专利名称：一种对转入玉米的Bar基因进行筛选的方法
技术领域：
本发明涉及植物基因工程中的对转基因愈伤组织进行筛选的方法，特别是对转入玉米的Bar基因愈伤组织进行筛选的方法。
背景技术：
筛选含有目的基因的转化体是基因工程的重要环节。其基本方法是将筛选标记基因和目的基因构建到同一载体上，通过对未转化体的选择性抑制，达到筛选转化体的目的， 选择标记基因主要是抗生素或抗除草剂基因。以往基因转化中一般采用抗生素作为筛选标记系统。由于转化细胞对抗生素的解毒作用导致的交叉保护，高频率的未转化植株和嵌合体也通过了抗生素筛选。目前，抗除草剂基因已越来越多地应用于植物遗传转化，它克服了抗生素筛选的局限性，细胞产生的假转化体很少，已成功地用于小麦、水稻、玉米、大麦、高粱、燕麦、黑麦、油菜等作物的转化。抗广谱除草剂草丁膦(glufosinate)的Bar 基因(bialaphos resistance gene) 是常用的选择标记基因之一，已被克隆与测序，通过生物技术已将该基因导入20多种作物。在培养基中用草丁膦筛选转入玉米愈伤组织的Bar基因较为困难。草丁膦属有机磷类除草剂，是非选择性、广谱除草剂Liberty (商业用名还有Basta、Ignit^Challange及 Finale等)的活性成份。在一些文献中常被称为Phosphinothricin (PPT,膦丝菌)。L-草丁膦强烈抑制细菌和植物的氨基酸生物合成酶-谷氨酰胺合成酶(Glutam ine synthetase GS)。双丙氨膦(bialaphos)是由链霉素属(S treptomyces)的一些小种产生的草丁膦的三肽前体，它由来自于这些小种中的2个L-丙氨酸残基并与PPT相连组成。完整的三肽不具离体抑制活性。通过植物体中的肽酶除去2个L-丙氨酸残基后，在细胞内释放出的PPT 才有活性。但在植物组织培养中，植物细胞缺乏光照和光和作用，草丁膦在无法起到筛选的作用，发现用草甘膦筛选Bar基因效果较好。Bar基因的抗性机理(1)产生过量的靶标酶或靶标蛋白质，降低除草剂毒性。有多种形式的GS同工酶，只有细胞质形式GS和PPT抗性有关。( 产生能修饰除草剂的酶或酶系统，在除草剂发生作用前将其降解或解毒。Glufosinate (或bialaphos)抗性Bar基因，克隆来自土壤吸水链霉菌(S treptomyces hygroscopicus)。它编码膦丝菌素乙酰转移酶(phosphinthricin acetyltransferase PAT)，PAT 使 PPT 的自由氨基乙酰化从而对 PPT 解毒，使之不能抑制GS的活性。含有该基因的植物具有对Liberty的抗性。草甘膦作为一种非选择性除草剂，其作用机理主要是竞争性抑制莽草酸途径中 5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPQ的活性。该合成酶是真菌、细菌、藻类和高等植物体内芳香族氨基酸(包括色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸)生物合成过程中一个关键性的酶。 目前，关于用草甘膦筛选Bar基因的方法尚未见报道
发明内容
本发明的目的是提供一种对转入玉米的Bar基因进行筛选的方法，可以减少假阳性植株的产生，大大提高了筛选效率，避免了大量的重复劳动，对于玉米基因工程和遗传育种实践具有重要意义。本发明提供的一种对转入玉米的Bar基因进行筛选的方法包括以下步骤经过预培养的外植体接种于携带双元质粒p3300的农杆菌菌株EHA105的菌液中浸染，浸染后的外植体经共培养、含有草甘膦的筛选培养基I与筛选培养基II中筛选，再依次经过再生培养基I与再生培养基II中再生培养诱导形成胚状体和苗体，选择苗体盆栽得到的抗性植株，再用PCR检测和经凝胶电泳法证实筛选获得阳性植株为转基因植株。所述的双元质粒P3300是在其上的T-DNA区含有八氢番茄红素合成酶基因(PSY) 和PPT乙酰转移酶基因(Bar)。所述的农杆菌菌液是将携带双元质粒P3300的农杆菌菌株EHA105的单菌落接种于含100mg/l卡那霉素的YEP培养液中，28°C、160rpm振荡培养12h，当细菌达到对数生长期时，4°C、4000rpm离心收集菌体，重悬于感染培养基，菌液浓度约为OD6tltl = 0. 6-0. 8.所述的外植体的预培养是取自交系的8-13d的幼雌穗，表面用75%的酒精消毒， 再用0. 的氯化汞浸泡8分钟，无菌水洗3次后挑取幼胚接种在诱导培养基上，24°C条件下暗培养7 IOd后，拔去生长出的微芽，转入新的诱导培养基上，继代2 3周产生I型愈伤组织，继代1 2次后产生II型愈伤组织，每14d继代1次；取生长旺盛的II型愈伤组织作为农杆菌转化的受体材料。所述的预培养后的外植体共培养，即生长旺盛的II型愈伤组织接种于制备好的农杆菌菌液中，使外植体与农杆菌充分接触15-20min，再置于含ΙΟΟμπιοΙ/L乙酰丁香酮 (acetosyringone，AS)的共培培养基上，25°C下避光培养3 5天。所述的延迟是将侵染后愈伤组织用无菌水冲洗3遍，放入含有400mg/L头孢霉素的延迟培养基中延迟培养7天。所述的筛选是将延迟培养的愈伤组织放入含有5mg/L草甘膦的筛选培养基I中 25°C下避光培养筛选两周(低压筛选)。然后，将上述新鲜愈伤组织转接到含有10mg/L草甘膦的筛选培养基II (高压筛选)上25°C下避光培养筛选2-3次，每次2周，得到抗性的愈伤组织。所述的再生培养是将得到抗性的愈伤组织转入再生I培养基中，在光照条件下， 25°C，光强为5000LUX，光周期为Wh/Sh，诱导胚状体，3周后转入再生培养基II中分化出
田ο所述PCR检测为从转化抗性植株叶片中提取DNA，以转化植株为阳性对照，野生植株阴性对照，用Nos终止子基因设计引物进行PCR，以确定外源Nos终止子基因是否存在于抗性植株的细胞内，筛选阳性植株PCR 引物为上引 5，-3，GAGCTCGAATTTCCCCGATC ；下引 5，-3，GAATTCCCGATCTAGTAACATAG。本发明采用草甘膦做筛选剂对转入玉米中的Bar基因进行筛选，可以减少假阳性植株的产生，大大提高了筛选效率，避免了大量的重复劳动，对于玉米基因工程和遗传育种实践具有重要意义。
图 1 为 p3300-35S-PSY 质粒图谱。图2为再生植株PCR分析电泳图。
具体实施例方式本发明结合实施例作进一步说明材料和方法1、玉米材料玉米自交系和杂交种。2、菌株和质粒农杆菌菌株EHA105为本实验室保存菌株(已公开发表)，携带双元质粒p3300 (商业化购买)。质粒P3300上的T-DNA区含有八氢番茄红素合成酶基因(PSY，本实验室分离测序，Gene bank number AY986508)和 PPT 乙酰转移酶基因(Bar)。(图 1)载体构建过程以本实验室保存的PSY基因为模板，上下游引物两端分别引入Mc I和)(ba I酶切位点进行PCR扩增。然后，p3300质粒和PSY扩增产物经Me I和)(ba I双酶切，二者酶切产物用T4连接酶16°C，连接16h。连接产物转化E-Coli. DH5 α，涂布于含卡那霉素的LB 平板。以目的基因为引物进行PCR得到1292bp产物，酶切鉴定得到目的条带，最后测序验证结果表明载体构建正确。以Bar基因为模板，上下游引物两端分别引入B10 I酶切位点进行PCR扩增。然后，PCR产物与p3300质粒分别经Bio I单酶切，将二者酶切产物连接16°C，连接16h。连接产物转化E-Coli. DH5ci，涂布于含卡那霉素的LB平板。以目的基因为引物进行PCR得到 552bp产物，酶切鉴定得到目的条带，最后测序验证结果表明载体构建正确。3、仪器精密天平(Sartorius BT)；立式大容量冷冻离心机(HATACHI himac CR21G)；分光光度计(SPECTRUM-752) ；PCR 扩增仪(BIOMETRA T-Gradient Thermo-block) ；DNA 电泳仪 (DYCP-31D)。4、培养基诱导培养基MS大量50mL+MS微量5mL+B5有机5mL+铁盐5mL+l. 5mg/L2, 4-D+500mg/L 脯氨酸 +250mg/L 水解酪蛋白 +30g/L 蔗糖 +7g/L 琼脂 +5 μ M/L AgN03pH 为 5. 8-6. 2 ；侵染培养基MS大量50mL+MS微量5mL+B5有机5mL+铁盐5mL+l. 5mg/L2, 4-D+500mg/L 脯氨酸 +250mg/L 水解酪蛋白 +30g/L 蔗糖 +36g/L 葡萄糖 +100 μ mol/L AS+5 μ M/LAgN03, ρΗ 为 5. 8-6. 2 ；共培培养基MS大量50mL+MS微量5mL+B5有机5mL+铁盐5mL+l. 5mg/L2, 4-D+500mg/L 脯氨酸 +250mg/L 水解酪蛋白 +30g/L 蔗糖 +7g/L 琼脂 +500mg/LMES+10g/L 葡萄糖 +100 μ mol/LAS+5 μ M/LAgN03, ρΗ 5. 8-6. 2 ；延迟培养基MS大量50mL+MS微量5mL+B5有机5mL+铁盐5mL+l. 5mg/L2, 4-D+500mg/L脯氨酸+250mg/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖+7g/L琼脂+400mg/L头孢霉素+5 μ M/LAgN03, pH 5. 8-6. 2 ；筛选培养基I :MS 大量 50mL+MS 微量 5mL+B5 有机 5mL+ 铁盐 5mL+l. 5mg/L2, 4-D+500mg/L脯氨酸+250mg/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖+7g/L琼脂+5mg/L草甘膦+400mg/ L 头孢霉素 +5 μ M/L AgNO3, pH 5. 8-6. 2 ；筛选培养基II :MS 大量 50mL+MS 微量 5mL+B5 有机 5mL+ 铁盐 5mL+l. 5mg/L2, 4-D+500mg/L脯氨酸+250mg/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖+7g/L琼脂+10mg/L草甘膦+400mg/ L 头孢霉素 +5 μ M/L AgNO3, pH 5. 8-6. 2。再生培养基I :MS大量50mL+MS微量5mL+&有机5mL+铁盐5mL+100mg/L肌醇 +60g/L 蔗糖 +400mg/L 头孢霉素 +7g/L 琼脂，pH 5. 8-6. 2。再生培养基II =MS大量50mL+MS微量5mL+&有机5mL+铁盐5mL+100mg/L肌醇 +30g/L 蔗糖 +400mg/L 头孢霉素 +7g/L 琼脂，pH 5. 8-6. 2。草甘膦用水溶解，配成有效浓度为5mg/L的溶液，0. 22μπι微孔过滤后，_20°C保存。头孢霉素用水溶解，配成有效浓度为400mg/L的溶液，0. 45 μ m微孔过滤后，_20°C保存。5、PCR扩增引物胭脂碱合成酶终止子(NOS terminator)是一种常用的外源性调控序列，将NOS终止子插入外源基因中，能够调控转入的外源基因成功表达。本发明采用NOS终止子(购于试剂公司的P3300载体上所带)的引物进行转基因植株的PCR检测(扩增产物277bp)。上引5，-3，GAGCTCGAATTTCCCCGATC (序列表 1)下引5，-3，GAATTCCCGATCTAGTAACATAG (序列表 2)Nos终止子序列如序列表3所示。本发明提供的一种对转入玉米的Bar基因进行筛选的方法经过的步骤简述如下(1)将携带有外源基因的农杆菌(Agrobacterium)侵染玉米愈伤组织15min，共培
养三天，延迟一周。(2)低压筛选将愈伤组织放入含有5mg/L草甘膦的筛选培养基I中筛选两周。(3)高压筛选将筛选培养基II中的草甘膦浓度增加至10mg/L，筛选2_3次，每次 2周。(4)将得到的抗性的愈伤组织转入再生I培养基中，诱导形成胚状体。(5)于再生II培养基中分化出苗，得到转基因植株。(6)转基因再生植株PCR检测和凝胶电泳法证实。实施例1农杆菌转化玉米愈伤组织1、玉米愈伤组织遗传转化受体体系的建立本试验取玉米自交系的8-13d的幼雌穗，表面用75%的酒精消毒，再用0. 的氯化汞浸泡8分钟，无菌水洗3次后挑取幼胚接种在诱导培养基上，24°C条件下暗培养7 IOd后，拔去生长出的微芽，转入新的诱导培养基上，继代2 3周产生I型愈伤组织，继代 1 2次后产生II型愈伤组织，每14d继代1次。取生长旺盛的II型愈伤组织作为农杆菌转化的受体材料。2、感染液的制备
从平板上挑取单菌落接种于YEP培养液中含(100mg/l卡那霉素)J8°C、160rpm 振荡培养12h，当细菌达到对数生长期时，4°C、4000rpm离心收集菌体，重悬于感染培养基， 菌液浓度约为OD6tltl = 0. 6-0. 8.YEP 培养基蛋白胨 10g/L，酵母提取物 10g/L, NaCl 5g/L pH 7. 43、侵染和共培养挑取玉米胚性愈伤组织，夹碎，于上述菌液中浸泡，并不停振荡。20min后弃去菌液，用滤纸将愈伤组织吸干后置于含100 μ mol/L乙酰丁香酮(acet0Syring0ne，AS)的共培培养基上，25°C下避光培养3 5天后，将玉米愈伤组织用无菌水冲洗3遍，转入延迟培养基中延迟培养7天。4、筛选将玉米愈伤组织转入加有5mg/L草甘膦的筛选培养基I上，25°C避光培养两周，扔掉褐化死亡和水渍化的愈伤组织，将剩余新鲜组织转接到含有10mg/L草甘膦的筛选培养基II上，每两周继代一次，继代2-3次。5、再生将得到的抗性愈伤组织转入再生培养基I中在光照条件下(25°C，光强为 5000LUX，光周期为Wh/8h)诱导胚状体，3周后转入再生培养基II中分化出苗。6、移栽待小苗长出3-4片叶子时，打开瓶盖炼苗2-3天，移栽于混有珍珠岩和蛭石 (1 4)的小花盆中，放于温室培养。待小苗在长出3片新叶时即可移栽到地里或大花盆中，得到的抗性植株数如图1所示。表1农杆菌转化得到的转基因植株
权利要求
1.一种对转入玉米的Bar基因进行筛选的方法，其特征在于包括以下步骤经过预培养的外植体接种于携带双元质粒P3300的农杆菌菌株EHA105的菌液中侵染，浸染后的外植体经共培养、含有草甘膦的筛选培养基I与筛选培养基II中筛选，再依次经过再生培养基I与再生培养基II中再生培养诱导形成胚状体和苗体，选择苗体盆栽得到的抗性植株，再用PCR检测和经凝胶电泳法证实筛选获得阳性植株为转基因植株；所述的双元质粒P3300是在其上的T-DNA区含有八氢番茄红素合成酶基因(PSY)和PPT乙酰转移酶基因 ar)。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的农杆菌菌液是将携带双元质粒 P3300的农杆菌菌株EHA105的单菌落接种于含100mg/l卡那霉素的YEP培养液中J8°C、 160rpm振荡培养12h，当细菌达到对数生长期时，4°C、4000rpm离心收集菌体，重悬于感染培养基，菌液浓度为OD6tltl = 0. 6-0. 8。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的外植体的预培养是取自交系的 8-13d的幼雌穗，表面用75%的酒精消毒，再用0. 1 %的氯化汞浸泡8分钟，无菌水洗3次后挑取幼胚接种在诱导培养基上，24°C条件下暗培养7 IOd后，拔去生长出的微芽，转入新鲜的诱导培养基上，继代2 3周产生I型愈伤组织，继代1 2次后产生II型愈伤组织， 每14d继代1次；取生长旺盛的II型愈伤组织作为农杆菌转化的受体材料；所述的诱导培养基的组成为MS大量50mL+MS微量5mL+B5有机5mL+铁盐5mL+l. 5mg/L2,4-D+500mg/L脯氨酸 +250mg/L 水解酪蛋白 +30g/L 蔗糖 +7g/L 琼脂 +5 μ M/L AgNO3, ρΗ 为 5. 8-6. 2。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的预培养后的外植体共培养，即生长旺盛的外植体接种于制备好的农杆菌菌液中，使外植体与农杆菌充分接触15-20min，再置于含lOOymol/L乙酰丁香酮(acetosyringone，AS)的共培培养基上，25°C下避光培养 3 5天后，将玉米愈伤组织用无菌水冲洗3遍，转入延迟培养基中延迟培养7天； 所述的共培培养基的组成为MS大量50mL+MS微量5mL+B5有机5mL+铁盐5mL+l. 5mg/L2, 4-D+500mg/L 脯氨酸 +250mg/L 水解酪蛋白 +30g/L 蔗糖 +7g/L 琼脂 +500mg/LMES+10g/L 葡萄糖+100 μ mol/LAS+5 μ M/LAgN03, ρΗ 5. 8-6. 2。所述的延迟培养基的组成为=MS大量 50mL+MS微量5mL+B5有机5mL+ 铁盐5mL+l. 5mg/L2,4-D+500mg/L脯氨酸 +250mg/L水解酪蛋白 +30g/L 蔗糖 +7g/L 琼脂 +5mg/L 草甘膦 +400mg/L 头孢霉素 +5 μ M/L AgNO3, ρΗ 5. 8-6. 2。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的筛选是将延迟培养的愈伤组织放入含有5mg/L草甘膦的筛选培养基I中25°C下避光培养筛选两周(低压筛选)。所述的筛选培养基I的组成为MS大量50mL+MS微量5mL+B5有机5mL+铁盐5mL+l. 5mg/L2,4-D+500mg/ L脯氨酸+250mg/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖+7g/L琼脂+5mg/L草甘膦+400mg/L头孢霉素 +5 μ M/LAgN03, ρΗ 5. 8-6. 2 ；然后，将上述新鲜愈伤组织转接到含有10mg/L草甘膦的筛选培养基II (高压筛选) 上25°C下避光培养筛选2-3次，每次2周，得到抗性的愈伤组织。所述的筛选培养基II的组成为MS 大量 50mL+MS 微量 5mL+B5 有机 5mL+ 铁盐 5mL+l. 5mg/L2,4-D+500mg/L 脯氨酸 +250mg/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖+7g/L琼脂+10mg/L草甘膦+400mg/L头孢霉素+5 μ M/ LAgNO3, ρΗ 5. 8-6. 2。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的再生培养是将得到抗性的愈伤组织转入再生I培养基中，在光照条件下，250C，光强为5000LUX，光周期为Wh/8h，诱导胚状体，3周后转入再生培养基II中分化出苗；所述的再生I培养基的组成为MS大量50mL+MS微量5mL+B5有机5mL+铁盐5mL+100mg/L肌醇+60g/L蔗糖+400mg/L头孢霉素+7g/L琼脂， pH 5. 8-6. 2。所述的再生培养基II的组成为MS大量50mL+MS微量5mL+B5有机5mL+铁盐 5mL+100mg/L 肌醇 +30g/L 蔗糖 +400mg/L 头孢霉素 +7g/L 琼脂，pH 5. 8-6. 2。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述PCR检测为从转化抗性植株叶片中提取DNA，以转化植株为阳性对照，野生植株阴性对照，进行PCR，筛选阳性植株PCR 引物为上引 5，-3，GAGCTCGAATTTCCCCGATC ；下引 5，-3，GAATTCCCGATCTAGTAACATAG。
8.一种对转入玉米的Bar基因进行筛选的方法，其特征在于它包括的步骤1)玉米愈伤组织农杆菌遗传转化受体体系的建立取玉米自交系的8-13d的幼雌穗，表面用75%的酒精消毒，再用0. 1 %的氯化汞浸泡8 分钟，无菌水洗3次后挑取幼胚接种在诱导培养基上，24°C条件下暗培养7 IOd后，拔去生长出的微芽，转入新的诱导培养基上，继代2 3周产生I型愈伤组织，继代1 2次后产生II型愈伤组织，每14d继代1次；取生长旺盛的II型愈伤组织作为农杆菌转化的受体材料；2)侵染和共培养挑取玉米胚性愈伤组织，夹碎，于感染菌液中浸泡，并不停振荡。20min后弃去菌液，用滤纸将愈伤组织吸干后置于含lOOymol/L乙酰丁香酮(acetosyringone，AS)的共培培养基上，25°C下避光培养3 5天后，将玉米愈伤组织用无菌水冲洗3遍，转入延迟培养基中延迟培养7天；所述的感染液的制备方法从平板上挑取单菌落接种于YEP培养液中含(100mg/l卡那霉素)，、160rpm振荡培养12h，当细菌达到对数生长期时，4°C、4000rpm离心收集菌体， 重悬于感染培养基，菌液浓度约为0D_ = 0. 6-0. 8 ；3)筛选将上述延迟培养后玉米愈伤组织放入加有5mg/L草甘膦的筛选培养基I上， 25°C避光培养两周，扔掉褐化死亡和水渍化的愈伤组织，将剩余新鲜组织转接到含有IOmg/ L草甘膦的筛选培养基II上，每两周继代一次，继代2-3次，得到抗性愈伤组织；4)再生将得到的抗性愈伤组织转入再生培养基I中在光照条件下(25°C，光强为 5000LUX，光周期为16h/ !)，诱导胚状体，3周后转入再生培养基II中分化出苗；5)移栽待小苗长出3-4片叶子时，打开瓶盖炼苗2-3天，移栽于混有珍珠岩和蛭石 (1 4，质量)的小花盆中，放于温室培养，待小苗在长出3片新叶时即可移栽到地里或大花盆中，得到的抗性植株；6)PCR检测与凝胶电泳法证实从转化抗性植株叶片中提取DNA，以质粒(p3300-35S-PSY)为阳性对照，未转基因植株为阴性对照，水为空白对照，用Nos终止子基因设计引物进行PCR，以确定外源Nos终止子基因是否存在于抗性植株的细胞内，筛选阳性植株PCR 引物为上引 5’ -3，GAGCTCGAATTTCCCCGATC下引 5’ -3，GAATTCCCGATCTAGTAACATAGPCR反应程序为首先，94°C预变性％iin，然后，30个循环循环步骤为94°C变性30s， 55°C退火30s, 72°C延伸40s ；最后，72°C补充延伸8min ；PCR产物经1. 5%琼脂糖凝胶电泳后用凝胶成像仪分析，PCR产物片段大小为277bp ； 上述各步骤中的培养基的组成如权利要求3-6中所定义。
全文摘要
本发明涉及一种对转入玉米的Bar基因进行筛选的方法。包括以下步骤经过预培养的外植体接种于携带双元质粒p3300的农杆菌菌株EHA105的菌液中浸染，侵染后的外植体经共培养、含有草甘膦的筛选培养基I与筛选培养基II中筛选，再依次经过再生培养基I与再生培养基II中再生培养诱导形成胚状体和苗体，选择苗体盆栽得到的抗性植株，再用PCR检测和经凝胶电泳法证实筛选获得阳性植株为转基因植株。本发明采用草甘膦作为筛选剂来进行Bar基因的抗性筛选，极大的提高了筛选效率。
文档编号C12N15/82GK102181475SQ201110051769
公开日2011年9月14日 申请日期2011年3月4日 优先权日2011年3月4日
发明者关春峰, 季静, 汪婷婷, 王罡 申请人:天津大学