专利名称：一种乳杆菌多糖分离纯化的方法
技术领域：
本发明涉及一种应用生物工程技术从乳杆菌菌体中分离纯化乳杆菌多糖的方法。
背景技术：
乳杆菌(LactcAacillaceae)为革兰氏阳性兼性需氧细菌，为革兰氏染色阳性、无芽孢杆菌。分解糖的主要终产物是乳酸，不发酵乳酸盐。广泛分布于含有碳水化合物的动植物发酵产品中，也见于温血动物的口腔、阴道和肠道内。该属细菌分解糖的能力强，分解蛋白质类的能力极低。乳杆菌耐酸，最适PH值为5.5 5.8，甚至更低。作为益生菌它们被广泛添加在食品、药品、保健品中，用于人体的防病，治病。随着人类对乳杆菌认识的深入， 应用乳杆菌自身的生物拮抗作用和免疫作用以抑制肠道有害菌的生长，从而达到防病治病的作用。近年来，人们注意到肠道内乳杆菌可增强机体免疫监视功能，例如通过口服乳杆菌可增强各种细胞因子和IgA产生。提高自然杀伤细胞和巨噬细胞活性、提高局部或全身的防御功能，发挥自身稳定调节、抗感染、抗肿瘤、抗突变、抗衰老作用。经检索，关于乳杆菌多糖的分离纯化方法目前尚无报道。
发明内容
本发明要解决的问题是提供一种乳杆菌多糖的分离纯化的方法。本发明提供乳杆菌多糖的分离纯化方法，不影响多糖天然的结构，保留了其生物活性，并能作为(如针剂等)药用原料。本方法的具体步骤是从乳杆菌菌体中通过热水提取有生物活性的粗多糖、去蛋白、除盐、柱层析纯化和冷冻干燥。本发明具体工艺步骤如下1、乳杆菌发酵其菌体浓缩本发明所涉及到的乳杆菌包括嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、德氏乳杆菌、保加利亚乳杆菌。将乳杆菌种子液接入已经灭菌后的每IOOml培养基中含有大豆蛋白胨1-1. 5g，鱼胨1-1. 5g，葡萄糖2g，牛肉膏0. 5-2g，酵母膏0. 5_2g， K2HPO4O. 2-0. 6g。经35-38°C厌氧发酵后，再经离心浓缩即获得乳杆菌菌体浓缩物。2、细胞破壁将该乳杆菌菌体浓缩物加蒸馏水或生理盐水(1 3-1 5)，使用高压细胞破碎机操作压力IOOMPa左右以高压破碎菌体细胞壁。3、脱脂取乳杆菌菌体菌体粉末到IOOOml烧杯中，加入甲醇，搅拌至完全浸没，室温下脱脂Mh。黄褐色上清回收，沉渣再加入甲醇，重复脱脂一次。4、水提步骤1所得的脱脂后乳杆菌菌体菌体粉末按1 6% (g/ml)的料液比加入蒸馏水，室温下浸提20 25小时；以3000 5000rpm离心15 30min，上清45°C旋转蒸发器减压蒸发，浓缩至原生药体积的1. 5倍，再逐渐加入预冷的4倍体积的无水乙醇，4°C 冰箱过夜。收集沉淀，即得乳杆菌粗多糖。5、去蛋白步骤2所得的乳杆菌多糖水提物溶液溶解于双蒸水，将氯仿按多糖水溶液1/5体积加入，随之加入氯仿体积1/5的正丁醇，混合物经剧烈振摇搅拌后，以 5000rpm，30min离心，除去蛋白。如此重复除蛋白7-10次。
6、透析步骤3所得的粗品浓缩，离心，弃不溶物，得上清液，用截流分子量为3500 的透析袋对蒸馏水透析，在流水中透析48h，再在去离子水中透析M小时，进一步去除寡糖、无机盐、色素等小分子杂质，收集乳杆菌多糖的提取液。7、纯化将经步骤4透析后的液体浓缩，经DEAE纤维素-52和葡聚糖凝胶层析。a)阴离子交换色谱柱(DEAE纤维素-5 蒸馏水平衡DEAE纤维素-52 (3. 5 X 40cm)，上样量30ml,以0 0. 5mol/L的NaHCO3线性梯度洗脱，流速为0. 5ml/ min，苯酚-硫酸法检测多糖出峰，绘制洗脱曲线。分离出3个组分，收集后适当浓缩、再透析和冷冻干燥。b)凝胶过滤层析初次纯化(S^hadex G_100)将第1、2组分分别上凝胶柱 (3. 5 X 100cm)纯化，以0. Imo 1/L NaCl洗脱，流速为0. 5ml/min，苯酚-硫酸法检测多糖出峰，绘制洗脱曲线。第1组分经kphadex G-100凝胶柱初次纯化后，得2个峰，第2峰为所需；第2组分G-100凝胶柱初次纯化后，得2个峰，第1峰为所需。收集所需峰，浓缩后4°C保存。c)凝胶柱再次纯化(Sephadex G-75和Sephadex G-100)第1组分第2峰选择 SephadexG-75凝胶柱(1. 6 X 100cm)再次纯化，第2组分第1峰选择kphadex G-100凝胶柱(1.6 X 100cm)再次纯化，均以0. lmol/L NaCl洗脱，流速为0. 3ml/min，苯酚-硫酸法检测多糖出峰，绘制洗脱曲线。此两个峰纯化后，都经高效液相检测为单一峰。8、冷冻干燥将纯化后的两个峰收集后，对蒸馏水透析2d，45°C条件下旋转蒸发器减压蒸发至适当体积，5000rpm, 30min离心，上清经0. 22 μ m滤膜过滤后冷冻干燥，得两个白色粉末的乳杆菌多糖纯品，经高效液相检测纯度为100%，苯酚-硫酸法检测中性糖含量达95%以上。本发明建立多糖的分离纯化工艺，获取均一分子量的多糖，主要成分为甘露糖和半乳糖，具有免疫调节和抗肿瘤活性。对进一步研究其化学结构和阐明其免疫药理活性机制有重要意义。
图1 多糖经DEAE-纤维素52柱层析分离出3个组分图2 第1组分的初次凝胶过滤层析图谱图3 第2组分的初次凝胶过滤层析图谱图4 第1组分的第2峰经再次凝胶纯化后的HPLC图谱图5 第2组分的第1峰经再次凝胶纯化后的HPLC图谱
具体实施例方式实施例1 1、乳杆菌发酵其菌体浓缩本发明所涉及到的乳杆菌包括嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、德氏乳杆菌、保加利亚乳杆菌。将乳杆菌种子液接入已经灭菌后的每IOOml培养基中含有大豆蛋白胨1-1. 5g，鱼胨1-1. 5g，葡萄糖2g，牛肉膏0. 5-2g，酵母膏0. 5_2g， K2HPO4O. 2-0. 6g。经35-38°C厌氧发酵后，再经离心浓缩即获得乳杆菌菌体浓缩物。2、细胞破壁将该乳杆菌菌体浓缩物加蒸馏水或生理盐水(1 3-1 5)，使用高压细胞破碎机操作压力IOOMPa左右以高压破碎菌体细胞壁。3、脱脂取300g破壁的乳杆菌菌体粉末到IOOOml烧杯中，加入甲醇，搅拌至完全浸没，室温下脱脂Mh。弃上清后沉渣再加入甲醇，重复脱脂一次。4、步骤1所得的脱脂后乳杆菌菌体粉末按1 6% (g/ml)的料液比加入蒸馏水， 室温下浸提20 25小时；以3000 5000rpm离心15 30min，上清45°C旋转蒸发器减压蒸发，浓缩至原生药体积的1. 5倍，再逐渐加入预冷的4倍体积的无水乙醇，4°C冰箱过夜。 收集沉淀，即得乳杆菌粗多糖。5、去蛋白步骤2所得的乳杆菌多糖水提物溶液溶解于双蒸水，将氯仿按多糖水溶液1/5体积加入，随之加入氯仿体积1/5的正丁醇，混合物经剧烈振摇搅拌后，以 5000rpm，30min离心，除去蛋白。如此重复除蛋白7-10次。6、透析步骤3所得的粗品浓缩，离心，弃不溶物，得上清液，用截流分子量为3500 的透析袋对蒸馏水透析，在流水中透析48h，再在去离子水中透析M小时，进一步去除寡糖、无机盐、色素等小分子杂质，收集乳杆菌多糖的提取液。7、纯化将经步骤4透析后的液体浓缩，经DEAE纤维素-52和葡聚糖凝胶层析。d)阴离子交换色谱柱(DEAE纤维素-5 蒸馏水平衡DEAE纤维素-52 (3. 5 X 40cm)，上样量30ml,以0 0. 5mol/L的NaHCO3线性梯度洗脱，流速为0. 5ml/ min，苯酚-硫酸法检测多糖出峰，绘制洗脱曲线。分离出3个组分(见图1)，收集后适当浓缩、再透析和冷冻干燥。e)凝胶过滤层析初次纯化(S^hadex G_100)将第1、2组分分别上凝胶柱 (3. 5 X 100cm)纯化，以0. Imo 1/L NaCl洗脱，流速为0. 5ml/min，苯酚-硫酸法检测多糖出峰，绘制洗脱曲线。第1组分经kphadex G-100凝胶柱初次纯化后，得2个峰(见图2)，第 2峰为所需；第2组分经kphadex G-100凝胶柱初次纯化后，得2个峰(见图幻，第1峰为所需。收集所需峰，浓缩后4°C保存。f)凝胶柱再次纯化(S^hadex G-75和kphadex G-100)第1组分第2峰选择 SephadexG-75凝胶柱(1. 6 X 100cm)再次纯化，第2组分第1峰选择kphadex G-100凝胶柱(1. 6 X 100cm)再次纯化，均以0. Imol/LNaCI洗脱，流速为0. 3ml/min，苯酚-硫酸法检测多糖峰，绘制洗脱曲线。此两个峰纯化后，都经高效液相检测为单一峰(见图4，图5)。8.冷冻干燥将纯化后的两个峰收集后，对蒸馏水透析2d，45°C条件下旋转蒸发器减压蒸发至适当体积，5000rpm, 30min离心，上清经0. 22 μ m滤膜过滤后冷冻干燥，得两个白色粉末的乳杆菌多糖纯品，经高效液相检测纯度为100%，苯酚-硫酸法检测中性糖含量达95%以上。
权利要求
1.一种乳杆菌多糖分离纯化的方法，由下列步骤实现(1)乳杆菌发酵及其菌体浓缩将乳杆菌种子液接入已经灭菌后的每IOOml培养基中含有大豆蛋白胨1-1. 5g,鱼胨1-1. 5，葡萄糖2g，牛肉膏0. 5-2g，酵母膏0. 5_2g， K2HPO4O. 2-0. 6g。经35-38°C厌氧发酵后，再经离心浓缩即获得乳杆菌菌体浓缩物。(2)细胞破壁将该乳杆菌菌体浓缩物加蒸馏水或生理盐水(1 3-1 5)，使用高压细胞破碎机操作压力IOOMPa左右以高压破碎菌体细胞壁。(3)脱脂将破壁粉碎乳杆菌菌体，用有机溶剂以常规方式脱脂；(4)水提步骤⑴所得的脱脂后乳杆菌菌体粉末按1 6% (g/ml)的料液比加入蒸馏水，室温下浸提20 25小时；以3000 5000rpm离心15 30min，取上清液，得乳杆菌多糖水提物溶液；(5)去蛋白步骤( 所得的乳杆菌多糖水提物溶液用有机溶剂以常规方式去除其蛋白；(6)透析步骤C3)所得的粗品浓缩，离心，弃不溶物，得上清液，用透析袋将上清液在流水中透析48h，再在去离子水中透析M小时，进一步去除寡糖、无机盐、色素等小分子杂质，收集乳杆菌多糖的提取液；(7)纯化将经步骤(4)透析后的液体浓缩，经DEAE纤维素-52和葡聚糖凝胶层析，收集液用苯酚硫-酸法检测，合并多糖峰的收集液，真空冷冻干燥，得纯乳杆菌多糖。
2.权利要求1说述的乳杆菌多糖的分离纯化方法，其特征在于乳杆菌为嗜酸乳杆菌、 干酪乳杆菌、德氏乳杆菌、保加利亚乳杆菌中的一种或多种。
3.如权利要求1说述的乳杆菌多糖的分离纯化方法，其特征是，步骤(1)所述有机溶剂是甲醇。
4.如权利要求1说述的乳杆菌多糖的分离纯化方法，其特征是，步骤(2)所述浸提时间是对小时。
5.如权利要求1说述的乳杆菌多糖的分离纯化方法，其特征是，步骤(2)所述离心速度是5000rpm，离心时间是15min。
6.如权利要求1说述的乳杆菌多糖的分离纯化方法，其特征是，步骤(3)所述有机溶剂是氯仿和正丁醇。
7.如权利要求1说述的乳杆菌多糖的分离纯化方法，其特征是，步骤(5)所述DEAE纤维素-52层析柱(3. 5X40em)，上样量30ml，洗脱液是0 0. 5mol/L的NaHCO30
8.如权利要求1说述的乳杆菌多糖的分离纯化方法，其特征是，步骤(5)所述葡聚糖凝胶(SephadexG-100 和 S印hadexG_70 层析柱为 3. 5 X 1OOcm 和 1. 6 X 1OOcm 两种规格。上样量分别为30ml和細1，洗脱液均是0. lmol/L的NaCl。
全文摘要
本发明涉及一种乳杆菌多糖分离纯化的方法，主要由下述步骤组成将乳杆菌菌种接种在培养基经35-38℃厌氧发酵后，离心浓缩获得乳杆菌菌体浓缩物；再经高压破碎菌体细胞壁；水提醇沉淀法提取乳杆菌多糖成分，阴离子交换层析和凝胶过滤层析反复色谱纯化，真空冷冻干燥乳杆菌多糖的提取物，即得乳杆菌多糖。利用本发明制备的乳杆菌多糖能够最大限度分离纯化乳杆菌多糖，既不影响多糖天然的结构又能保持其原有生物活性，且本发明的方法设备及环境要求低，方法简便，成本低，灵活实用，利于推广、开发和应用。
文档编号C12R1/23GK102174613SQ20111003636
公开日2011年9月7日 申请日期2011年1月31日 优先权日2011年1月31日
发明者刘佳明, 孙晶 申请人:温州医学院