检测鸭瘟病毒抗体的ul55重组原核表达蛋白及制备方法

专利名称：检测鸭瘟病毒抗体的ul55重组原核表达蛋白及制备方法
技术领域：
本发明涉及动物医学领域，涉及一种基因工程制品和其制备方法。具体地说是一种应用基因工程技术制备检测鸭瘟抗体的DPV-UL55基因重组原核表达检测抗原蛋白及其制备方法。
背景技术：
鸭瘟(duck plague, DP)是由疱疹病毒科中的DPV引起的常见于鸭、鹅、天鹅等水禽的一种高度致死性传染病。鸭瘟自上世纪20年代首先在荷兰被发现以来，已有80多年的历史了。该病在世界各养鸭地区都有分布，给世界各国的水禽养殖业造成了巨大的经济损失。其预防和控制已直接关系到水禽养殖业的持续稳定发展。临床和实验室试验证实DPV弱毒疫苗是预防控制DP的有效生物制剂，而对DPV特异性抗体的监测是评价DPV弱毒疫苗免疫效果及制定合理的免疫程序的关键。目前，用于检测DPV抗体的方法大多是基于DPV全病毒作为抗原的检测方法。但其存在以下不足一是在操作过程中不可避免造成散毒；二是由于DPV全病毒作为诊断抗原其制备的复杂性以及纯度不够理想使其不易推广。阻碍了以全病毒作为诊断抗原监测DPV抗体的大规模应用。利用原核表达系统生产的一些基因工程蛋白可以保持必要的抗原性，而且其制备和纯化过程相对简单，能够用于病毒感染抗体的检测。因此研究和应用DPV UL55基因原核表达产物对于DPV预防和控制具有重要的理论和临床意义。

发明内容
本发明提供一种DPV UL55基因原核表达蛋白及其制备方法。其目的在于提供一种无散毒危险、稳定性好、灵敏度高、可实现工业化生产、成本低，制备方法简单易于推广的检测鸭瘟病毒抗体的原核表达检测抗原及其制备方法。本发明的目的是这样实现的一种检测鸭瘟病毒抗体的重组原核表达蛋白，该检测鸭瘟病毒抗体的重组原核表达蛋白由SEQ ID NO :2的氨基酸序列表定义；是SEQ ID NO :1核苷酸序列的原核表达产物。—种检测鸭瘟病毒抗体的原核表达蛋白的制备方法，包括以下步骤(1)设计扩增DPV-UL55基因的特异性引物；(2)通过PCR扩增获得UL55基因片段；(3)对UL55基因进行克隆、测序鉴定；(4)将UL55基因定向亚克隆至pET3h原核表达载体；(5)UL55基因在大肠杆菌中的诱导表达；将重组表达质粒pET3h-UL55转化宿主菌大肠杆菌BL21 (DE3)中进行诱导表达；(6)UL55基因表达蛋白的纯化；(7)重组UL55蛋白的复性和检测。所述的制备方法，步骤(6)具体做法为
①待纯化样的制备离心收集表达菌液收集诱导表达的菌液离心取沉淀，将菌体沉淀用 20mmolTris-HCl (pH8. 0)悬浮，直接进行包涵体洗涤法纯化重组ULL55蛋白的或_20°C保存②重组ULL55蛋白的包涵体洗涤法纯化取出离心收集并用20mmolTriS-HCl (pH8. 0)悬浮的表达菌(-20 V保存的菌体沉淀，室温下融化)，超声波(冰浴)间歇破碎菌体O00w，30sec/次，5 10次)， 4 "C 10000r/min 离心 lOmin。将沉淀用 20ml 洗液(10mmol/L PBS+2mol/L 尿素 +1 % Triton X-100+20mMTris-HCl+2mM EDTA)悬浮，4 "C 10000r/min 离心 IOmin 后，沉淀再次用20ml洗液悬浮，重复洗涤五次后，用适量尿素溶液(lOmmol/L PBS+8M尿素+50mM "Tris-HCl+SOmMNaCl+lO^甘油)溶解沉淀，4°C保存备用。所述的制备方法，步骤(7)具体做法为将包涵体洗涤纯化得到的重组UL55蛋白分多次加入到复性缓冲液(50mM Tris-HCl pH 8. 0+0. 15M NaCl+lmM EDTA+ImMGSSG+IOmM GSSH)中，使尿素浓度按6M、5M、4M、3M、2M逐步降低，使变性蛋白逐渐复性，并控制蛋白终浓度在0. 1 lmg/ml的范围内。4°C复性M 48h，收集稀释复性的蛋白液，装入透析袋 4°C透析(透析缓冲液50mM Tris-HCl pH 8. 0+50mM NaCl+0. 5mMEDTA+10%甘油+1 %甘氨酸)M 48h。透析后样品经8000g离心15min后收集上清，取其中20 μ 1进行SDS-PAGE 分析，并以纯化的的兔抗DPV为一抗，以HRP标记羊抗兔IgG为二抗进行Wfestern blotting 检测。其余蛋白液用Bradford法测定蛋白的最终浓度，分装后冷冻干燥浓缩备用。本发明制备的DPV UL55重组原核表达检测抗原，是利用基因工程技术制备的基因工程制品。该产品的表达形式是一种融合蛋白。表达的融合蛋白的分子量为40KDa。将该产品的获得设计为融合表达主要鉴于便于融合表达蛋白的纯化和免疫原性的提高。该融合蛋白在表达时，大部分以非可溶性的包涵体形式表达，在纯化之前对包涵体采用了较为温和的包涵体裂解方式，因此包涵体蛋白裂解后又经复性处理后，经Western blot鉴定后表明其具有与天然蛋白相似的免疫反应活性。经裂解的包涵体蛋白经12个月仍保持良好的均质胶体状态，无析出和沉淀现象，表明状态稳定。采用本发明方法生产的产品可用于(1)可作为检测鸭瘟病毒抗体的Dot-ELISA和间接ELISA等方法的检测抗原。(2)可作为预防鸭瘟病毒感染的基因工程亚单位疫苗。本产品的优点体现在(1)由于所制备的检测抗原是DPV UL55基因的原核表达重组蛋白，并非全病毒， 因此应用此产品作为检测抗原无散毒危险。(2)所制备的产品作为ELISA抗原检测DPV抗体具有检测灵敏度高，特异性强，无交叉反应的特点。(3)制备工艺简单、产品性能稳定，成本低，产品附加值高，适合工厂化生产，易于推广，市场应用前景广阔。


为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，凡是涉及蛋白表达的均同时提供原始彩照和黑白照。图中涉及标记及含义如下图I-A为DPV UL55基因的PCR扩增M指Maker III相对分子质量标准；1指以正常DEF基因组DNA为模板的PCR扩增产物；2指以DPV CHv毒株基因组DNA为模板的PCR 扩增产物(箭头所示的是其分子量大小，约为799bp)；图I-B为重组质粒pMD18-UL55的双酶切鉴定M1指相对分子质量标准III，M2为 DL2000相对分子质量标准；1指重组质粒pMD18-UL55用BamH I和Bio I双酶切得到的两个片段2指UL55 PCR扩增产物(箭头所示小片段的分子量大小约为799bp)；图I-C为重组表达载体pET3h_UL55的单酶切和双酶切鉴定M1为DL2000相对分子质量标准；M2指相对分子质量标准DL15000 ；1是UL55基因的PCR产物；2指重组表达载体PET3M-UL55用BamH I和)(h0 I双酶切得到的两个片段(箭头所示小片段的分子量大小约为799bp) ；3指重组表达载体pET3h-UL55用BamH I单酶切后得到的线性质粒。图2-A为重组表达蛋白的SDS-PAGE鉴定M为蛋白质相对分子质量标准；1为以 BL21为表达宿主的pET3h空载加IPTG诱导；2、3分别为未加诱导剂的UL55表达产物的上清和包涵体；4、5分别为IPTG诱导所产生的上清和包涵体(箭头所示的蛋白质分子量大小约为40KD)；图2-B为诱导剂IPTG不同终浓度诱导表达结果1_6的IPTG浓度分别为1.0、 0. 8、、0· 6、0· 4、0· 2、和 0. lmmol/L ；图2-C为不同温度诱导pET3h_UL55表达结果1_3的温度分别为37、30和25°C;图2-D为不同时间诱导pET3^i-UL55表达结果1_5的诱导时间分别为4、5、6、7和 8h。图3为重组UL55蛋白纯化效果和免疫原性的检测A，SDS-PAGE分析M为蛋白标准(KD) ；1为包涵体洗涤法纯化后透析复性的重组UL55蛋白；2为5次洗涤后的重组UL55 包涵体蛋白；B，Western blotting分析箭头所指是以兔抗DPV抗体为一抗检测复性的重组UL55蛋白(约为20KD)。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例1检测鸭瘟病毒抗体的UL55重组原核表达检测抗原及制备方法1、材料方法以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。1. 1菌株、质粒和毒株质粒pMD18-T，购自大连宝生物工程有限公司；原核表达质粒pET3h(+)，Novagen 公司产品；克隆宿主菌E. coli DH5a、表达宿主菌E. coli BL21(DE3)和DPV CHv强毒株，由四川农业大学禽病研究中心提供。1. 2试验鸭胚和血清
10日龄鸭胚，其种鸭DPV和抗体均为阴性；兔抗DPV抗体，由四川农业大学禽病研究中心提供。1. 3主要试剂琼脂糖、2X傻瓜PCR Mixture、DNA连接酶Mixture、限制性内切酶BamH I和Xhol、 UltraPure 质粒DNA小量提取试剂盒和UltraPureTM DNA回收试剂盒等分子生物学试剂及试剂盒购自大连宝生物公司、北京赛百盛基因技术有限公司、华美生物工程公司和Bio-Rad 公司；其它试剂均为分析纯，购自上海生工生物技术有限公司。2实验方法2. 1 DPV UL55 基因的克隆2. 1. 1引物设计利用Primer Premier5. 0 软件，参考 UL55 基因序列(GenBank 登录号EU071034)， 由宝生物生物技术有限公司合成。引物序列F :5，-GGATCCATGGCCGACGCGAAGGCGGT-3’ (划线部分为 BamH I 位点)；R :5，-CTCGAGGCTTGGGTCTTTACTTTTTGCGCGGAAC-3 (划线部分为 Xho I 位点)。合成后，以适量灭菌去离子水溶解，使其终浓度为20mmol/L，_20°C保存备用。2. 1. 2DPV基因组DNA的提取2. 1. 2. IDEF的制作方法取IOd日龄健康鸭胚，分别用5%碘酒和75%酒精消毒蛋壳表面。无菌操作条件下将胚体取出并用PBS将胚体洗净，剪去头、翅、腿和内脏，PBS冲洗后将胚体剪成Imm大小的小块，加PBS适量，之后置于三角瓶内，加细胞分散剂(体积分数为2.5%的胰蛋白酶)15(^1/胚，于371水浴中消化；31^11。立即将细胞悬液以4000r/ min离心5min，倾弃上清，细胞沉淀用适量的MEM悬浮后，用5层纱布过滤，向滤液中加入 10%小牛血清和100IU/mL双抗后，分装于IOOmL细胞培养瓶中，7mL/瓶，水平静置于37°C 细胞培养箱中进行培养。2. 1. 2. 2 DPV增殖取刚刚长成致密单层的DEF，弃生长营养液，用灭菌PBS清洗细胞表面2次后，加入DPV病毒液2 3mL覆盖细胞表面进行吸附，37°C吸附120min后弃病毒液，然后加含3%小牛血清和100IU/mL双抗的MEM维持营养液，之后37°C培养。同时做未接毒的DEF对照。2. 1. 2. 3 DNA提取方法直接从感染细胞中提取DPV基因组DNA的具体步骤如下 (1)选取用DPV种毒感染后细胞病变(CPE)达60% 70%的DEF(100mL细胞瓶)；同时选取细胞形态正常的DEF作对照；(2)倾去细胞培养液，加入500 μ 1的细胞裂解液，同时加蛋白酶K(10mg/mL)至终浓度为200 μ g/mL，轻轻混勻后，37°C孵育IOmin ； (3)将细胞悬浮液倒入EP离心管中，并用500μ 1的饱和酚洗涤残存于细胞瓶内的裂解物，倒入离心管中； (4)用饱和酚/氯仿及氯仿抽提2次，再用水饱和乙醚处理2次；(5)加1/10倍体积3mol/ L NaAC,混勻后，加入2倍体积冷无水乙醇，_20°C放置30 60min ； (6) 13000r/min离心 20min，沉淀用预冷的70%乙醇洗涤两次；(7)真空抽干后，溶于适量TE缓冲液中，加入1 μ 1 RNA酶，37°C作用30min，_20°C保存备用。2. 1. 3PCR 扩增 DPV UL55 基因PCR反应体系为
2χ傻瓜 PCR Mixtrue12.5μ1DPV基因组DNA2.4μ1Pl(20pmol / μ )0.5μ1Ρ2 (20ρηιο1/μ1)0.5μ1超纯水9.1μ1Total volume25μ1 /Sample轻轻混勻，2000r/min瞬时离心后进行PCR。反应参数95°C预变性IOmin ；94°C变性 40s, 66. 2°C退火 40s，72°C延伸 lmin，循环30次；最后72°C延伸lOmin，于4°C保存备用。取4μ 1 PCR产物在琼脂糖凝胶上电泳，设Maker III和空白对照，观察扩增片段的长度。2. 1. 4UL55基因的pMD18_T克隆、鉴定与测序在优化好的PCR条件下用保真PCR Mixture扩增UL55基因，产物按大连宝生物公司的T克隆试剂盒说明书进行T克隆并送大连宝生物公司测序确认。将T克隆菌种接种于5ml的LB液体培养基(含Amp 50 μ g/ml)中，37°C水浴振摇培养过夜，次日提取重组质粒，提取方法按北京赛百盛基因技术有限公司质粒抽提试剂盒说明书进行，抽提的重组质粒命名为PMD18-UL55。然后分别以BamH I/Xho I双酶切消化与 BamH I单酶切消化，1. 0%凝胶电泳观察结果。同时做PCR扩增目的基因。酶切体系如下
BamHIBamH I/Xho IpMD18-UL55 质粒8·0μ116.0μ1\ BamHIΙ.ΟμΙΙ.ΟμΙXhoI-Ι.ΟμΙIOxH BufferΙ.ΟμΙ2.0μ1超纯水补足至10μ120μ1
2. 2原核表达质粒pET3h-UL55的构建、诱导表达与表达条件优化 2. 2. 1原核表达质粒pET3h-UL55的构建与鉴定
2.2. 1. 1目的片段的酶切与连接限制性内切酶BamH I和)(h0 I分别双酶切
PMD18-UL55质粒和原核表达载体pET3h(+)，酶切体系均为
pMD18-UL55 质粒原核表达载体pET32a(+)8.0μ1BamHIBamHIΙ.ΟμΙXho IXhoIΙ.ΟμΙIOxH bufferIOxH buffer2.0μ1超纯水补足至、超纯水补足至20μ1 37°C水浴4h，按DNA回收试剂盒使用说明分别回收目的片段后，按照下列连接体系16 °C连接过夜。回收目的片段UL554.7μ1
Γ pET32a双酶切回收片段2.3μ1
2xDNA 连接酶 Mixtrue 7.5μ1 超纯水补足至_ 15μ12. 2. 1. 2重组质粒的转化采用氯化钙法制备Dffia感受态细胞。之后，取连接液 10 μ 1加到含200 μ 1感受态Dffia的离心管中，混勻后冰浴30min ；置于42°C水浴90sec，然后迅速冰浴anin ；加入不含Amp的LB液体培养基800 μ 1，37°C振摇(150r/min)培养1 1. 5h ；取200 μ 1培养物涂布于含IOOy g/mLAmp的LB平板，37 °C培养过夜，次日挑取单个菌落接种于5mL的LB液体培养基中，37°C培养12 16h，同时设立空载体转化组(空载体 10 μ 1+感受态Dffia 200 μ 1)、无载体对照组(灭菌超纯水10 μ 1+感受态Dffia 200 μ 1)。2. 2. 1. 3重组质粒的酶切和PCR鉴定将上述保存的克隆菌种接种于5ml的LB液体培养基(含Amp 50yg/ml)中，37°C水浴振摇培养过夜，次日按常规方法提取重组质粒， 然后用Β ο I单酶切、BamH I和Β ο I双酶切鉴定该重组质粒，其酶切体系如下
BamH IBamH V Xho I
pET32a-UL55 质粒8.0μ1Ι .ΟμΙΙ.ΟμΙBamHI-Xho IΙ.ΟμΙΙ.ΟμΙ 'IOxH BufferΙ.ΟμΙ2.0μ1
超纯水补足至10μ120μ1然后，以上述重组质粒为模板，利用方法2. 1. 1中的引物进行PCR反应，其方法和扩增条件同上，取PCR产物于琼脂糖凝胶上电泳检测。经过酶切和PCR鉴定，获得重组原核表达质粒pET32a-UL55。2. 2. 2重组表达质粒pET3h_UL55的诱导表达2. 2. 2. 1重组质粒pET3h-UL55的提取挑取2. 2. 1. 3已鉴定含阳性重组质粒 pET32a-UL55的Dffia菌种划线接种于含Amp 50g/mL的LB琼脂平板上，37 °C培养过夜， 次日取单个菌落接种于5mL LB液体培养基上，剧烈振荡培养10 16h，离心收集菌液，按 UltraPure 质粒DNA小量提取试剂盒说明进行重组质粒的提取与纯化。2. 2. 2. 2重组质粒pET3h_UL55转化表达菌采用氯化钙法制备E. coli BL(DE3) 感受态细胞，并将上述提取的重组质粒pET3h-UL55转化到表达宿主菌E. coli BL(DE3) 中，方法同2. 2. 1. 2。2. 2. 2. 3重组质粒pET3h-UL55的诱导表达从上述LB固体培养基(含Amp50 μ g/ mL)上，挑取阳性克隆菌，接种LB液体培养基，37°C培养过夜，次日取菌液按1 50的比例接入5mL LB液体培养基(含Amp 50 μ g/mL)中，剧烈振荡培养至0D600 = 0. 4时，分别加入IPTG至终浓度为1. Ommol/L,诱导3h后，收集ImL培养菌液，4°C 13000r/min离心2min， 弃上清，沉淀中加入80 μ 1超纯水和20 μ 1 5X SDS上样缓冲液，10(TC水浴加热变性5 lOmin，进行12% SDS-PAGE凝胶电泳，观察表达结果。
2. 2. 2. 4重组质粒pET3h_UL55表达产物的可溶性分析将诱导表达的IOOmL菌液和未诱导表达的IOOmL菌液，分别按以下步骤处理4°C lOOOOr/min离心5min，菌体沉淀用20mL 20mmol Tris-HCl (pH8. 0)悬浮；置_20°C过夜后，加溶菌酶至终浓度为lmg/mL，4°C 搅拌30min,超声波(冰浴)间歇破碎菌体(600w, 30sec/次，10次)，4°C 10000r/min离心 lOmin，取上清备用；沉淀用 IOmL 洗液(10mmol/L PBS+2mol/L 尿素+0. 2% Triton X-100) 悬浮，4°C，lOOOOr/min离心IOmin后，沉淀再次用IOmL洗液悬浮，重复洗涤五次后，用适量尿素溶液(lOmmol/L PBS+8mol/L尿素)溶解沉淀，低温保存备用。分别取适量的上清和尿素溶液溶解的沉淀，向其中加入80 μ 1超纯水和20 μ 15 X SDS上样缓冲液，100°C水浴加热变性5 lOmin，进行12% SDS-PAGE凝胶电泳，将凝胶用考马斯亮蓝染色后，观察结果。2. 2. 3重组质粒pET3h_UL55诱导条件的优化2. 2. 3. 1诱导剂IPTG的浓度优化按2. 2. 2. 3方法，取含重组质粒pET32a-UL55 的表达宿主菌BL21 (DE3)，接种5mL LB液体培养基(含Amp 50 μ g/mL)中，37 °C振摇培养过夜。次日按1 50转接种于5mL LB液体培养基(含Amp 50 μ g/mL)中，37°C培养培养至0D600值约0. 4时，取其中6只试管，分别加入IPTG至终浓度为0. Immol/L、0. 2mmol/L、 0. 4mmol/L、0. 6mmol/L、0. 8mmol/L、l. Ommo 1/L 37°C诱导培养 4h 后，按上述方法对样品进行处理，12% SDS-PAGE电泳，观察结果。2. 2. 3. 2温度条件优化按上述方法，取含重组质粒pET3h-UL55的表达宿主菌 BL21(DE3)，接种5mL LB液体培养基(含Amp 50 μ g/mL)中，37°C振摇培养过夜。次日按 1 50转接种于5mL LB液体培养基(含Amp 50 μ g/mL)中，37°C培养培养至0D600值约 0. 4时，取其中3只试管，分别加入IPTG至终浓度为0. 2mmol/L，分别置于25°C、30°C、37°C 诱导培养4h，按2. 2. 2. 3方法对样品进行处理，12% SDS-PAGE电泳，观察结果。2. 2. 3. 3诱导时间优化取含重组质粒pET3h_UL55的表达宿主菌BL21 (DE3)，接种5mL LB液体培养基(含Amp 50 μ g/mL)上，37°C振摇培养过夜。次日按1 50转接种于 5mL LB液体培养基(含Amp 50 μ g/mL)上，继续培养至0D600值约0. 4时，加入IPTG至终浓度为0. 8mmol/L，37°C诱导培养，分别于诱导后4、5、6、7、8h，吸取ImL培养液，按2. 2. 2. 3 方法对样品进行处理，12% SDS-PAGE电泳，观察结果。2. 3重组UL55蛋白的大量制备、纯化与复性2. 3. 1菌体的大量培养具体步骤为(1)将含pET3^i-UL55质粒的表达菌E. coli BL21(DE3)接种于 200mlLB液体培养基(含50 μ g/ml Amp)中，37°C培养16h，作为种子菌；(2)向已灭菌的 LB液体培养基(含50 μ g/ml Amp)中加入种子菌(按5 % ν/ν的比例加)；(3)在180r/ min, 370C，pH 7. O的条件下培养，待培养至菌液OD6tltl = 0. 6左右时，加入IPTG至终浓度为 0. 2mmol/L，37°C诱导培养4h ； (4)收集培养好的菌液(约5L), 8000r/min离心IOmin后收集菌体沉淀，用适量iTris-HCl (20mmol/L，pH 8.0)重悬后，加入溶菌酶使其终浓度为Img/ ml，-20°C保存备用。2. 3. 2重组UL55蛋白的包涵体洗涤法大量纯化取出-20°C保存的菌体沉淀，室温下融化后，超声波(冰浴)间歇破碎菌体 (200w,30sec/ 次，5 10 次)，4°C 10000r/min 离心 IOmin0 将沉淀用 20ml 洗液(IOmmol/ LPBS+2mol/L 尿素+1 % Triton X-100+20mM Tris-HCl+2mM EDTA)悬浮，4 °C 10000r/min离心IOmin后，沉淀再次用20ml洗液悬浮，重复洗涤五次后，用适量尿素溶液(lOmmol/ LPBS+8M 尿素+50mM Tris-HCl+50mM NaCl+10%甘油)溶解沉淀，4°C保存备用。2. 3. 3重组UL55蛋白的复性和检测将包涵体洗涤纯化得到的重组UL55蛋白分多次加入到复性缓冲液(50mM Tris-HClpH 8. 0+0. 15M NaCl+lmM EDTA+ImM GSSG+lOmM GSSH)中，使尿素浓度按 6M、5M、 4M、3M、2M逐步降低，使变性蛋白逐渐复性，并控制蛋白终浓度在0. 1 lmg/ml的范围内。4°C复性M 48h，收集稀释复性的蛋白液，装入透析袋4°C透析(透析缓冲液50mM Tris-HCl pH 8. 0+50mM NaCl+0. 5mM EDTA+10%甘油+1 %甘氨酸)M 48h。透析后样品经 8000g离心15min后收集上清，取其中20 μ 1进行SDS-PAGE分析，并以纯化的的兔抗DPV为一抗，以HRP标记羊抗兔IgG为二抗进行Wfestern blotting检测。其余蛋白液用Bradford 法测定蛋白的最终浓度，分装后冷冻干燥浓缩备用。再重复大量表达两次并分别纯化UL55重组蛋白，共得到3批不同表达和纯化的 UL55重组蛋白。3实验结果3. 1 DPV UL55基因的扩增、T-克隆与鉴定结果3. 1. 1UL55基因的PCR扩增结果以DPV CHv毒株基因组DNA为模板对UL55基因进行PCR扩增，其产物经1. 0%琼脂糖凝胶电泳，获得了一条约799bp的特异性DNA条带，而以正常DEF基因组DNA为模板进行PCR扩增，无特异性条带，这与预期结果一致(图1-A)。3. 1.2UL55基因T克隆鉴定结果PCR产物经胶回收纯化后，与pMD18-T载体连接并转化感受态细胞DH5 α，得到的T 克隆命名为PMD18-UL55。对pMD18_UL55进行PCR、酶切(图1-B)和测序鉴定，结果表明， T克隆获得的UL55基因序列同已知的DPV UL55基因序列完全一致。3. 2原核表达质粒pET3h_UL55的构建与鉴定、诱导表达及其优化结果3. 2. 1重组表达质粒pET3h_UL55的构建与酶切鉴定以BamH I和Xho I双酶切T克隆质粒后回收目的片断，与经相同酶切的 pET-32a(+)表达载体连接，转化DH5 α，得到重组表达质粒pET3h-UL55 (理论大小约为 6169bp)，经BamH I和Xho I双酶切后得到的两条片断的大小分别约为5370bp和799bp (见图1-C)，与理论值相符，表明原核表达载体被成功构建。3. 2. 2重组质粒pET3h_UL55的诱导表达3. 2. 2. 1重组质粒pET3h-UL55的诱导表达将重组质粒pET3h_UL55转化表达菌株BL21 (DE3)在含Amp的LB琼脂平板上筛选到了白色菌落。将含重组质粒pET3h_UL55 的表达宿主菌BL21(DE3)用IPTG进行诱导表达、未用IPTG诱导、空载体pET_32a(+)转化菌株诱导表达，结果表明空载体pET-32a(+)转化菌株诱导和未诱导菌株都未出现特异性蛋白条带；重组表达质粒pET3h-UL55表达的重组UL55蛋白在40KD处(图2-A)。3. 2. 2. 2重组质粒pET3h-UL55表达产物的可溶性分析诱导表达的IOOmL菌液经可溶性分析处理后，电泳结果显示表达蛋白主要存在于沉淀中，说明重组表达蛋白在菌体中大量以不溶的包涵体形式存在。3. 2. 3重组质粒pET3h_UL55诱导表达条件的优化
3. 2. 3. 1 IPTG浓度的优化在37°C条件下，加入IPTG使其终浓度分别为0. Immol/ L、0. 2mmol/L、0. 4mmol/L、0. 6mmol/L、0. 8mmol/L、l. Ommo 1/L 诱导培养 4h,结果显示未加诱导剂的对照管无特异性蛋白条带；随IPTG浓度的增高，蛋白诱导量没有明显差别(图 2-B)。但是比较而言，IPTG浓度为0. 2mmol/L时，蛋白表达量略高。因此，可选择0. 2mmol/ L的IPTG浓度作为诱导表达浓度。3. 2. 3. 2诱导温度条件的优化37°C培养培养至0D600值约0. 4时，取3只灭菌试管，分装5mL/管，分别加入IPTG至终浓度为0. 2mmol/L，分别置于25°C、30°C、37°C诱导培养4h，结果温度在25°C时，诱导蛋白量较少，37°C时最高(图2-C)，说明随着温度升高，蛋白诱导量逐渐增加。因此，选择温度37°C为最佳诱导温度。3. 2. 3. 3诱导时间的优化在IPTG浓度为0. 2mmol/L，37°C条件下，采用4 8h不同诱导时间进行诱导表达，结果随着时间的增加诱导产生的重组蛋白表量降低。诱导5 8h的重组蛋白表达量均显著低于4h诱导组；而诱导6 他，其重组蛋白表达量低于证且彼此间相比无明显变化(图2-D)。因此，选择4h作为最佳诱导时间。3.3重组UL55蛋白的纯化结果通过大量扩大培养，收集到了大量含有重组UL55蛋白的菌体沉淀，经溶菌酶裂解、超声破碎、洗涤和溶解包涵体、变性蛋白透析复性等过程获得了大量纯化的重组UL55 蛋白，通过SDS-PAGE分析显示纯化的重组UL55蛋白具有较高的纯度(图3-A)，Western blotting分析显示该重组UL55蛋白能与抗DPV阳性血清发生强烈的免疫反应(图3-B)， 表明该重组蛋白具有较高的免疫原性，可作为临床上检测鸭瘟抗体的检测抗原。实施例2、UL55-ELISA法检测DPV抗体方法的建立和应用上述实施例获得的重组UL55蛋白，抗DPV鸭血清(为弱毒疫苗免疫后14d的免疫鸭血清，中和效价为1 8)，抗DHV(鸭肝炎病毒)、RA(鸭里默氏杆菌)、Salm0nella(沙门氏菌)、鸭肿头出血症病毒、流感病毒和E. coli (大肠杆菌)鸭血清及非免疫鸭阴性血清，由四川农业大学禽病研究中心提供；羊抗鸭IgG-HRP(辣根过氧化酶标记的羊抗鸭IgG)和四甲基联苯胺(TMB)均购自美国KPL公司；牛血清白蛋白(BSA)购自美国Sigma公司产品。1 UL55-ELISA法检测DPV抗体方法的建立1. 1重组UL55蛋白包被浓度和血清稀释度的确定采用方阵方法确定最佳抗原包被浓度和血清稀释浓度，用包被液对浓度为^ig/ mL的复性后的重组UL55蛋白进行系列稀释(1 IOU 20,1 40,1 80,1 160、 1 320)，包被酶标反应板，每孔包被100 μ 1，每个滴度平行包被两列，将鸭血清(抗DPV阳性血清或非免疫鸭阴性血清)按1 10、1 20、1 40、1 80、1 160、1 320的稀释度进行系列稀释，羊抗鸭IgG-HI^Mtl 2000稀释，用间接ELISA方法测定，选择阳性血清的OD45tlnm值接近1. 0，阴性血清的OD45tlnm值较小，Ρ/Ν值最大的UL55蛋白和鸭血清的稀释度为此ELISA的抗原抗体反应的最适工作浓度。重组UL55蛋白抗原用包被液作系列稀释后，再加1 10-1 320稀释的阳性血清或阴性血清；另加1 2000稀释的羊抗鸭IgG-HRP酶标二抗，加底物显色液，用全自动酶标仪测定OD45tlnm值。纯化抗原包被浓度在0. 4mg/ml 0. 0125mg/ml之间时，阳性血清的稀释度为1 10-1 320时，不同稀释度的抗体的OD45tlnm值见表1。当P/N值最大为9. 667 的时候，由方阵滴定所得的最佳抗原包被浓度为2. 0μ g/ΙΟΟμ 1时，阳性血清的稀释度为
111 160。各抗原抗体浓度对应的P/N值见表2。
表1方阵滴定的OD45tlnm结果
Item抗原稀释度
不同稀释度抗体的OD450nm
权利要求
1.一种检测鸭瘟病毒抗体的重组原核表达蛋白，其特征在于该检测鸭瘟病毒抗体的重组原核表达蛋白由SEQ ID NO 2的氨基酸序列表定义；是SEQ ID NO 1核苷酸序列的原核表达产物。
2.一种检测鸭瘟病毒抗体的原核表达蛋白的制备方法，其特征在于，包括(1)设计扩增DPV-UL55基因的特异性引物；(2)通过PCR扩增获得UL55基因片段；(3)对UL55基因进行克隆、测序鉴定；(4)将UL55基因定向亚克隆至pET3h原核表达载体；(5)UL55基因在大肠杆菌中的诱导表达；将重组表达质粒pET3h-UL55转化宿主菌大肠杆菌BL21 (DE3)中进行诱导表达；(6)UL55基因表达蛋白的纯化；(7)重组UL55蛋白的复性和检测。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(6)具体做法为 ①待纯化样的制备离心收集表达菌液收集诱导表达的菌液离心取沉淀，将菌体沉淀用 20mmolTris-HCl (pH8. 0)悬浮，直接进行包涵体洗涤法纯化重组ULL55蛋白的或_20°C保存②重组ULL55蛋白的包涵体洗涤法纯化取出离心收集并用20mmolTriS-HCl (pH8. 0)悬浮的表达菌(-20 V保存的菌体沉淀，室温下融化后)，超声波(冰浴)间歇破碎菌体O00w，30sec/次，5 10次)， 4 "C 10000r/min 离心 lOmin。将沉淀用 20ml 洗液(10mmol/L PBS+2mol/L 尿素 +1 % Triton X-100+20mMTris-HCl+2mM EDTA)悬浮，4 °C 10000r/min 离心 IOmin 后，沉淀再次用20ml洗液悬浮，重复洗涤五次后，用适量尿素溶液(lOmmol/L PBS+8M尿素+50mM "Tris-HCl+SOmMNaCl+lO^甘油)溶解沉淀，4°C保存备用。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(7)具体做法为将包涵体洗涤纯化得到的重组UL55蛋白分多次加入到复性缓冲液(50mM Tris-HCl pH8. 0+0. 15M NaCl+lmM EDTA+ImM GSSG+lOmM GSSH)中，使尿素浓度按611、511、4] 、311、211逐步降低，使变性蛋白逐渐复性，并控制蛋白终浓度在0. 1 lmg/ml的范围内。4°C复性M 48h，收集稀释复性的蛋白液，装入透析袋4°C透析(透析缓冲液50mMTris-HCl pH 8. 0+50mM NaCl+0. 5mM EDTA+10%甘油+1%甘氨酸) 48h。透析后样品经8000g离心15min后收集上清，取其中20 μ 1进行SDS-PAGE分析，并以纯化的的兔抗DPV为一抗，以HRP标记羊抗兔IgG为二抗进行Western blotting检测。其余蛋白液用Bradford法测定蛋白的最终浓度，分装后冷冻干燥浓缩备用。
全文摘要
本发明公开了一种用于检测鸭瘟病毒抗体的UL55重组原核表达蛋白及制备方法，该检测鸭瘟病毒抗体的重组原核表达蛋白由SEQ ID NO2的氨基酸序列表定义；是SEQ ID NO1核苷酸序列的原核表达产物。制备方法包括(1)设计扩增DPV-UL55基因的特异性引物；(2)通过PCR扩增获得UL55基因片段；(3)对UL55基因进行克隆、测序鉴定；(4)将UL55基因定向亚克隆至pET32a原核表达载体；(5)UL55基因在大肠杆菌中的诱导表达；(6)UL55基因表达蛋白的纯化；(7)重组UL55蛋白的复性和检测。本产品可以作为检测鸭瘟病毒抗体的间接ELISA和Western Blot方法的检测抗原，也可以作为预防鸭瘟病毒感染的基因工程亚单位疫苗。
文档编号C12N15/38GK102174087SQ201110047060
公开日2011年9月7日 申请日期2011年2月28日 优先权日2011年2月28日
发明者吴英, 汪铭书, 程安春, 陈孝跃 申请人:四川农业大学实验动物工程技术中心