专利名称：一种柑橘全爪螨微卫星富集文库的构建方法
技术领域：
本发明涉及植物保护和生物技术领域，特别是涉及一种柑橘全爪螨微卫星富集文库的构建方法。
背景技术：
柑橘全爪螨是一种世界性分布的柑橘害螨，在我国各柑橘产区均有分布，也是世界范围内大多数柑橘种植区的第一大害螨。目前，生产中对柑橘全爪螨的控制，多种方法并举，但仍以化学防治为主。化学杀螨剂大量、持续、不科学使用不可避免地导致柑橘全爪螨对多种杀螨剂产生了抗性，严重威胁着橘园害虫(螨)的可持续控制。然而，解决害虫(螨) 问题的合理答案必须以害虫遗传学和进化策略的研究为基础，这些方面的研究与害虫(螨) 的生物学和生态学的研究同样重要。但至今对柑橘全爪螨种群遗传多样性及种群结构的研究，全世界均非常少，这很大程度上是由于缺少有效的分子遗传标记。微卫星是当今种群遗传与进化研究中应用最为广泛的分子遗传标记之一，但由于微卫星标记具有物种特异性，故针对任一物种的微卫星研究，必须首先获知该物种的微卫星DNA序列，即进行位点筛选。微卫星位点筛选及其引物的获得是微卫星标记研究的第一步，也是最为关键、耗时而复杂的一步。众多研究迟迟不能开展最主要的一个原因就是早期筛选微卫星标记的投入时间及成本相对较大，且获得的可用标记较少。通常，微卫星位点筛选策略主要有以下四种一是构建小插入片段基因组文库的传统经典方法；二是构建微卫星富集文库筛选微卫星标记；三是从公共数据库中筛选微卫星位点；四是利用近缘物种间引物的通用性，从而获得目的物种的微卫星引物。传统经典方法微卫星阳性克隆率低，在节肢动物中通常为21左右，而利用公共数据库进行微卫星位点筛选，往往仅限于DNA数据较多的一些模式生物。此外，直接利用近缘物种的微卫星引物，位点的多态性往往不好，甚至有时扩增出来的根本不是微卫星DNA序列，从而影响结果的准确性。研究表明，与鳞翅目昆虫相似，蜱螨基因组中微卫星丰富度与脊椎动物相比比较稀少。例如，采用传统经典方法仅从二斑叶螨基因组中筛选到3个多态性微卫星位点；而通过磁珠富集构建微卫星富集文库，筛选到了 16个二斑叶螨微卫星多态性位点。可见能否从蜱螨基因组中成功筛选出较多的微卫星DNA序列，选择高效的位点筛选策略无疑是极为关键的。由于柑橘全爪螨为非模式生物，GenBank中的DNA序列数据还非常少，这就无法从公共数据库中筛选其微卫星位点。已有二斑叶螨的微卫星引物，也很难在柑橘全爪螨中获得成功。因此，有必要采用磁珠富集法构建柑橘全爪螨微卫星富集文库、开发有效的微卫星标记，这对于研究该螨的种群遗传结构、明确种群动态及基因流动的范围和方式，进而制定科学的防治策略具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于建立一种有效的柑橘全爪螨微卫星富集文库的构建方法，并开发可用于柑橘全爪螨种群遗传与进化研究的微卫星标记。该方法的技术思路是采用磁珠富集法，集成已报道的微卫星位点筛选策略，通过基因组DNA提取、酶切、接头连接、磁珠富集及文库构建等一系列步骤，建立柑橘全爪螨微卫星富集文库。基因组DNA酶切后，立即与特异性接头进行连接，而未对酶切后的片段进行选择性胶回收。通过将酶切、接头连接一步化，减少了酶切产物的损失，提高了酶切产物的量；这对于个体微小、提取的基因组DNA量较少、基因组中微卫星DNA序列含量稀少的柑橘全爪螨等微小昆虫及螨类而言，显得非常必要。本发明通过以下步骤实现
提取柑橘全爪螨高分子量的的基因组DNA，采用或i&el进行酶切，酶切后，立即与特异性接头进行连接；PCR扩增检测酶切及接头连接是否成功，并选择性回收400-700 bp的片段，然后进行磁珠富集；采用PCR扩增将富集的单链微卫星片段转换为双链DNA，并回收400-700 bp的片段，最后转化大肠杆菌，构建成微卫星富集文库；菌落PCR检测富集文库的微卫星阳性克隆并测序。具体步骤如下
(1)采用CTAB (2% CTAB, 100 mM Tris-HCl [pH 8. 0], 20 mM EDTA, 1. 42 M NaCl, 0. 2 % β -巯基乙醇)提取柑橘全爪螨高分子量的基因组DNA，采用或i&el在37°C 下对基因组DNA进行酶切；
(2)酶切片段在T4DNA连接酶(10 U/yL, !Iomega)的作用下与特异性的人工接头进行连接，从而得到接头-酶切DNA ；
(3 )将标记有生物素的寡核苷酸探针与磁珠(10 mg/mL, Dynalbeads M-280 Streptavidin, Invitrogen)混合，形成探针-磁珠混合物；探针-磁珠与接头_酶切DNA 在55-65°C下预杂交30 min，60-70°C下杂交180 min，55_68°C下洗脱10 min，最后将富集有微卫星的磁珠悬浮于50 μ L的无菌双蒸水中；
(4)以悬浮于双蒸水中的磁珠为模板进行PCR扩增，将单链DNA转变为双链；
(5)PCR扩增产物采用凝胶回收试剂盒进行回收，回收产物溶于20μ L的双蒸水中；将微卫星富集产物经纯化后，与克隆载体连接，转化大肠杆菌，构建柑橘全爪螨微卫星富集文库；
(6)将回收纯化的微卫星PCR富集产物与pGEM-TEasy载体在22°C下连接1小时，转化大肠杆菌，构建柑橘全爪螨微卫星AC-富集文库；
(7)菌落PCR检测富集文库的微卫星阳性克隆并测序。上述方法步骤(2)所述的特异性的人工接头是指
Oligo A 5 ‘ -GGCCAGAGACCCCAAGCTTCG-3' 禾口 Oligo B 5 ‘-P04-GATCCGAAGCTTGGGGTCTCTGGCC-3’ 或
MseI-A 5' -TACTCAGGACTCAT-3‘禾Πi&eI-B 5‘ -GACGATGAGTCCTGAG-3’ 步骤(3)所述的标记有生物素的寡核苷酸探针是指仏012或(ATG)8。本发明的优点是
该方法采用磁珠富集法，并将酶切和接头连接一步化，可成功构建柑橘全爪螨微卫星富集文库。实验数据显示，通过对已有方法的集成及改进，微卫星阳性克隆率达30%以上。 已有的螨类微卫星研究，其阳性克隆率通常在10%左右。因此，本方法特别适合于开发柑橘全爪螨等微小昆虫及螨类的微卫星标记。此外，该方法简便易行，无污染，不需要特别的实验仪器，一般实验室均可成功开展。
具体实施例方式实施例1
(1)采用CTAB(2% CTAB, 100 mM Tris-HCl [pH 8. 0], 20 mM EDTA, 1. 42 M NaCl, 0.2 % β-巯基乙醇)提取柑橘全爪螨高分子量的基因组DNA，用fei/ 3AIC10 U/μ 1, Promega ) 在37 °C下对基因组DNA进行酶切；
(2)酶切片段在T4DNA连接酶(10 U/yL, !Iomega)的作用下与特异性的人工接头 (Oligo A :5’ -GGCCAGAGACCCCAAGCTTCG-3’ 和 Oligo B :5’ - P04-GATCCGAAGCTTGGGGTCTCT GGCC-3’ )进行连接，从而得到接头-酶切DNA ；
(3)将标记有生物素的寡核苷酸探针(AC)12与磁珠(10mg/mL, Dynalbeads M-280 Streptavidin, Invitrogen)混合，形成探针-磁珠混合物；探针-磁珠与接头_酶切DNA 在65°C下预杂交30 min，70°C下杂交180 min，68°C下洗脱10 min，最后将富集有微卫星的磁珠悬浮于50 μ L的无菌双蒸水中；
(4)以悬浮于双蒸水中的磁珠作为模板，以OligoA作为引物进行PCR扩增，将单链DNA 转变为双链，并提高富集产物的浓度；
(5)PCR扩增产物采用凝胶回收试剂盒(华舜，上海)进行回收，回收产物溶于20μ L的双蒸水中；将微卫星富集产物经纯化后，与克隆载体连接，转化大肠杆菌，构建柑橘全爪螨微卫星富集文库；
(6)将回收纯化的微卫星PCR富集产物与pGEM-TEasy载体在22°C下连接1小时，转化大肠杆菌，构建柑橘全爪螨微卫星AC-富集文库；
(7)以OligoA和(AC)12为引物，采用PCR法筛选微卫星阳性克隆，出现两条带及以上的克隆即可能含有微卫星序列，并对这些阳性克隆进行测序。实施例2:
(1)采用CTAB (2% CTAB, 100 mM Tris-HCl [pH 8. 0], 20 mM EDTA, 1. 42 M NaCl, 0.2 % 巯基乙醇)提取柑橘全爪螨高分子量的基因组DNA，用i&el (10 U/μ 1, NEB)在 37 °C下对基因组DNA进行酶切；
(2)酶切片段在T4DNA连接酶(10 U/yL, !Iomega)的作用下与特异性的人工接头 (MseI-A :5，-TACTCAGGACTCAT-3，和i&el-B :5，-GACGATGAGTCCTGAG-3，)进行连接，从而得到接头-酶切DNA ；
(3)将标记有生物素的寡核苷酸探针(ATG)8与磁珠(10mg/mL, Dynalbeads M-280 Streptavidin, Invitrogen)混合，形成探针-磁珠混合物；探针-磁珠与接头_酶切DNA 在55°C下预杂交30 min，60°C下杂交180 min，55°C下洗脱10 min，最后将富集有微卫星的磁珠悬浮于50 μ L的无菌双蒸水中；
(4)以悬浮于双蒸水中的磁珠作为模板，WifeeI-N(5’ -GATGAGTCCTGAGTAAN-3’)作为引物进行PCR扩增，将单链DNA转变为双链，并提高富集产物的浓度；
(5)PCR扩增产物采用凝胶回收试剂盒(华舜，上海)进行回收，回收产物溶于20μ L的双蒸水中；将微卫星富集产物经纯化后，与克隆载体连接，转化大肠杆菌，构建柑橘全爪螨微卫星富集文库；
(6)将回收纯化的微卫星PCR富集产物与pGEM-TEasy载体在22°C下连接1小时，转化大肠杆菌，构建柑橘全爪螨微卫星ATG-富集文库；
(7)以M13通用引物和(ATG)8探针作为引物，采用PCR法筛选微卫星阳性克隆，出现两条带及以上的克隆即可能含有微卫星序列，并对这些阳性克隆进行测序。
权利要求
1.一种柑橘全爪螨微卫星富集文库的构建方法，其特征在于，提取柑橘全爪螨高分子量的的基因组DNA，采用或i&el进行酶切，酶切后，立即与特异性接头进行连接； PCR扩增检测酶切及接头连接是否成功，并选择性回收400-700 bp的片段，然后进行磁珠富集；采用PCR扩增将富集的单链微卫星片段转换为双链DNA，并回收400-700 bp的片段， 最后转化大肠杆菌，构建成微卫星富集文库；菌落PCR检测富集文库的微卫星阳性克隆并测序。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法的具体步骤如下(1)采用CTAB (2% CTAB, 100 mM Tris-HCl [pH 8. 0], 20 mM EDTA, 1. 42 M NaCl, 0.2 % β-巯基乙醇)提取柑橘全爪螨高分子量的基因组DNA，采用或i&el在37°C 下对基因组DNA进行酶切；(2)酶切片段在T4DNA连接酶(10 U/yL, !Iomega)的作用下与特异性的人工接头进行连接，从而得到接头-酶切DNA ；(3 )将标记有生物素的寡核苷酸探针与磁珠(10 mg/mL, Dynalbeads M-280 Streptavidin, Invitrogen)混合，形成探针-磁珠混合物；探针-磁珠与接头_酶切DNA 在55-65°C下预杂交30 min，60-70°C下杂交180 min，55_68°C下洗脱10 min，最后将富集有微卫星的磁珠悬浮于50 μ L的无菌双蒸水中；(4)以悬浮于双蒸水中的磁珠为模板进行PCR扩增，将单链DNA转变为双链；(5)PCR扩增产物采用凝胶回收试剂盒进行回收，回收产物溶于20μ L的双蒸水中；将微卫星富集产物经纯化后，与克隆载体连接，转化大肠杆菌，构建柑橘全爪螨微卫星富集文库；(6)将回收纯化的微卫星PCR富集产物与pGEM-TEasy载体在22°C下连接1小时，转化大肠杆菌，构建柑橘全爪螨微卫星AC-富集文库；(7)菌落PCR检测富集文库的微卫星阳性克隆并测序。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述的特异性的人工接头是指Oligo A 5' -GGCCAGAGACCCCAAGCTTCG-3 ‘ 和 Oligo B 5 ‘-P04-GATCCGAAGCTTGGGGTCTCTGGCC-3’ 或MseI-A 5' -TACTCAGGACTCAT-3‘禾Πi&eI-B 5‘ -GACGATGAGTCCTGAG-3’步骤(3)所述的标记有生物素的寡核苷酸探针是指仏012或(ATG)8。
全文摘要
一种柑橘全爪螨微卫星富集文库的构建方法，采用磁珠富集法，集成已报道的微卫星位点筛选策略，通过基因组DNA提取、酶切、接头连接、磁珠富集及文库构建等一系列步骤，建立柑橘全爪螨微卫星富集文库。该方法将酶切和接头连接一步化，可成功构建柑橘全爪螨微卫星富集文库，微卫星阳性克隆率从10%提高到30%以上。因此，本方法特别适合于开发柑橘全爪螨等微小昆虫及螨类的微卫星标记。此外，该方法简便易行，无污染，不需要特别的实验仪器，一般实验室均可成功开展。
文档编号C12N15/10GK102174714SQ20111006390
公开日2011年9月7日 申请日期2011年3月17日 优先权日2011年3月17日
发明者王保军, 王进军, 袁明龙, 豆威, 魏丹丹 申请人:西南大学