专利名称：一种海洋链霉菌及利用其制备星形孢菌素和K-252d的方法
技术领域：
本发明涉及一种海洋链霉菌(Sti^ptomyces sp. ) SCSI01667，及利用该菌制备抗肿瘤化合物星形孢霉素(staurosporine)和K_252d的方法。
背景技术：
人类面临的众多问题中疾病的威胁尤为严重，上世纪来源于放线菌的放线菌素D， 道诺红菌素，丝裂霉素，四环素和万古霉素等微生物次级代谢产物在对抗疾病的方面起了极为重要的作用。但随着耐药性病原菌的增加，必须开发新药和寻找新的药用资源。星形孢菌素(staurosporine，CASNo. 62996-74-1)，其结构如式(1)所示； K-252d(CASNo. 105114-22-5)，其结构如式(2)所示，两者都属于吲哚并咔唑类生物碱。 星形孢菌素最初发现于Mi^ptomyces staurosporeus (AM-2282)菌株的发酵产物中，K-252d发现于Nocardiopsis sp. (K-290)菌株的发酵产物中。星形孢菌素和K_252d具有抗细菌，抗真菌，降血压，血小板凝聚，抗肿瘤以及神经保护等多种生物活性，尤其是作为蛋白激酶C的有效抑制剂，在治疗癌症方面极具研究开发的价值。本发明的第一个目的在于提供一种能够生产抗肿瘤化合物星形孢菌素和K_252d 的海洋链霉菌(Sti^ptomyces sp.) SCSI01667，该菌于2010年11月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3 号，中国科学院微生物研究所，保藏编号=CGMCC No. 4360。本发明的海洋链霉菌(Sti^ptomyces sp. ) SCSI01667是从我国南海海底沉积物中分离得到的。该菌株的分类学特征是
HN式(1)
式⑵
发明内容
菌落干燥，单菌落一般呈圆形，较小，较紧密，不易扩散，中间凸起，基内菌丝与气生菌丝结合紧密不易挑起，末期产孢子后，孢子易刮取。在ISP2培养基上菌落白色，基内菌丝褐色，后期菌落灰白色；在ISP3培养基上，菌落白色，边缘稍微呈辐射状，菌落紧密，中间凸起，较厚，基内菌丝颜色较淡，后期菌落灰色，向四周扩散，粉状孢子，基内菌丝黄褐色；在 M-ISP4培养基上菌落白色，菌丝体较厚，中间凸起，基内菌丝周围灰褐色，后期菌落灰色， 粉状孢子，基内菌丝黄褐色；在Nutrient Agar培养基上气生菌丝白色，基内菌丝周围黑褐色，此培养基上长势较差；在MJNP2培养基上，菌落白色，基内菌丝周围黑褐色，后期菌落黑褐色，基内菌丝黄褐色，菌落边缘出现黑色。在以上培养基上，末期均产生灰色孢子。初步鉴定属于链霉属的一个种，定名为海洋链霉菌(Sti^ptomyces sp.)SCSI01667，该菌于2010 年11月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)Jia 北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号=CGMCC No. 4360。本发明的第二个目的是提供利用海洋链霉菌(Sti^ptomyces sp. ) SCSI01667 制备星形孢菌素和K-252d的方法，其特征在于，星形孢菌素和K-252d是从海洋链霉菌 (Streptomyces sp.) SCSI01667的发酵培养物中制备得到的。优选所述的利用海洋链霉菌(Sti^ptomyces sp. ) SCSI01667制备星形孢菌素和 K-252d的方法具体包括以下步骤(1)制备海洋链霉菌(Sti^ptomyces sp. ) SCSI01667的发酵培养物，将发酵培养物离心，取上清液；(2)上清液上大孔吸附树脂柱，先用3倍柱体积的去离子水洗脱，再用体积分数为95%的乙醇水溶液洗脱，体积分数为95%的乙醇水溶液的洗脱液浓缩得浸膏，浸膏经硅胶柱层析，以氯仿-甲醇为洗脱剂从体积比10 O 8 2梯度洗脱，收集氯仿-甲醇体积比为96 4洗脱的馏分A，收集氯仿-甲醇体积比为9 1洗脱的馏分B，馏分A浓缩后再经正相硅胶柱层析，以乙酸乙酯-石油醚体积比7 4洗脱，得到化合物星形孢菌素；馏分B经正相硅胶柱层析，以氯仿-甲醇为洗脱剂从体积比10 O 88 12梯度洗脱，收集氯仿-甲醇体积比为94 6 93 7洗脱的馏分，浓缩再经反相硅胶柱层析，以水-甲醇为洗脱剂从体积比75 25 O 100梯度洗脱，收集水-甲醇体积比为3 7洗脱的馏分，得到K-252d。所述的制备海洋链霉菌(Sti^ptomyces sp. ) SCSI01667的发酵培养物优选通过以下方法制备将海洋链霉菌(Sti^ptomyces sp. ) SCSI01667接入种子培养基中，于培养 M 48小时，得到种子培养液，将种子培养液按体积比为1 20 1 9的比例接入发酵培养基中，于培养144 240小时，得到的海洋链霉菌(Sti^ptomyces sp.) SCSI01667 的发酵培养物；所述种子培养基每升含有可溶性淀粉10g，K2HPO4 lg, MgSO4 · 7H20 lg，(NH4)2SO4 2g，CaCO3 2g，蛋白胨lg，酵母提取物0. 5g，海盐30g，余量为水，pH7. 2 7. 4 ；所述发酵培养基每升含有大豆粉10g，可溶性淀粉20g，酵母提取物5g，蛋白胨 2g，CaCO3 2g，NaCl 4g，余量为水，pH 7. O 7. 4。本发明的海洋链霉菌(Sti^ptomyces sp. ) SCSI01667能够产生抗肿瘤化合物星形孢菌素和K-252d，利用本发明的星形孢菌素和K-252d的制备方法可以从海洋链霉菌(Sti^ptomyces sp.) SCSI01667的发酵培养物中制备得到抗肿瘤化合物星形孢菌素和 K-252d，从而为星形孢菌素和K-252d的生产制备开辟了一条新的道路。本发明的链霉菌(Sti^ptomyces sp. ) 1667于2010年11月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3 号，中国科学院微生物研究所，保藏编号=CGMCC No. 4360。
图1是实施例1中的海洋链霉菌(Sti^ptomyces sp. ) SCSI01667的发酵培养物的 HPLC的图谱，其中1为星形孢菌素，2为K-252d。
具体实施例方式以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。实施例1 1.种子培养(1)配制种子培养基将可溶性淀粉 8g，K2HPO4 0. 8g，MgSO4 · 7H20 0. 8g，(NH4) 2S04 1.6g，CaCO3 1.6g，蛋白胨0.8g，酵母提取物0.4g，海盐24g溶于800mL自来水中，调节 pH7. 2，平均分装于16个250mL锥形瓶中，每瓶装有50mL的种子培养基，121°C灭菌30分钟。(2)种子的培养将海洋链霉菌(Sti^ptomyces sp. ) SCSI01667接入种子培养基， 置于的摇床上，以200rpm的转速，培养32小时得种子培养液。2.发酵培养(1)配制发酵培养基将大豆粉72g，可溶性淀粉144g，酵母提取物36g，蛋白胨 14. 4g, CaCO3 14. 4g, NaCl沘.8g溶于7200mL自来水中，调节pH 7. 2，平均分装于16个2L 的锥形瓶中，每瓶装有450mL的发酵培养基，121°C灭菌30分钟。(2)发酵培养将上述一瓶250mL锥形瓶中的50mL种子培养液加入到一个装有450mL的发酵培养基的2L锥形瓶中，置于28 V的摇床，以200rpm的转速，培养192小时，获得海洋链霉菌 (Streptomyces sp.) SCSIO 1667 的发酵培养物。3.产物分析取上述海洋链霉菌(Sti^ptomyces sp. ) SCSI01667的发酵培养物25mL，加两倍体积丁酮，搅拌1小时，静置后取上层有机相，减压浓缩蒸干后，用500yL甲醇溶解，1200rpm 离心lOmin，转出上清液再次1200rpm离心lOmin，以5 15 μ L的进样量，用HPLC分析。色谱条件柱温室温；洗脱剂Α相为乙腈-水-冰醋酸(体积比15 85 0. 1)，Β相为乙腈-水-冰醋酸(体积比80 20 0. 1)，利用程序设定梯度，0-20min内B相由0%变为 100%,20-24min % 100% B 相冲洗；流速:1. OmL · mirT1 ；检测波长:210nm，254nm。HPLC图谱如图1所示，其中峰1代表星形孢菌素，峰2代表K_252d，由此说明，该海洋链霉菌(Sti^ptomyces sp.) SCSIO 1667的发酵培养物中含有星形孢菌素和K_252d。4.星形孢菌素和K_252d的分离纯化收取上述全部的海洋链霉菌(Sti^ptomyces sp. ) SCSI01667的发酵培养物，离心过滤后得上清液。所得上清液上XAD-16大孔树脂吸附柱，先用3倍柱体积的去离子水洗脱后，再以体积分数为95%的乙醇水溶液冲洗，乙醇水溶液的洗脱液减压浓缩得浸膏1. 2g。 该浸膏经100-200目硅胶柱层析，以氯仿-甲醇为洗脱剂从体积比10 0 8 2梯度洗脱，氯仿-甲醇体积比为96 4洗脱的为馏分A，氯仿-甲醇体积比为9 1洗脱的为馏分 B。馏分A经减压旋转蒸发浓缩后再过一次100-200目的正相硅胶柱层析，以乙酸乙酯-石油醚体积比7 4为洗脱剂洗脱，得到化合物1(星形孢菌素)(35mg)。馏分B经100-200目的正相硅胶柱层析，以氯仿-甲醇为洗脱剂从体积比10 0 88 12梯度洗脱，薄层层析及HPLC-UV检测后留取以氯仿-甲醇体积比为94 6 93 7洗脱下的馏分，浓缩，再经反相硅胶柱层析，以水-甲醇为洗脱剂从体积比75 25 0 100梯度洗脱，收集水-甲醇体积比为3 7洗脱下来的洗脱物，经减压旋转蒸干得到化合物2(K-252d)(7mg)。化合物1和化合物2经结构鉴定，其碳谱和氢谱数据如表1所示表1星形孢菌素和K_252d的核磁碳谱和氢谱数据
权利要求
1.海洋链霉菌(Sti^ptomycessp.) SCSI01667，其保藏编号为CGMCC No. 4360。
2.一种制备星形孢菌素和K-252d的方法，其特征在于，星形孢菌素和K-252d是从权利要求1所述的海洋链霉菌(Sti^ptomyces sp.) SCSI01667的发酵培养物中制备得到的。
3.根据权利要求2所述的制备星形孢菌素和K-252d的方法，其特征在于，所述的从海洋链霉菌(Sti^ptomyces sp.) SCSI01667制备星形孢菌素和K_252d的方法具体包括以下步骤(1)制备海洋链霉菌(Sti^ptomycessp.) SCSI01667的发酵培养物，将发酵培养物离心，取上清液；(2)上清液上大孔吸附树脂柱，先用3倍柱体积的去离子水洗脱，再用体积分数为 95%的乙醇水溶液洗脱，体积分数为95%的乙醇水溶液的洗脱液浓缩得浸膏，浸膏经硅胶柱层析，以氯仿-甲醇为洗脱剂从体积比10 O 8 2梯度洗脱，收集氯仿-甲醇体积比为96 4洗脱的馏分A，收集氯仿-甲醇体积比为9 1洗脱的馏分B，馏分A浓缩后再经正相硅胶柱层析，以乙酸乙酯-石油醚体积比7 4洗脱，得到化合物星形孢菌素；馏分 B经正相硅胶柱层析，以氯仿-甲醇为洗脱剂从体积比10 O 88 12梯度洗脱，收集氯仿-甲醇体积比为94 6 93 7洗脱的馏分，浓缩再经反相硅胶柱层析，以水-甲醇为洗脱剂从体积比75 25 O 100梯度洗脱，收集水-甲醇体积比为3 7洗脱的馏分， 得到K152d。
4.根据权利要求3所述的制备星形孢菌素和K-252d的方法，其特征在于，所述的制备海洋链霉菌(Sti^ptomyces sp.) SCSIO 1667的发酵培养物通过以下方法制备将海洋链霉菌(Sti^ptomyces sp.) SCSI01667接入种子培养基中，于培养M 48小时，得到种子培养液，将种子培养液按体积比为1 20 1 9的比例接入发酵培养基中，于培养144 240小时，得到的海洋链霉菌(Sti^ptomyces sp.) SCSI01667的发酵培养物；所述种子培养基每升含有可溶性淀粉10g，K2HPO4 lg，MgSO4 · 7H20 lg，(NH4)2SO4 2g， CaCO3 2g，蛋白胨lg，酵母提取物0. 5g，海盐30g，余量为水，ρΗ7· 2 7. 4 ；所述发酵培养基每升含有大豆粉10g，可溶性淀粉20g，酵母提取物5g，蛋白胨2g， CaC032g, NaCl 4g，余量为水，pH 7. O 7. 4。
全文摘要
本发明公开了一种海洋链霉菌及利用其制备星形孢菌素和K-252d的方法。星形孢菌素和K-252d是从海洋链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO1667的发酵培养物中制备得到的。海洋链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO1667于2010年11月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC No.4360。本发明为星形孢菌素和K-252d的生产制备开辟了一条新的道路。
文档编号C12P17/18GK102181387SQ201110065140
公开日2011年9月14日 申请日期2011年3月17日 优先权日2011年3月17日
发明者周俊勇, 张偲, 张长生, 汪中文, 王博, 田新朋, 鞠建华, 马俊英, 黄洪波 申请人:中国科学院南海海洋研究所