专利名称：一种凋落物总dna的提取方法
技术领域：
本发明涉及凋落物分子生物学，具体的说是ー种凋落物总DNA的提取方法。
背景技术：
随着DNA分子标记技术和重组DNA技术的发展，制备完整、纯度高的基因组DNA日益显得重要。我们在进行一个物种DNA水平上的研究时，首先遇到的问题就是如何快速、简单、成本不高的获得较完整、纯度较高的基因组DNA。由于植物细胞与动物细胞不同，具有一层坚硬的细胞壁，且含有较多的多糖、色素、脂质和多酚等物质，给植物DNA提取带来很多困难，特别是多糖和多酚类物质不容易与DNA分开。相对于植物新鲜样品，凋落物中植物的次生代谢产物类含量更高，高质量基因组DNA提取更难。为了去除多糖类物质对后续 研究的干扰，过去采用费事且价格昂贵的氯化铯密度梯度离心技术(Murray M G,ThompsonW F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA[J」· Nucleic Acids Res.,1980,8(19) :4321-4325.) 0从上世纪90年代以来，很多的文献报道过利用CTAB法提取植物基因组DNA(李希臣，雷学钧，卢翠花，等.高效的植物DNA提取方法[J].生物技术，1994,4(3) :39-41.;卢扬江,郑康乐.提取水稻DNA的一种简易方法[J].中国水稻科学，1992,6(1) :47-48.;邹喻苹，汪小全，雷一丁，等.几种濒危植物及其近缘类群总DNA的提取与鉴定[J]·植物学报，1994，36 (7) :528-533. ；Cheng FS, Brown SK, Weeden N F. ADNAextraction protocol from various tissues in woody species[J]. HortScience,1997,32(5) :921-922. ；Edwards K, Johnstone C, Thomson J. A simple and rapid method forthe preparation of plant genomie DNA for PCR analysis[J]. Nucleic Acids Res,1991,19(6) :1349. ；Thomson D, Henry R. Use of DNA from dry leaves for PCRandRAPDanalysis [J]. Plant Molecular Biology Reporter, 1993,11 (3) :202-206.;王军，贺普超.山葡萄基因组DNA提取及RAPD鉴定[J].果树科学，2000，17 (2) :79-82.)，所提取的DNA可用于RAPD，ISSR等标记研究。但是对于凋落物基因组DNA的提取未见报道。
发明内容
本发明目的在于提供ー种凋落物总DNA的提取方法。为实现上述目的，本发明采用技术方案为I)将已研成粉末、预冷的凋落物加入于CTAB提取缓冲液中混匀(Ig 2g粉末加入 500ul 650 μ LCTAB)，于 64-66 °C水浴 5-lOmin ;而后以 12000-13000r · mirT1 离心5-10min，收集沉淀，待用；2)将步骤I)所得沉淀加入到过量的CTAB提取缓冲液混匀，64_66 °C水浴5-10min，待用；3)将步骤2)水浴后沉淀抽提2-4次，抽提过程为将沉淀加入等量的氯仿-异戊醇中混勻，以12000-13000r · mirT1离心5-lOmin,收集上清液；4)将步骤3)抽提后上清液中加入上清液2-2. 5体积的预冷无水こ醇和上清液O. 2-0. 3倍体积的NaAC混匀，静止放置15_30min，而后以10000-12000r · mirT1离心5-10min，所得沉淀，即为凋落物总DNA。所述步骤4)所得凋落物总DNA采用70% (体积分数)こ醇洗涤而后室温干燥，将干燥DNA沉淀溶于去离子水中保存。所述步骤I)凋落物干-40°c或-20°c冰箱冷冻，而后将其于液氮中研成粉末。所述步骤I)和2)水浴时每隔2分钟颠倒混匀缓冲液，所述步骤3)中氯仿-异戊醇，按体积比为24 I混匀。凋落物是指未经化学处理的森林凋落物，包括各种腐叶、树叶。本发明所具有的优点本发明提取方法与传统的CTAB法相比，提取效果比较好，时间短，容易操作。这是因为多酚、单宁、多糖、果胶等次生代谢产物为水溶性物质，弃掉第一次CTAB上清液，就意味着很好的去掉了水溶性的次生代谢产物，而DNA物质大部分在剩余的凋落物中，这样在加入CTAB就可以将DNA溶出。另外在沉淀过程中，将异丙醇沉淀改为无水こ醇沉淀，这样可以防止多酚、单宁、多糖、果胶等次生代谢产物与DNA—起被沉淀。将温度由室温改为冰箱-20°C内，也可以防止DNA在沉淀过程中不被降解。另外缩短离心时间，离心速度(传统的方法为12000r .mirT1,1Omin,降为IOOOOr *min_1, 5min),也可以减少多酹、单宁、多糖、果胶等次生代谢产物与DNA —起被沉淀。
图I为本发明实施例提供的提取牛皮杜鹃凋落物基因组DNA电泳图(未加RNAse处理)。图2为本发明实施例提供的提取笃斯越橘凋落物基因组DNA电泳图(未加RNAse处理)。图3为常规CTAB法提取牛皮杜鹃凋落物基因组DNA电泳图(未加RNAse处理)。
具体实施例方式实施例I利用本方法提取牛皮杜鹃凋落物，同时作4个平行处理，每个平行处理按如下步骤操作I)将取O. 5g牛皮杜鹃的凋落物放入遇冷的研钵中(研钵提前一天放入_40°C或者-20°C冰箱)，加入液氮研磨成粉末(将研钵遇冷之后可以节省液氮的使用量)，取O. 2g粉末迅速转移到含有500 μ L预热到65°C的CTAB提取缓冲液的Eppendorf管中，水浴5min，而后以120001·· π η'δπ η，用移液器吸出上清液，弃掉，收集沉淀，待用。同时水浴过程中每隔2分钟颠倒混匀一次Eppendorf管；所述CTAB提取缓冲液为每升缓冲液中加入其体积百分比2 %的CTAB和OmL β -巯基こ醇，即为CTAB提取缓冲液，其中提取缓冲液为IOOmmol ·じ1Tris-HCl (ρΗ8· O)，I. 4mol · I^1NaCUOmmo I ·じ1 EDTA，20mmol ·じ1 Na2 S2O50同时β_巯基こ醇即加即用。此步骤去掉上清液的目的主要是第一次上清液里含有大量的杂质。提取效果不好。2)将步骤I)所得沉淀加入到过量的CTAB提取缓冲液混匀，65°C水浴5min，待用；同时水浴过程中每隔2分钟颠倒混匀一次Eppendorf管；再次加入CTAB的目的再次加入CTAB，可以提取剩余凋落物样品中的DNA，第二次CTAB可以很好的和DNA结合。3)将步骤2)水浴后沉淀室温冷却而后抽提3次，即为将水浴后沉淀加入500 μ L体积比为24 I的氯仿-异戍醇中，12000r η ηΛδη η。将上清液转移到新的Eppendorf管中，加入450 μ L体积比为24 : I的氯仿-异戍醇中，轻轻混勻，12000r .mirT1, 5min。在将上清液转移到新的Eppendorf管中，加入400 μ L体积比为24 I的氯仿-异戊醇中，轻轻混勻，12000r mirT1, 5min,收集上清液,待用；此步骤加入氯仿-异戍醇进行抽提,可以很好去除蛋白质、脂类、酚类杂质。
4)将上述收集的上清液中加入800 μ L的预冷无水こ醇和20 μ L体积的NaAC，轻轻上下摇动离心管，注意观察有DNA将从溶液中析出。如果DNA含量较少，则出现白色悬浮的DNA颗粒；如果DNA比较多，则出现白色絮状的DNA悬浮于溶液中。_20°C冰箱里静置15min。IOOOOr · mirT1离心5min,离心后小心倒掉上清液,用纸吸取管壁处多余的溶液,保留DNA沉淀于管底，即得到牛皮杜鹃凋落物总DNA。将上述总DNA加入70% (体积分数)こ醇500 μ L洗涤沉淀，振荡起沉淀数秒钟，5000r· mirT1离心2min去上清液。重复洗涤沉淀I次。室温干燥。在见到无色胶状物附在管壁时，加入50 μ L无菌蒸馏水溶解沉淀的DNA。(參见图I)其中电泳条件为I %琼脂糖电泳IOOv 20min,4条带分别表示四个牛皮杜醇的凋落物树叶。此步骤加入无水こ醇和的NaAC(醋酸钠)可以很好的沉淀DNA，防止杂质也随着沉淀。70%こ醇洗涤沉淀目的是去除沉淀中的盐分。一般来讲，RNA不影响DNA的分析，如果需要高质量的DNA，则可以进行纯化。加入RNase 2ul，将 RNA 除去。另外从图I可以看出，利用本发明的方法提取出的牛皮杜鹃DNA杂质少，DNA的率高，没有发生降解。而图3利用传统的CTAB法提取出的牛皮杜鹃DNA杂质高，DNA发生降解，无法满足下游实验需要。实施例2利用本方法提取笃斯越橘凋落物，同时作4个平行处理，每个平行处理按如下步骤操作I)将取O. 5g笃斯越橘的凋落物放入遇冷的研钵中(研钵提前一天放入-20°C冰箱)，加入液氮研磨成粉末(将研钵遇冷之后可以节省液氮的使用量)，取O. 2g粉末迅速转移到含有500 μ L预热到65°C的CTAB提取缓冲液的Eppendorf管中，水浴lOmin，而后以12000r .miniSmin,用移液器吸出上清液，弃掉，收集沉淀，待用。同时水浴过程中姆隔2分钟颠倒混匀一次Eppendorf管；所述CTAB提取缓冲液为姆升缓冲液中加入其体积百分比2%的CTAB和OmL β-巯基こ醇，即为CTAB提取缓冲液，其中提取缓冲液为IOOmmol · L 1Tris-HCl (ρΗ8. O), I. 4mol · L 1NaCUOmmo I · L 1EDTAJOmmol · L 1Na2S2O50 同时巯基こ醇即加即用。此步骤去掉上清液的目的主要是第一次上清液里含有大量的杂质。提取效果不好。 2)将步骤I)所得沉淀加入到过量的CTAB提取缓冲液混匀，65°C水浴5min，待用；同时水浴过程中姆_ 2分钟颠倒混勻一次Eppendorf管；
再次加入CTAB的目的再次加入CTAB，可以提取剩余凋落物样品中的DNA，第二次CTAB可以很好的和DNA结合。3)将步骤2)水浴后沉淀室温冷却而后抽提3次，即为将水浴后沉淀加入500 μ L体积比为24 I的氯仿-异戍醇中，12000r η ηΛδη η。将上清液转移到新的Eppendorf管中，加入450 μ L 体积比为24 : I的氯仿-异戍醇中，轻轻混勻，12000r .mirT1, 5min。在将上清液转移到新的Eppendorf管中，加入400 μ L体积比为24 I的氯仿-异戊醇中，轻轻混勻，12000r · mirT1, 5min,收集上清液,待用；4)将上述步骤收集的上清液中加入800μ L的预冷无水こ醇和20μ L体积的NaAC,轻轻上下摇动离心管，注意观察有DNA将从溶液中析出。如果DNA含量较少，则出现白色悬浮的DNA颗粒；如果DNA比较多，则出现白色絮状的DNA悬浮于溶液中。_20°C冰箱里静置15min。IOOOOr · mirT1离心5min,离心后小心倒掉上清液,用纸吸取管壁处多余的溶液，保留DNA沉淀于管底，即得到牛皮杜鹃凋落物总DNA。将上述总DNA加入70% (体积分数)こ醇500 μ L洗涤沉淀，振荡起沉淀数秒钟，5000r· mirT1离心2min去上清液。重复洗涤沉淀I次。室温干燥。在见到无色胶状物附在管壁时，加入50 μ L无菌蒸馏水溶解沉淀的DNA。(參见图2)。按照本实施方式操作可以保证反应均匀且充分，提高植物DNA的提取质量。实施例3利用本方法提取长白落叶松凋落物，同时作4个平行处理，每个平行处理按如下步骤操作I)将取O. 5g长白落叶松的凋落物放入遇冷的研钵中(研钵提前一天放入_20°C冰箱)，加入液氮研磨成粉末(将研钵遇冷之后可以节省液氮的使用量)，取O. 2g粉末迅速转移到含有500 μ L预热到65°C的CTAB提取缓冲液的Eppendorf管中，水浴5min，而后以12000r .miniSmin,用移液器吸出上清液，弃掉，收集沉淀，待用。同时水浴过程中姆隔2分钟颠倒混匀一次Eppendorf管；所述CTAB提取缓冲液为姆升缓冲液中加入其体积百分比2 %的CTAB和OmL β -巯基こ醇，即为CTAB提取缓冲液，其中提取缓冲液为IOOmmol · L 1Tris-HCl(ρΗ8. O)，I. 4mol · L 1NaCl,20mmol · L 1 EDTA,20mmol · L 1Na2S2O50 同时巯基こ醇即加即用。此步骤去掉上清液的目的主要是第一次上清液里含有大量的杂质。提取效果不好。2)将步骤I)所得沉淀加入到过量的CTAB提取缓冲液混匀，65°C水浴IOminJt用；同时水浴过程中姆隔2分钟颠倒混勻一次Eppendorf管；再次加入CTAB的目的再次加入CTAB，可以提取剩余凋落物样品中的DNA，第二次CTAB可以很好的和DNA结合。3)将步骤2)水浴后沉淀室温冷却而后抽提3次，即为将水浴后沉淀加入500 μ L体积比为24 I的氯仿-异戍醇中，12000r η ηΛδη η。将上清液转移到新的Eppendorf管中，加入450 μ L体积比为24 : I的氯仿-异戍醇中，轻轻混勻，12000r .mirT1, 5min。在将上清液转移到新的Eppendorf管中，加入400 μ L体积比为24 I的氯仿-异戊醇中，轻轻混勻，12000r · mirT1, 5min,收集上清液,待用；4)将上述步骤收集的上清液中加入800μ L的预冷无水こ醇和20μ L体积的NaAC,轻轻上下摇动离心管，注意观察有DNA将从溶液中析出。如果DNA含量较少，则出现白色悬浮的DNA颗粒；如果DNA比较多，则出现白色絮状的DNA悬浮于溶液中。_20°C冰箱里静置15min。IOOOOr · mirT1离心5min,离心后小心倒掉上清液,用纸吸取管壁处多余的溶液，保留DNA沉淀于管底，即得到牛皮杜鹃凋落物总DNA。将上述总DNA加入70% (体积分数)こ醇500 μ L洗涤沉淀，振荡起沉淀数秒钟，5000r· mirT1离心2min去上清液。重复洗涤沉淀I次。室温干燥。在见到无色胶状物附在管壁时，加入50 μ L无菌蒸馏水溶解沉淀的DNA。(參见图2)。按照本实施方式操作可以保证反应均匀且充分，使DNA和CTAB的结合更充分。实施例4利用本方法提取水曲柳凋落物，同时作4个平行处理，每个平行处理按如下步骤 操作I)将取O. 5g水曲柳的凋落物放入遇冷的研钵中(研钵提前一天放入_40°C或者-20°C冰箱)，加入液氮研磨成粉末(将研钵遇冷之后可以节省液氮的使用量)，取O. 2g粉末迅速转移到含有500 μ L预热到65°C的CTAB提取缓冲液的Eppendorf管中，水浴5min，而后以120001·· π η'δπ η，用移液器吸出上清液，弃掉，收集沉淀，待用。同时水浴过程中每隔2分钟颠倒混匀一次Eppendorf管；所述CTAB提取缓冲液为每升缓冲液中加入其体积百分比2 %的CTAB和OmL β -巯基こ醇，即为CTAB提取缓冲液，其中提取缓冲液为IOOmmol · L 1Tris-HCl(ρΗ8. O)，I. 4mol · L 1NaCl,20mmol · L 1 EDTA,20mmol · L 1Na2S2O50 同时巯基こ醇即加即用。此步骤去掉上清液的目的主要是第一次上清液里含有大量的杂质。提取效果不好。 2)将步骤I)所得沉淀加入到过量的CTAB提取缓冲液混匀，65°C水浴5min，待用；同时水浴过程中姆_ 2分钟颠倒混勻一次Eppendorf管；再次加入CTAB的目的再次加入CTAB，可以提取剩余凋落物样品中的DNA，第二次CTAB可以很好的和DNA结合。3)将步骤2)水浴后沉淀室温冷却而后抽提3次，即为将水浴后沉淀加入500 μ L体积比为24 I的氯仿-异戍醇中，13000r mirT1, IOmin0将上清液转移到新的Eppendorf管中，加入450 μ L体积比为24 : I的氯仿-异戍醇中，轻轻混勻，13000r · mirT1, lOmin。在将上清液转移到新的Eppendorf管中，加入400 μ L体积比为24 I的氯仿-异戊醇中，轻轻混勻，13000r · mirT1, lOmin,收集上清液,待用；此步骤加入氯仿-异戊醇进行抽提，可以很好去除蛋白质、脂类、酚类杂质。4)将上述步骤收集的上清液中加入800μ L的预冷无水こ醇和20μ L体积的NaAC,轻轻上下摇动离心管，注意观察有DNA将从溶液中析出。如果DNA含量较少，则出现白色悬浮的DNA颗粒；如果DNA比较多，则出现白色絮状的DNA悬浮于溶液中。_20°C冰箱里静置15min。IOOOOr · mirT1离心5min,离心后小心倒掉上清液,用纸吸取管壁处多余的溶液，保留DNA沉淀于管底，即得到牛皮杜鹃凋落物总DNA。将上述总DNA加入70% (体积分数)こ醇500 μ L洗涤沉淀，振荡起沉淀数秒钟，5000r· mirT1离心2min去上清液。重复洗涤沉淀I次。室温干燥。在见到无色胶状物附在管壁时，加入50 μ L无菌蒸馏水溶解沉淀的DNA。
按照本实施方式操作可以保证溶液中物质充分分层，进一歩去除胚中蛋白和多糖等杂质。实施例5提取红松凋落物本实施方式与具体实施方式
一的不同点是步骤四中加入上清液2. 5体积的预冷无水こ醇和上清液O. 3倍体积的NaAC混匀，静止30min。其它步骤及參数与实施方式一相同。利用本方法提取红松凋落物，同时作4个平行处理，每个平行处理按如下步骤操作I)将取O. 5g红松的凋落物放入遇冷的研钵中(研钵提前一天放入-40°C或者-20°C冰箱)，加入液氮研磨成粉末(将研钵遇冷之后可以节省液氮的使用量)，取O. 2g粉末迅速转移到含有500 μ L预热到65°C的CTAB提取缓冲液的Eppendorf管中，水浴5min， 而后以120001·· π η'δπ η，用移液器吸出上清液，弃掉，收集沉淀，待用。同时水浴过程中每隔2分钟颠倒混匀一次Eppendorf管；所述CTAB提取缓冲液为每升缓冲液中加入其体积百分比2 %的CTAB和OmL β -巯基こ醇，即为CTAB提取缓冲液，其中提取缓冲液为IOOmmol · L 1Tris-HCl (ρΗ8. O), I. 4mol · L 1NaCl, 20mmol · L 1EDTAJOmmol · L 1Na2S2O50 同时巯基こ醇即加即用。此步骤去掉上清液的目的主要是第一次上清液里含有大量的杂质。提取效果不好。2)将步骤I)所得沉淀加入到过量的CTAB提取缓冲液混匀，65°C水浴5min，待用；同时水浴过程中姆_ 2分钟颠倒混勻一次Eppendorf管；再次加入CTAB的目的再次加入CTAB，可以提取剩余凋落物样品中的DNA，第二次CTAB可以很好的和DNA结合。3)将步骤2)水浴后沉淀室温冷却而后抽提3次，即为将水浴后沉淀加入500 μ L体积比为24 I的氯仿-异戍醇中，12000r .mirTSSmino将上清液转移到新的Eppendorf管中，加入450 μ L体积比为24 : I的氯仿-异戍醇中，轻轻混勻，12000r .mirT1, 5min。在将上清液转移到新的Eppendorf管中，加入400 μ L体积比为24 I的氯仿-异戊醇中，轻轻混勻，12000r · mirT1, 5min,收集上清液,待用；此步骤加入氯仿-异戊醇进行抽提，可以很好去除蛋白质、脂类、酚类杂质。4)将上述步骤上清液中加入上清液2. 5体积的预冷无水こ醇和上清液O. 3倍体积 的NaAC混匀，轻轻上下摇动离心管，注意观察有DNA将从溶液中析出。如果DNA含量较少，则出现白色悬浮的DNA颗粒；如果DNA比较多，则出现白色絮状的DNA悬浮于溶液中。-20°C冰箱里静置30min。IOOOOr · mirT1离心5min，离心后小心倒掉上清液，用纸吸取管壁处多余的溶液，保留DNA沉淀于管底，即得到牛皮杜鹃凋落物总DNA。将上述总DNA加入70% (体积分数)こ醇500 μ L洗涤沉淀，振荡起沉淀数秒钟，5000r· mirT1离心2min去上清液。重复洗涤沉淀I次。室温干燥。在见到无色胶状物附在管壁时，加入50 μ L无菌蒸馏水溶解沉淀的DNA。按照本实施方式操作可以有效的沉淀DNA，提高胚DNA的得率。对比实施例I试验常规CTAB法提取凋落物DNA I、将牛皮杜鹃凋落物叶片放入液氮预冷的研钵中，在液氮中研碎，收集到2ml离心管中，装入的组织少于1/2离心管。2、向装有材料的离心管加入预热的CTAB提取液(和本发明所用的提取液ー样)，置于60°C水浴O. 5h。3、加等体积的氯仿-异戊醇，轻轻混匀。4、室温IOOOOrpm,离心IOmin,将上清液移至新的离心管。5、重复步骤2、3。5、每个样品中加样品2/3体积的异丙醇，轻轻摇匀，等待沉淀，甚至可以过夜。6、取出样品,8000rpm离心2min,弃去上清。 7、用洗涤缓冲液洗涤两次，至少20min。8、2000rpm 离心 lOmin,弃去上清。9、自然风干或真空抽干DNA样品。10、将DNA重悬在适量I X TE中，-20°C保存(參见图3)。其中电泳条件为1%琼脂糖电泳 IOOv 20min。
权利要求
1.一种凋落物总DNA的提取方法，其特征在于 1)将已研成粉末、预冷的凋落物加入于CTAB提取缓冲液中混匀，于64-66°C水浴5-10min ;而后以 12000-13000r mirT1 离心 5-lOmin，收集沉淀，待用； 2)将步骤I)所得沉淀加入到过量的CTAB提取缓冲液混匀，64-66°C水浴5-10min，待用； 3)将步骤2)水浴后沉淀抽提2-4次，抽提过程为将沉淀加入等量的氯仿-异戊醇中混勻，以 12000-13000r mirT1 离心 5-lOmin,收集上清液；4)将步骤3)抽提后上清液中加入上清液2-2.5体积的预冷无水乙醇和上清液0.2-0. 3倍体积的NaAC混匀，静止放置15_30min，而后以10000_12000r mirT1离心5-10min，所得沉淀，即为凋落物总DNA。
2.按权利要求I所述的凋落物总DNA的提取方法，其特征在于所述步骤4)所得凋落物总DNA采用70%乙醇洗涤而后室温干燥，将干燥DNA沉淀溶于去离子水中保存。
3.按权利要求I所述的凋落物总DNA的提取方法，其特征在于所述步骤I)凋落物于-40°C或-20°C冰箱冷冻，而后将其于液氮中研成粉末。
4.按权利要求I所述的凋落物总DNA的提取方法，其特征在于所述步骤I)和2)水浴时每隔2分钟颠倒混匀缓冲液。
5.按权利要求I所述的凋落物总DNA的提取方法，其特征在于所述步骤3)中氯仿-异戊醇，按体积比为24 I混匀。
全文摘要
本发明涉及凋落物分子生物学，具体的说是一种凋落物总DNA的提取方法。将已研成粉末、预冷的凋落物加入于CTAB提取缓冲液中混匀，于64-66℃水浴5-10min；而后以12000-13000r·min-1离心5-10min，收集沉淀，待用；将步骤1)所得沉淀加入到过量的CTAB提取缓冲液混匀，64-66℃水浴5-10min，待用；将步骤2)水浴后沉淀抽提2-4次，抽提过程为将沉淀加入等量的氯仿-异戊醇中混匀，以12000-13000r·min-1离心5-10min，收集上清液；将步骤3)抽提后上清液中加入上清液2-2.5体积的预冷无水乙醇和上清液0.2-0.3倍体积的NaAC混匀，静止放置15-30min，而后以10000-12000r·min-1离心5-10min，所得沉淀，即为凋落物总DNA。本发明提取方法与传统的CTAB法相比，提取效果比较好，时间短，容易操作。
文档编号C12N15/10GK102676496SQ20111006243
公开日2012年9月19日 申请日期2011年3月15日 优先权日2011年3月15日
发明者冯富娟, 隋心, 韩士杰 申请人:中国科学院沈阳应用生态研究所