记RM3700和RM7048之间检测到了一个氮高效利用相关的主效QTL，将其命名为qNGR9(a QTL for nitrogen growth responses inchromosome9)。利用图位克隆的方法，将候选NGR9基因精细定位在141Λ的区间内(见图 4)。通过测序比较分析，确定了 NGR9候选基因。该基因为已知的水稻高产基因cbpl (Dense and Erect Panicle 1)。通过对近等基因系NIL-NGR9和NIL_ngr9的比较分析研究，证明了 ngr9(亦即cbpl)基因在提高水稻氮肥利用效率、增强光合作用、控制株高和提高抗倒伏能力方面发挥了重要作用。
同时，本发明人从小麦、大麦、玉米、高粱中分别克隆到了同源的DEPl基因的cDNA 序列，并通过转基因研究证明了它们具有与水稻NGR9/DEP1类似的控制株高和穗型的功能。另外，本发明人对NGR9/DEP1蛋白的亚细胞定位进行了研究，发现NGR9-GFP和ngr9_GFP 融合蛋白即能定位在细胞核中也能定位在细胞膜上。本发明人的研究将为包括水稻在内的主要农作物的氮肥高效利用提高、增强光合作用效率、半矮化高产育种提供新基因资源。因此，本发明提供下述第1方面.直立密穗基因的应用，其用于提高农作物的氮肥利用效率，提高光合作用效率，降低农作物的株高并增强抗倒伏性，以及改良农作物的穗型和提高产量。第2方面.根据第1方面所述的应用，其中所述直立密穗基因来源于水稻、小麦、 大麦、玉米或高粱。第3方面.根据第1方面所述的应用，其中所述直立密穗基因的核苷酸序列包括(I)SEQ ID NO :1,5,7,9,11 和 13 ；(2)与(1)中的任一种核苷酸序列具有至少70%、优选至少80%、更优选至少 85 %、更优选至少90 %、尤其是至少95 %或98 %同一性的核苷酸序列；(3)与(1)中的任一种核苷酸序列编码相同氨基酸序列的蛋白质、但因遗传密码的简并性而在核苷酸序列上不同的核苷酸序列；(4)编码如下氨基酸序列之一的核苷酸序列=SEQ ID NO =2,6,8,10，12和14中任何一个所示的氨基酸序列，或者，由于一或多个(例如1-25个、1-20个，1-15个，1-10个， 1-5个，1-3个)氨基酸残基的替代、缺失和/或插入而与SEQ ID NO :2，6，8，10，12和14中任何一个所示的氨基酸序列不同的氨基酸序列，或者，与SEQ ID NO :2，6，8，10，12和14 中任何一个所示的氨基酸序列具有至少70%、优选至少80%、更优选至少90%、尤其是至少95%或98%同一性的氨基酸序列；(5) (1)-(4)中任何一个的核苷酸序列的活性片段；或(6)与(1)-(4)中任何一个的核苷酸序列互补的核苷酸序列。第4方面.根据第1方面所述的应用，其中所述农作物包括水稻、小麦、大麦、玉米或高粱。
从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中图1 图IA显示千重浪2号是氮肥高效利用的东北高产粳稻品种，其株高和穗粒数对外施氮肥不敏感；图IB显示籼稻品种南京6号其株高和穗粒数对外施氮肥很敏感的品种。图2 图2A显示一个氮利用效率和植物株高控制相关的主效QTL :qNGR9的克隆的技术路线；图2B显示氮利用和植物株高相关的主效QTL :qNGR9的QTL分析。图3 显示近基因系NIL_ngr9水稻植株表现半矮化。图4 本发明人利用图位克隆方法分离了 qNGR9，将qNGR9基因精细定位在141Λ的区间内。图5 水稻重组自交系(RIL)中RIL22的株高对氮肥比较敏感。图5A显示在土壤中施加不同量的氮肥，RIL04的株高对外施氮肥不敏感；图5B显示随着土壤中氮含量的升高，RIL22株高、分蘖数及穗粒数明显增高。图6 水稻NIL_ngr9幼苗的生长对氮肥不敏感。图6A显示，在不同氮浓度下 NIL-ngr9与NIL-NGR9的幼苗生长情况。图6B显示不同氮浓度下NIL_ngr9与NIL-NGR9的幼苗高度的统计结果。图7 :ngr9能够增加水稻茎杆细胞壁的厚度，增大茎杆机械强度和耐肥抗倒伏特性。a和c图，分别是NIL-ngr9和NIL-NGR9的茎杆倒一节横切扫描电镜实验；b和d图分别为a和c图的放大，矩形框所示厚壁细胞(sclerenchyma cells), Scale bar,100ym ;e 图显示茎杆抗折断力大小的测定，表明NIL-ngr9比NIL-NGR9的抗折断力更大；f图显示在田间施用不同浓度的氮肥(0,50,100，150，200，250/公顷)后，NIL_ngr9与NIL-NGR9生长情况的比较。图8 :ngr9能够抑制水稻茎杆细胞的分裂，促进细胞分化，导致水稻茎杆节间长度缩短，造成植株半矮化。NIL-ngr9与NIL-NGR9茎秆每节长度的比较以及茎杆倒一节伸长区纵切面的组织切片观察。NIL-ngr9每茎节长度均变短。在纵轴方向上单位面积内NIL-ngr9 细胞数目明显减少，细胞明显增大。kale bar，25 μ m。图9 :NGR9为已知基因DEP1。它编码一个包含TNFR/NGFR结构域的未知功能蛋白。 NGR9/DEP1-GFP融合蛋白定位在细胞质、细胞膜和细胞核。图A显示ngr9/d印1是在NGR9/ DEPlmRNA的ATG下游586处形成了一个终止密码子TAG，使DEPl蛋白翻译提前终止。因此， ngr9/d印1缺失了 NGR9/DEPImRNA的ATG下游的625个碱基。图B显示NGR9/DEP1的蛋白结构示意图。图C显示农杆菌侵染烟草细胞检测NGR9/DEP1-GFP融合蛋白的亚细胞定位情况。图10 过量表达ngr9/d印1转基因水稻表现半矮化。a图显示营养生长时期(生长80天)过量表达ngr9/d印1的转基因日本晴与非转基因对照植物株高的比较。b图显示生殖生长时期(生长110天)过量表达ngr9/d印1的转基因日本晴与对照的植物株高的比较。图11 通过同源克隆分别从小麦和大麦中分离了 NGR9/DEP1的同源基因，TaDEPl 和HvDEPl，将其在水稻中过量表达也能够降低植株株高，增加穗粒数和产量，表明它们具有与水稻ngr9/d印1相类似的功能。图A显示禾本科几个主要作物中DEPl蛋白的相似性比较。水稻的DEPl和cbp 1，小麦的TaDEP 1，大麦HvDEPl，玉米ZmDEPl及高粱釙DEPl。图B 将PActiiKTaDEPl转入日本晴中，转基因水稻表现半矮化和穗粒数增加的表型。图12: :ngr9基因能够提高水稻产量和氮肥利用效率。图A所示NIL_ngr9水稻种植在不同施氮水平下，植株高度变化不明显。图B所示不同施氮处理对水稻叶片生长的影响。高氮处理能促进NIL-SDl水稻叶片的生长，但NIL-sdl水稻叶片生长对高氮处理表现为部分敏感性；高氮处理能促进NIL-NGR9水稻叶片的生长，而氮肥处理对NIL-ngr9水稻叶片生长影响不明显。图C所示在不同施氮条件下，ngr9/d印1基因均能提高水稻产量。达到相同的水稻产量，NIL-ngr9所需施氮肥量明显少于NIL-NGR9，说明ngr9能提高植物的氮利用效率，是氮高效基因。实验是在2010年海南水稻种植基地自然栽培条件下，对288株植物、三次重复进行数据统计，计算平均值。植物的种植密度为20Cmx20Cm。图13 :ngr9/depl提高了植物的净光合效率。近等基因系NIL_d印1和NIL-DEP1在抽穗时期，上午 09 00-11:00，设定不同的光强(250，500，750，1000，1500，2000，2500 μ mol photous m-kec-1)，田间分别测定在相应光强下的CO2的净吸收量(μ mol m-2sec-l) 0测定结果表明，在不同的光强下，NIL-cbpl的光合效率明显高于NIL-DEPl。图 14 (A) depl 与 DEPl 的 cDNA 序列比较，DEPIcDNA 序列长 1281bp,而 depl 只有 5，端的588bp，缺失了 3，端的696bp ；和(B) depl与DEPl蛋白的氨基酸序列比较，DEPl蛋白含有4 个氨基酸，而cbpl蛋白只有N端的195个氨基酸，缺失了 C端的231个氨基酸。图15 显示分别转入pUbi2300空载体对照及pUbi RNAi-TaDEPl的转基因小麦 (济麦21，JM21)穗型的比较。转基因的济麦21中TaDEPl基因的表达量下降后，穗型发生明显改变，表现出穗长明显变长，着粒密度变稀等表型。图16 显示转过量表达cbpl基因的玉米在温室中的生长表型。转基因玉米的株高明显降低、叶片颜色变为深绿色、叶片夹角变小。图17 显示不同高粱品种中的SbDEPl蛋白存在的氨基酸序列上的自然变异情况， ①-④示自然变异的位点。
具体实施例方式以下通过实施例来进一步阐明本发明。但是应该理解，所述实施例只是举例说明的目的，并不意欲限制本发明的范围和精神。实施例1 水稻氮高效利用基因的发现和分离本发明人利用两组不同氮处理(低氮处理和正常氮肥对照组)对2000余份水稻品种资源材料进行大田筛选，每小区种植4行，每行6株。分别在苗期、最高分蘖期、抽穗期等不同时期考察株高、分蘖数、穗数、叶绿素含量、光合速率等形态指标，以及在成熟期考察各农艺性状和籽粒产量，获得了一批氮肥高效利用的水稻材料，如千重浪2号。千重浪2号也是东北高产粳稻品种。研究表明，千重浪2号的株高对外施氮肥不敏感，低氮和高氮不同处理后其株高变化不明显。另外发现，籼稻品种南京6号(NJ6)材料的株高和产量对外施氮肥很敏感。在低氮条件下，南京6号株高较矮、分蘖数偏少和穗粒数减少；而在高氮处理下，南京6号株高明显增高、分蘖数和穗粒数显著增多。将千重浪2号和籼稻南京6号分别在不同施氮量(0公斤/公顷，60公斤/公顷， 200公斤/公顷，300公斤/公顷)下，于灌浆期(生长110天)取具代表性的单株进行拍照。二者表现不同的氮敏感性。为了进一步挖掘水稻氮高效利用的遗传基础及关键调控基因，本发明人利用千重浪2号与南京6号(NJ 6)杂交后再自交6代构建了 208份重组自交系(RIL)。对208份水稻重组自交系材料设置4个不同氮处理，进行苗期和大田鉴定发现，编号为RIL04的重组自交系在不同的施氮量下，植物株高和分蘖数等农艺性状没有明显差异，证明了重组自交系 RIL04是一个氮不敏感的材料。而编号为RIL22重组自交系材料随着施氮量增加其株高、分蘖数和产量等农艺性状均明显提高，表明重组自交系RIL22是一个氮敏感的材料。(海南陵水，正常田间管理，种植密度为18CMX18CM，每个株系种植48株(图1)。为了进一步认识氮肥利用效率控制的遗传基础，本发明利用千重浪2号与南京6 号(NJ 6)杂交后自交6代构建了重组自交系(RIL)和回交3代后构建了近等基因系(图 2A)，通过QTL分析发现，在第9号染色体上的SSR标记RM3700和RM7048之间检测一个与氮高效利用和植物株高相关的主效QTL，本发明人将其命名为qNGR9(图2B)。在此基础上， 本发明人利用RIL04材料与南京6号杂交所构建的BC2F2和BC3F2群体，通过QTL-图位克隆方法将ngr9基因精细定位在141Λ的区间内(见图4)。在下述实施例中，通过测序比较分析，确定了 ngr9候选基因实际上为已知的直立密穗基因cbpl (Dense and Erect Panicle 1)，该基因位于水稻第9号染色体上，编码一个包含TNFR/NGFR结构域的未知功能蛋白。另外，本发明人经进一步的序列分析发现，氮高效利用基因ngr9的核苷酸序列与直立密穗基因cbpl的核苷酸序列完全相同。cbpl/DEPlcDNA序列比较结果显示，DEPlcDNA 序列含有U81bp，而d印1只有5，端的58^ρ，缺失了 3，端的6%bp (图14A) ；depl/DEPl 蛋白的序列比较结果显示，DEPl蛋白含有似6个氨基酸，而cbpl蛋白只有N端的195个氨基酸，缺失了 C端的231个氨基酸(图14B)。实施例2 水稻氮高效利用基因的功能验证本领域技术人员应该理解，除非另外指明，本发明所用的试剂均为市售分析纯级别的试剂，可以容易地从各试剂公司购得。参见图5，将重组自交系(RIL)中含有ngr9/d印1的RIL04和含有NGR9/DEP1的 RIL22分别在不同施氮量(0公斤/公顷，60公斤/公顷，200公斤/公顷，300公斤/公顷) 下，于灌浆期(生长110天)取具代表性的单株进行拍照。二者表现不同的氮响应。RIL04 在不同的施氮量下株高、分蘖数和穗粒数等农艺性状没有明显差别，表现为氮不敏感性。 RIL22在不同的施氮量下株高、分蘖数和穗粒数等农艺性状存在明显差别，随着施氮量的增加植物生长加快、分蘖数和穗粒数增加，表现为氮敏感性。(海南陵水，正常田间管理，种植密度为18CMX 18CM，每个株系种植48株)。参见图6，将NIL-ngr9和NIL-NGR9于37°C催芽后，放入水中培养4天，再放入 1/2 营养液(Na2SO4 · IOH20,88. 022mg/L ；KH2PO4, 24. 8mg/L ；K2SO4, 31. 859mg/L ；MgSO4. 7H20, 134. 82mg/L ；CaCl2. 2H20,53. 702mg/L ；Fe-EDTA,7. 346mg/L ；Na2Si03H20, 465. 139mg/ L ；NH4NO3, 160mg/L ；H2BO3, 2. 86ug/L ；CuSO4 · 5H20, 0. 08ug/L ；ZnSO4 · 7H20, 0. 22ug/L ； MnCl2 · 4H20,1. 81ug/L ；H2MoO4 · H20,0. 09ug/L ；用 MES 调 pH 至 5. 6)中培养 3 天，再更换营养液继续培养3天，然后进行不同氮浓度处理(0，l，2，4，6mM)，每个材料每个氮浓度各取长势一致的幼苗9株，7天更换一次培养液，每两天调一次pH值(调pH为5. 6)，培养9天后拍照(图6A)，并测量统计幼苗的苗高(图6B)。(所用的培养条件为1 光/9h暗，恒温 22°C，光强 65 μ M HT2S力参见图7，剥取倒一节茎秆，用锋利的刀片横切成2_3mm的薄片。以上材料均放在戊二醛固定液里(浓度2.5%，用0. lmol/L磷酸盐缓冲液pH 7. 4配制，其中戊二醛购自北京化工厂)抽取真空30分钟，4°C下固定M小时以上，30%、50%、70%、80%、90%、100% 乙醇依次梯度脱水15-30分钟。100%乙酸异戊酯(购自北京化工厂)，置换30分钟。可在4°C冰箱过夜。置换好的材料放在HCP-2型临界点干燥仪(日本Hitachi公司)上通过液态⑶2临界点干燥法干燥，干燥后的材料用导电胶(日本Hitachi公司)固定在铜台上， 在日立E-IOlOion sputter上喷金。用日立S-M60型扫描电子显微镜对样品进行电镜观察，图象存储成数码文件，供分析用。kale bar，100ym(图a，b，c, d)。抗折断力的大小测定用RX数显推拉计测定NIL-NGR9和NIL-ngr9材料各10个主茎的抗折断力，取平均值(图e)。将近等基因系NIL-NGR9和NIL_ngr9材料，种植在田间施用不同浓度的氮肥(0， 50，100，150，200，250/公顷)的小区(长=3. 5M，宽=0. 9M)中，种植密度为 18CMX18CM, 观察到NIL-ngr9表现明显的耐倒伏和耐高肥的特性(图f)。参见图8，分别测量NIL-ngr9与NIL-NGR9的各茎节长度，表明NIL_ngr9茎杆每节均缩短。倒一节茎中间部位纵切树脂切片观察。方法步骤为1、灌浆期取材料于FAA (甲醛乙酸70%乙醇=1:1: 18 (V/V)固定液，购自北京化工厂)中固定；2、树脂切片材料制作使用试剂盒LEICA Historesin embedding kit (Heidelberg, Germany)，操作步骤参考此试剂盒内的说明；1)梯度脱水40%，60%，80%，95%，95%乙醇，各30111士11 ；2)渗透95%乙醇树脂(V/V) = 2 1中(所述树脂由上述试剂盒中提供)，真空抽气Ihr后，放于4°过夜；然后95%乙醇树脂(V/V) =1 2中，至少!3hr ；然后放于 100%树脂中，4°过夜；换新的100%树脂渗透至少Ihr ；3、包埋用16 1的100 %树脂(Historesin，试剂盒中提供)和硬化剂 (Hardener,试剂盒中提供)包埋，用 Parafilm 封口 膜(Pechiney PlasticParkaging, Chicago, USA)封盖；4、待包埋剂充分凝固后(1-2天)，用石蜡切片机(LEICA，RM2265)进行切片， 8-10um 厚。5、TB0(甲苯胺兰=T0Iuidine Blue 0)染色几分钟(具体是多少分钟？)后，显微镜下观察(LEICA，DM500B)。现在参见图9，公共的数据库 KOME(http://cdna01. dna. affrc. go. jp/cDNA/)、 TIGR(http://www. tigr. org/)及 RAP-DB (http://rapdb. dna. affrc. go. jp/)中搜索 DEPl 基因(即水稻的DEPl基因)的注释，推测该基因是一未知功能的基因，在结构上具有5个外显子及4个内含子，编码区长度为1281bp (SEQ ID NO 1)，编码似6个氨基酸的多肽(SEQ ID NO 2) ,DEPl具有TNFR/NGFR结构域。DEPlmRNA的ATG下游586处形成了一个终止密码子TAG，使DEPl蛋白翻译提前终止，突变的cbpl蛋白的氨基酸序列只有196个(图9A和 9B)。农杆菌侵染烟草细胞瞬时表达后观察NGR9/DEP1-GFP融合蛋白的亚细胞定位。方法为1)将活化过夜的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) EHA105 (购自 Biovector Science Lab公司，中国)转接到50ml液体LB (含有50ug/ml卡那霉素和25ug/ ml利福平)中，28 °C，220转摇菌过夜；2)将菌液于室温下5000g离心沉淀菌体，并用注射缓冲液(IOmMMgCl2, IOmM MES-K0H, pH 5. 7，150-200 μ M Acetosyringone (乙酰丁香酮，购自Sigma)的注射缓冲液
重悬菌体；3)用注射缓冲液稀释菌液，使菌液0D600分别为0. 5、1、1. 5 ；4)室温放置2-4小时；5)将上述菌液混合，用l_2ml的注射器将菌液注射到烟草叶片的下表面，2_5天后取叶片在荧光显微镜下观察。
荧光显微镜观察结果表明，NGR9-GFP融合蛋白既有细胞膜定位，也存在细胞核定位。参见图10，按常规分子生物学和遗传学操作方法构建pACtin:ngr9载体，农杆菌介导法转化日本晴，过量表达ngr9的日本晴植物表现半矮化。对照是日本晴。a图显示营养生长时期(生长80天)过量表达ngr9的转基因日本晴与对照植物株高的比较。b图显示生殖生长时期(生长110天)过量表达ngr9的转基因日本晴与对照植物株高的比较。结果说明，过量表达ngr9能够明显降低水稻的株高。参见图12C，实验是在2010年海南水稻种植基地自然栽培条件下，对288株植物、 三次重复进行10个不同施氮量(0-300公斤/公顷氮肥)的水稻产量统计，计算平均值。植物的种植密度为20Cmx20Cm。结果表明，达到相同的水稻产量，NIL_ngr9所需氮肥明显少于 NIL-NGR9，这说明ngr9基因能提高植物的氮利用效率，是一种氮高效基因。参见图13，插秧70天后，材料处于约二次枝梗期，上午10:00-12:00测量 NIL-ngr9 和 NIL-NGR9 的光合效率。使用光合仪 Ll-6400 (LI-COMnc.，Lincolin，NE. USA)， 每个材料每次测定时同时夹取两个不同单株的倒二叶中间的部位，两次重复，设定不同的光强(250, 500, 750,1000,1500,1800, 2000, 2500, 2800 μ mol photous HT2SecT1)，分别测定在相应光强下的(X)2的净吸收量(μ mol m^sec"1)。结果说明，NIL_ngr9较NIL-NGR9表现更强的光合效率。实施例3 同源基因克隆参见图11，以水稻cbpl的序列为探针，在NCBI网站(www.ncbi.nih.nlm.gov) 提供的数据库里，通过 Basic logical alignmengt search tool (BLAST)比对，获得了小麦、大麦、玉米及高粱的同源的cDNA序列，分别为小麦TaDEPl (SEQ ID N0:5)、大麦 HvDEPl (SEQ ID NO 7)、玉米 ZmDEPl-I (SEQ ID NO :9)、玉米 ZmDEPl-2 (SEQ ID NO :11)和高粱SbDEPl (SEQ ID NO :13)，它们编码的蛋白的同源性分别为TaDEPl (SEQ ID NO 6) 同水稻DEPl (SEQ ID NO 4)相似性为49. 42%,同水稻d印1 (SEQ ID NO 2)的相似性为 44. 41% ；HvDEPl (SEQID NO 8)同水稻DEPl的相似性为50. 00%，同水稻d印1的相似性为 43. 73% ；SbDEPl (SEQ ID NO 14)同水稻DEPl相似性为51. 99%，同水稻d印1的相似性为 33. 83%, ZmDEPl-I (SEQ ID NO 10)同水稻DEPl的相似性为43. 34%，同水稻depl的相似性为22. 35%, ZmDEPl-2(SEQID NO :12)同水稻DEPl的相似性为36. 07%，同水稻depl的相似性为31. 13% (图11A)。另外，高粱的SbDEPl还存在多种氨基酸序列的自然变异，参见图17，四种不同高粱品种中SbDEPl蛋白序列中，共有四个氨基酸存在自然变异。通过同源克隆方法分别从小麦和大麦中分离了 NGR9/DEP1的同源基因TaDEPl和 HvDEPl，构建pActin = TaDEPl和pActin:HvDEPl载体，转化日本晴，二者均能降低株高并影响穗型(图IlB示转TaDEPl基因的日本晴表型)。实施例4 直立密穗基因cbpl的应用通过同源克隆方法从小麦中分离了 NGR9/DEP1的同源基因TaDEPl，与水稻DEPl 基因序列比较发现，TaDEPl基因的C-端与突变的cbpl基因很类似，也有序列缺失。为检验是否这种缺失也同样具有depl基因相类似的功能，本发明人构建了 pActiiKTaDEPl载体，转化日本晴，转基因植株表现与转化水稻cbpl基因(图10示转cbpl基因的日本晴表型)类似的表型植物为半矮化、穗型紧凑、穗粒数增加等(图IlB示转TaDEPl基因的日本晴表型)。为了进一步分析TaDEPl基因是否能够调控小麦穗型(产量)，本发明人构建 pUbi :RNAi-TaDEPl载体，通过农感菌介导的方法转化小麦济麦21 (JM21)，获得了转基因小麦。转基因小麦中TaDEPl基因表达下降后，小麦的穗型发生改变，表现出穗变长，粒密度变稀等表型(图15)。同时，构建pW3i:d印1载体，转化小麦，转基因植株也表现出半矮化表型。这些实验证明了小麦TaDEPl基因在调控小麦生长发育和穗型中也起着重要作用。因此，禾谷类DEPl同源基因间序列和功能保守，在调控植株高度和穗型(着粒密度和穗粒数等)方面起着关键作用。水稻直立密穗基因cbpl转化水稻和小麦都能导致植物半矮化表型和提高植株的耐倒伏性。同时，本发明人将构建的pW3i:d印1载体，转化玉米，获得了过量表达d印1基因的转基因玉米。转基因玉米也同样表现出半矮化表型、叶片变为深绿色等(图16)。利用光合仪 Ll-6400(LI-C0RInc.，Lincolin, NE. USA)，在的光强 1500 μ mo 1 photous HT2SecT1 下， 测定CO2的净吸收量(μπιο n^sec—1)，结果表明，转d印1基因的玉米叶片的光和效率比对照玉米提高25.6%。而且，本发明人同时发现，转基因玉米叶片夹角变小。根据本发明人的实验结果，直立密穗基因的转基因玉米叶角变小、半矮化表型和高光效的特性说明，直立密穗基因可以用来提高玉米的种植密度和增加群体光合效率，进而提高产量。鉴于水稻直立密穗基因cbpl以及实施例3的同源DEPl基因能够提高农作物的氮肥利用效率，降低农作物的株高并增强抗倒伏性，改良农作物穗型和提高叶片光合效率等方面的功能，本发明人预测该直立密穗基因可以用于提高作物氮肥利用效率和产量等方面。例如，可以通过转基因过量表达该直立密穗基因等技术手段，实现提高作物氮肥利用效率、光合效率、半矮化育种等目的。应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地显示和描述， 但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由后附的权利要求所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。参考文献Forde BG (2000). Nitrate transporters in plants-structure, function andregulation. Biochim Biophys Acta 1465 :219-23Gallais A and Hirel B. (2004). An approach to the genetics of nitrogen useefficiency in maize. J Exp Bot 55 :295-306Hirel B et al(2001). Towards a better understanding of the genetic andphysiological basis for nitrogen use efficiency in maize. Plant Physioll25 1258-1270Yamaya T et al. (2002)Genetic manipulation and quantitative-trait locimapping for nitrogen recycling in rice. J Exp Bot 53 :917-92权利要求
1.直立密穗基因的应用，其用于提高农作物的氮肥利用效率，提高光合作用效率，降低农作物株高增强抗倒伏性，以及提高农作物的产量。
2.权利要求1所述的应用，其中所述直立密穗基因来源于水稻、小麦、大麦、玉米或高ο
3.权利要求1所述的应用，其中所述直立密穗基因的核苷酸序列包括(1)SEQID NO :1,5,7,9,11 和 13 ；(2)与(1)中的任一种核苷酸序列具有至少70%、优选至少80%、更优选至少85%、更优选至少90%、尤其是至少95%或98%同一性的核苷酸序列；(3)与(1)中的任一种核苷酸序列编码相同氨基酸序列的蛋白质、但因遗传密码的简并性而在核苷酸序列上不同的核苷酸序列；(4)编码如下氨基酸序列之一的核苷酸序列=SEQID NO :2,6,8,10，12和14中任何一个所示的氨基酸序列，或者，由于一或多个(例如1-25个、1-20个，1-15个，1-10个，1-5个， 1-3个)氨基酸残基的替代、缺失和/或插入而与SEQ ID NO :2，6，8，10，12和14中任何一个所示的氨基酸序列不同的氨基酸序列，或者，与SEQ ID N0:2，6，8，10，12和14中任何一个所示的氨基酸序列具有至少70%、优选至少80%、更优选至少90%、尤其是至少95%或 98%同一性的氨基酸序列；(5)(1)-(4)中任何一个的核苷酸序列的活性片段；(6)与(1)-(4)中任何一个的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
4.权利要求1所述的应用，其中所述农作物包括水稻、小麦、大麦、玉米或高粱。
全文摘要
本发明涉及直立密穗基因dep1在提高农作物(例如，水稻、小麦、大麦、玉米、高粱等)氮肥利用效率、提高光合作用效率和控制株高抗倒伏方面的新功能和应用。更具体地，本发明涉及的直立密穗基因dep1来源于水稻、小麦、大麦、玉米、高粱等农作物。
文档编号C12N15/29GK102174527SQ201110029759
公开日2011年9月7日 申请日期2011年1月27日 优先权日2011年1月27日
发明者傅向东, 刘学英, 吴昆 , 张成伟, 王栓锁, 钱前 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所