专利名称：一种混合营养无菌培养微藻快速积累油脂的方法
技术领域：
本发明涉及藻类生物培养技术，尤其涉及一种混合营养培养小球藻快速生长并大量积累生物油脂的方法。
背景技术：
近年来，全球能源需求不断扩大，寻求可以替代石油的可再生清洁能源是目前急需解决的重要问题。藻类具有光合作用效率高、环境适应能力强、生长周期短、生物产量高、 油脂含量丰富的特点，因此藻类是制备生物油燃料的良好材料。但目前生产微藻生物燃料的主要问题是培养成本较高。只有首先解决快速生长和高油脂含量微藻品种的选育，优化培养条件和工艺，改良大规模生产条件，提高目标产物脂质的高效分离才能有效降低生产成本。普通小球藻(Chlorella vulgaris)是一种可利用有机碳源异养培养的绿藻，生长速度比光照条件下快，类似于细菌的代谢生长，通过异养转化可获得高脂肪含量的异养小球藻。迄今为止大规模培养小球藻主要采用开放池式户外培养系统以及各种半密闭和密闭培养系统，由于仍然采用光照自养方式，成本高，生产效率偏低。以有机物作为小球藻的唯一碳源进行异养培养，具有无需光照，细胞增殖快，浓度高，生产系统易于实现自动控制，可利用现有的发酵设备等优点。但藻细胞异养生长的培养液极易染菌，目前发酵设备的通气经过滤膜简单过滤装置除菌，无法彻底除去空气中的其他杂菌，且滤膜需要定期更换，成本较高。
发明内容
本发明提供一种混合营养无菌培养高密度小球藻的方法和油脂提取方法，其制备过程为a.采用小球藻自养通气培养获得较高生物量在50mL改良SE液体培养基中培养小球藻细胞，再逐步移至250mL，500mL，3000mL的三角瓶中无菌通气扩大培养，温度25 27°C，培养时间4-5天。其中，所述改良SE液体培养基成分为每IOOOmL培养基中含有NaNO3 0. 25g, CaCl2. 2H20 0. 025g, MgSO4 · 7H20 0. 075g, K2HPO4 0. 075g, KH2PO4 0. 175g, NaCl 0. 025g, FeCl3 · 6H20 0. 005g, Fe-EDTA 2mL, A5 微量元素混合液 lmL。其中，所述无菌通气扩大培养方法为用磁力空气压缩泵通入的硫酸铜溶液除菌，再经无菌水除去空气中的微量硫酸铜成分，最后无菌空气通入3000mL三角瓶提供细胞所需ω2及悬浮和搅拌。其中，所述通气培养为磁力空气压缩泵通气流量10-15L/min，培养温度22 27°C，光照 120μπιο1 · πΓ2 · s-1。b.采用添加有机物的通气异养培养小球藻快速获得油脂积累添加有机物为浓度40g/L的无菌葡萄糖溶液，并进行遮光通气培养，培养温度22 27。C。
其中，所述无菌葡萄糖溶液经80°C蒸汽压力灭菌，灭菌时间20分钟。其中，所述遮光通气培养的通气流量为20-25L/min。c.小球藻干藻粉采用碱催化的无水乙醚-石油醚方法提取油脂取适量小球藻藻粉于5mL离心管中，充分研磨后加入3mL无水乙醚-石油醚混合液，40°C条件下适当振荡浸提，加入10%的氢氧化钾溶液静止30min，将混合溶液4000rpm离心IOmin收集上清液于已恒重的离心管中，60°C水浴蒸去多余的溶剂，称量并计算油脂含量。其中，所述无水乙醚-石油醚混合液的体积比为1 2。本发明提供的方法与现有技术方法相比的积极效果如下(1).所述混合营养无菌通气培养小球藻方法，能有效除去通气时带入的病菌和其他微生物。通气不仅提供细胞悬浮搅拌的作用，而且在培养过程中提供有效碳源，使小球藻在无机培养基中快速大量繁殖，此时小球藻迅速形成生长优势，也不利于杂菌生长。(2).所述第二阶段添加少量葡萄糖进行小球藻异养暗培养，能迅速提高微藻油脂积累，藻细胞中油脂含量大大增加。通过混合营养无菌培养小球藻，每升藻液可得小球藻粉约为3. 77g。完全自养条件下培养得到的小球藻，每升藻液所得藻粉仅为0. 123g。(3).所述混合营养无菌通气培养小球藻方法，培养液中藻细胞浓稠、颜色变黄， 藻细胞叶绿素消失，细胞体积增大，藻细胞中油脂含量大大增加，是自养条件下油脂含量的 4. 8倍。完全自养条件下培养得到的小球藻颜色深绿，细胞数量相对较多但油脂含量低。(4).由于微藻含有较高的叶绿素，所提取油脂颜色较深，需进行脱色处理，既增加成本，又损失油脂。所述碱催化的无水乙醚-石油醚方法提取小球藻藻粉油脂方法，提取的油脂含量高，色泽好，可以不用脱色处理。
图1是本发明提供的混合营养无菌培养微藻快速积累油脂方法的一个实施例的方法流程图。图2是本发明提供的混合营养无菌培养微藻快速积累油脂方法的一个实施例的无菌通气混合培养小球藻装置示意图。图3是本发明提供的混合营养无菌培养微藻快速积累油脂方法的一个实施例的 3L小球藻培养图。图4是本发明提供的混合营养无菌培养微藻快速积累油脂方法的一个实施例的自养和混合营养条件下的细胞干重和油脂含量比较图。图5是本发明提供的混合营养无菌培养微藻快速积累油脂方法的一个实施例的不同提取方法所得油脂含量图。
具体实施例方式实施例1本发明提供的混合营养无菌培养微藻快速积累油脂方法的方法流程图 (参考图1)1.微藻第一段通气自养培养方法为所述微藻可以从环境中分离，也可向国内外藻种库购买。本实施例以小球藻为例，在改良SE液体培养基中培养小球藻细胞，温度25 27°C，光照120μπιΟ1 · m_2 · s—1，培养时间4_5天。所述改良SE液体培养基成分特征为所述每 IOOOmL 培养基中含有 NaNO3 0. 25g, CaCl2. 2H20 0. 025g, MgSO4 · 7H20 0. 075g, K2HPO4 0. 075g, KH2PO4 0. 175g, NaCl 0. 025g, FeCl3 · 6H20 0. 005g, Fe-EDTA 2mL, A5 微量元素混合液 ImL。2.所述小球藻无菌通气扩大培养方法为参考图2所示，用磁力空气压缩泵通入1 %的硫酸铜溶液除菌，再经无菌水除去空气中的微量硫酸铜成分，最后无菌空气通入 3000mL三角瓶提供细胞所需CO2及悬浮和搅拌，所述磁力空气压缩泵通气流量10-15L/ min，培养温度 22 27°C，光照 120 μ mol · πΓ2 · s—1。3.所述小球藻第二段添加有机物的通气异养培养模式为添加有机物为无菌的 40g/L葡萄糖溶液，并进行遮光通气培养，培养温度22 27°C。所述补加葡萄糖经80°C蒸汽压力灭菌，灭菌时间20分钟，所述磁力空气压缩泵通气流量20-25L/min。4.所述小球藻藻粉的制备通气暗培养5天后，5500-7500rpm离心收集藻泥，-50°C冷冻干燥藻粉至恒重制得干藻粉。5.所述碱催化的有机溶剂混合液方法提取小球藻藻粉油脂方法为取适量小球藻藻粉于离心管中，充分研磨后加入适量无水乙醚-石油醚混合液，40°C条件下适当振荡浸提，加入10%的氢氧化钾溶液，将混合溶液离心收集上清液，60°C水浴蒸去多余的溶剂， 称量并计算油脂含量。所述无水乙醚-石油醚混合液的体积比为1 2。油脂百分含量用以下公式计算油脂含量(％ )=(总脂含量/藻细胞干重)X 100%。实施例2.本实施例一次混合营养无菌培养小球藻快速积累油脂的具体步骤如下1.小球藻第一段通气自养培养方法步骤所述小球藻来自于环境并经平板划线分离纯化。先在50m L改良SE液体培养基富集培养藻细胞，培养4-5天后，将富集的藻细胞划线于SE固体培养基的平板上，其中琼脂量2.0%，培养温度25 27°C，光照 120 μ mol · m_2 · s—1。2周左右固体平板上长出绿色的单个藻落，挑取单藻落在SE固体培养基平板反复进行划线分离2次后，得到纯藻种。所述改良SE液体培养基成分特征为所述每 IOOOmL 培养基中含有 NaNO3 0. 25g, CaCl2. 2H20 0. 025g, MgSO4 · 7H20 0. 075g, K2HPO4 0. 075g, KH2PO4 0. 175g, NaCl 0. 025g, FeCl3 · 6H20 0. 005g, Fe-EDTA 2mL, A5 微量元素混合液 ImL。2.所述小球藻无菌通气扩大培养步骤为在50mL SE液体培养基中培养纯化好的小球藻细胞至对数生长期，细胞密度为1. 5-2. 5X108个/mL。按照10%接种量再逐步扩大至无菌的250mL，500mL三角瓶中光照振荡培养，摇床转速100转/分钟，培养温度22 27°C，光照120μπιΟ1 ·πΓ2 · s—1。小球藻在3000mL三角瓶中采用无菌通气培养，其步骤为用磁力空气压缩泵输出空气(参考图2中|0所示)，将空气通入的硫酸铜溶液除菌(参考图2中所示)，再经无菌水除去空气中的微量硫酸铜成分(参考图2中0所示)，最后无菌空气通入3000mL三角瓶提供细胞所需(X)2及悬浮和搅拌(参考图中0所示)，所述磁力空气压缩泵通气流量15L/min，培养温度22 27°C，光照120 μ mol · m_2 · s-1。3.所述小球藻第二段添加有机物的通气异养培养步骤为自养通气培养4天后， 向3000mL三角瓶中添加浓度为40g/L的葡萄糖溶液，所述补加葡萄糖经80°C蒸汽压力灭菌，灭菌时间20分钟。添加葡萄糖溶液后进行遮光通气培养，所述磁力空气压缩泵通气流量25L/min，培养温度27°C。所述小球藻第二段添加有机物的通气异养后，藻细胞浓稠、颜色变黄，藻细胞叶绿素消失，细胞体积增大，藻细胞中油脂含量大大增加(参考图3中所示)。而完全自养条件下培养得到的小球藻颜色深绿，细胞数量相对较多但油脂含量低(参考图3中0，g，@所示)。4.所述小球藻藻粉的制备小球藻暗培养5天后，转速7000转/分钟离心15分钟收集藻泥于培养皿中，_50°C冷冻干燥藻粉至恒重制得干藻粉，藻粉干重为3. 77g/L，是自养条件下的30. 65倍(参考图4)。5.所述碱催化的有机溶剂混合液方法提取小球藻油脂步骤为取0. 3g藻粉于5mL 离心管中，充分研磨，加入体积比为1 2的3mL无水乙醚-石油醚混合液，40°C水浴条件下萃取浸提，期间加入0.5mL浓度为10%的氢氧化钾溶液适当振荡混勻。待池提取结束后，将混合溶液在4000转/分钟离心lOmin，收集上清液于已恒重的离心管中，于60°C水浴中迅速蒸去多余的溶剂，按照以下公式计算油脂含量油脂含量(％)=(总脂含量/藻细胞干重)X100%。本实施例方法所得小球藻油脂颜色呈清澈淡黄色(参考图5中第2样管)，油脂含量为51. 08%，是自养条件下油脂含量的4. 84倍。实施例3另取3份藻粉分别用氯仿-甲醇法、正己烷-乙醇法以及氢氧化钾-甲醇法提取小球藻油脂，本实施例主要比较各方法的提取效果(参考图5)。1.所述氢氧化钾-甲醇法提取油脂步骤取0. 3g小球藻藻粉加入少许蒸馏水，-20°C下冷冻与40°C水中溶解5min，反复两次。将冻融法处理的藻粉，加入4mL的IM氢氧化钾-甲醇混合液，75°C水浴ΙΟπ η,ΜΛ ^iL正己烷，混勻，4000r/min离心lOmin，取上清液，加入正己烷洗涤残渣，合并上清液，60°C挥发溶剂称重，按照以下公式计算油脂含量: 总脂百分含量(％)=(总脂含量/藻细胞干重)X 100%。本实施例所述氢氧化钾-甲醇法提取小球藻油脂颜色呈清澈浅绿色(参考图5中第1样管)，油脂含量为28. 57%。2.所述氯仿-甲醇法提取油脂步骤为取0.3g小球藻藻粉加入少许蒸馏水，-20°C下冷冻与40°C水中溶解5min，反复两次。将冻融法处理的藻粉，加入体积比1 2 的3mL氯仿-甲醇混合液，充分震荡2min，再加入ImL氯仿震荡混勻，加1. 5mL蒸馏水， 4000r/min离心lOmin，取上清液加入等体积0. 1 %的氯化钠溶液，混勻，4000r/min离心 lOmin，取上清液60°C挥发除去氯仿称重，计算油脂含量。本实施例所述氯仿-甲醇法提取小球藻油脂颜色呈墨绿色(参考图5中第3样管)，油脂含量为46. 98%。3.所述正己烷-乙醇法提取油脂步骤取0.3g小球藻藻粉加入少许蒸馏水，-20°C下冷冻与40°C水中溶解5min，反复两次。将冻融法处理的藻粉，加入体积比1 2 的3mL正己烷-乙醇混合液，以下提取步骤如本实施例中2所述各步骤。本实施例所述正己烷-乙醇法提取小球藻油脂颜色呈蓝绿色(参考图5中第4样管)，油脂含量为19. 09%。
权利要求
1.一种混合营养无菌培养高密度小球藻的方法，该方法采用两段式混合营养培养，即第一段采用小球藻通气自养培养方法，第二段采用添加有机物的通气异养培养模式。
2.—种小球藻干藻粉提取油脂的方法，该方法采用碱催化的无水乙醚-石油醚方法提取藻粉油脂。
3.根据权利要求1所述小球藻通气自养培养方法，其特征在于在50mL改良SE液体培养基中培养小球藻细胞，再逐步移至250mL，500mL，3000mL的三角瓶中无菌通气扩大培养， 温度25 27°C，培养时间4-5天。
4.根据权利要求3所述改良SE液体培养基，其成分特征在于所述每IOOOmL培养基中含有 NaNO3 0. 25g, CaCl2. 2H20 0. 025g, MgSO4 · 7H20 0. 075g, K2HPO4 0. 075g, KH2PO4O. 175g, NaCl 0. 025g, FeCl3 · 6H20 0. 005g, Fe-EDTA 2mL, A5 微量元素混合液 lmL。
5.根据权利要求3所述无菌通气扩大培养方法，其特征在于用磁力空气压缩泵通入1 %的硫酸铜溶液除菌，再经无菌水除去空气中的微量硫酸铜成分，最后无菌空气通入 3000mL三角瓶提供细胞所需CO2及悬浮和搅拌，所述磁力空气压缩泵通气流量10-15L/ min，培养温度 22 27°C，光照 120 μ mol · πΓ2 · s—1。
6.根据权利要求1所述小球藻添加有机物的通气异养培养模式，其特征在于所述小球藻异养培养添加有机物为无菌的40g/L葡萄糖溶液，并进行遮光通气培养，培养温度 22 27°C。
7.根据权利要求6所述小球藻通气异养培养模式，其特征在于所述补加葡萄糖经 80°C蒸汽压力灭菌，灭菌时间20分钟，所述磁力空气压缩泵通气流量20-25L/min。
8.根据权利要求2所述碱催化的无水乙醚-石油醚方法提取小球藻藻粉油脂，其特征在于取0. 3g小球藻藻粉于5mL离心管中，充分研磨后加入3mL无水乙醚-石油醚混合液， 40°C条件下适当振荡浸提，加入10%的氢氧化钾溶液静止30min，将混合溶液4000rpm离心 IOmin收集上清液于已恒重的离心管中，60°C水浴蒸去多余的溶剂，称量并计算油脂含量。
9.根据权利要求8所述碱催化的无水乙醚-石油醚提取小球藻藻粉油脂方法，其特征在于所述无水乙醚-石油醚混合液的体积比为1 2。
全文摘要
本发明涉及藻类生物培养技术，尤其涉及一种混合营养培养小球藻快速生长并大量积累生物油脂的方法。该方法采用两段式培养，即第一段采用小球藻自养通气培养获得较高生物量，第二段采用添加有机物的通气异养培养模式，改变小球藻的单纯营养方式，在大量生物量基础上快速积累油脂，同时采用新颖的空气除菌方法有效解决培养液染菌问题，无需滤膜，降低了培养成本。藻粉油脂的提取采用碱催化的无水乙醚-石油醚提取方法。本发明的优点为整个过程操作简单，实验和生产成本低，培养周期短，能迅速提高微藻油脂积累浓度，提取的油脂含量高，纯度好，不用脱色处理。本发明适应于实验室或工业上制备微藻油脂，具有很好的应用前景。
文档编号C12R1/89GK102174409SQ20111004316
公开日2011年9月7日 申请日期2011年2月23日 优先权日2011年2月23日
发明者宋东辉, 朱义平, 杨国兰 申请人:天津科技大学