专利名称：赖氨酸的反式发酵制备的制作方法
技术领域：
本发明属于氨基酸发酵领域，具体而言，本发明涉及L-赖氨酸的发酵方法，其包括将以非天然顺序编码吡啶核苷酸转氢酶的多核苷酸导入产L-赖氨酸的菌，从而使所获得的菌表达所述吡啶核苷酸转氢酶；和在发酵条件下培养获得的菌。另外，本发明还提供了所述发酵方法中所用的中间产物，和利用所述发酵方法进一步生产产品等。
背景技术：
L-赖氨酸是重要的氨基酸原料，可以作为调味品、食品、饲料添加剂使用，也可以作为保健品、药品中的有效或辅料成分，广泛应用于食品业、饲料业、制药业及其他化学工业中。当前，L-赖氨酸的生产主要是通过微生物的发酵生产的，如可以利用棒状杆菌生产。用于发酵生产的微生物可以是野生型微生物，但是更多的是通过诱变或基因工程获得的产量更高的营养缺陷型、耐药变异型和代谢变异型微生物。对于基因工程获得的性状改良的微生物来说，其中至关重要的就是性质优异的基因。吡啶核苷酸转氢酶是L-赖氨酸代谢途径上重要的酶。尽管野生型吡啶核苷酸转氢酶的亚基已经被公开(可参见NCBI (http://www. ncbi.nlm.nih. gov)蛋白和基因登录号 NP416120. 1和AAC74674. 1 ；也可参见中国专利ZL94194707)，。然而，在天然的微生物基因组中，编码吡啶核苷酸转氢酶α亚基的多核苷酸位于编码吡啶核苷酸转氢酶β亚基的多核苷酸的上游。另外，该酶变体的研究却没有报道。本发明人经过长期艰苦研究，令人意外地发现了以非天然顺序编码吡啶核苷酸转氢酶，仍旧能够表达出具有活性的吡啶核苷酸转氢酶，另外，本发明人还发现了新的吡啶核苷酸转氢酶，其显著提高了相应酶的活性，在导入工程菌发酵的时候也获得了更高的赖氨
酸产量。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供L-赖氨酸的发酵方法，其包括将编码吡啶核苷酸转氢酶的多核苷酸导入产L-赖氨酸的菌，从而使所获得的菌表达所述吡啶核苷酸转氢酶，其中所述多核苷酸依次编码吡啶核苷酸转氢酶β亚基和吡啶核苷酸转氢酶α亚基。 另外，本发明还提供了所述发酵方法中所用的中间产物，和利用所述发酵方法进一步生产产品等具体而言，在第一方面，本发明提供了 L-赖氨酸的发酵方法，其包括(1)将编码吡啶核苷酸转氢酶的多核苷酸导入产L-赖氨酸的菌，从而使所获得的菌表达所述吡啶核苷酸转氢酶，其中所述多核苷酸依次编码吡啶核苷酸转氢酶β亚基和吡啶核苷酸转氢酶α亚基；和(2)在发酵条件下培养步骤(1)获得的菌。由于通常认为直接顺序串联的两个开放阅读框(ORF)的后一个表达量较低，而本发明中又是以吡啶核苷酸转氢酶β亚基和吡啶核苷酸转氢酶α亚基这两个开放阅读框(ORF)直接顺序串联，是非天然的串联形式，因此是否能将表达产物顺利组装成有活性的吡啶核苷酸转氢酶，无法事前预料。而本发明人发现，即使使用此非天然的顺序，仍旧能够表达出有活性的吡啶核苷酸转氢酶，用于L-赖氨酸的发酵。其中，吡啶核苷酸转氢酶可以是野生型吡啶核苷酸转氢酶，也可以是其β亚基变体和/或α亚基变体形成的吡啶核苷酸转氢酶变体。野生型吡啶核苷酸转氢酶是本领域技术人员所知晓的，包括α亚基和β亚基，其中α亚基和β亚基的序列分别如 NCBI(http://www. ncbi.nlm.nih. gov)蛋白和基因登录号NP416120. 1 和 AAC74674. 1 所示。然而优选本发明第一方面的发酵方法中，吡啶核苷酸转氢酶是吡啶核苷酸转氢酶变体，尤其是相对于野生型吡啶核苷酸转氢酶的活性提高的吡啶核苷酸转氢酶变体。因此， 优选本发明第一方面的发酵方法中，所述多核苷酸依次编码吡啶核苷酸转氢酶β亚基变体和吡啶核苷酸转氢酶α亚基变体，优选其中所述多核苷酸编码的吡啶核苷酸转氢酶变体相对于野生型吡啶核苷酸转氢酶的活性提高，最优选其核苷酸序列如SEQ ID Νο:1所示。 酶活性的测定方法是现有已知的，如可以采用本发明具体实施方式
中所述的方法来测定酶活性，这样就可以确认吡啶核苷酸转氢酶变体的活性是否有提高。优选本发明第一方面的发酵方法中，所述多核苷酸依次编码吡啶核苷酸转氢酶α 亚基变体和吡啶核苷酸转氢酶β亚基变体，即编码吡啶核苷酸转氢酶α亚基变体的多核苷酸位于编码吡啶核苷酸转氢酶β亚基变体的多核苷酸的上游。在本发明的具体实施方式
中，所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID Νο:1所示。其中，所述吡啶核苷酸转氢酶β亚基变体在Α398或D400的位置上被其他天然氨基酸替换，优选替换选自A398S和D400H，最优选其氨基酸序列如SEQID No :2所示。本领域技术人员可以根据吡啶核苷酸转氢酶α亚基变体的氨基酸序列推导出其编码核苷酸序列，优选是密码子优化的核苷酸序列，如针对发酵所用的菌密码子使用情况优化的。在本发明的具体实施方式
中，所述吡啶核苷酸转氢酶β亚基变体由如SEQ ID No :3所示的多核苷酸编码。另外，其中所述吡啶核苷酸转氢酶α亚基变体在Μ102、L127或Q322的位置上被其他天然氨基酸替换，优选替换选自M102L、L127R和Q322K，最优选其氨基酸序列如SEQ ID No:4所示。本领域技术人员可以根据吡啶核苷酸转氢酶α亚基变体的氨基酸序列推导出其编码核苷酸序列，优选是密码子优化的核苷酸序列，如针对发酵所用的菌密码子使用情况优化的。在本发明的具体实施方式
中，所述吡啶核苷酸转氢酶α亚基变体由如SEQ ID No :5所示的多核苷酸编码。所述多核苷酸可以通过各种本领域技术人员所熟知的方式被导入产L-赖氨酸的菌，只要能够使产L-赖氨酸的菌表达所述吡啶核苷酸转氢酶变体即可。所述多核苷酸可以直接被导入，例如利用微粒体、基因枪等导入细胞；也可以间接被导入，例如可以通过构建在质粒载体上导入细胞。导入的所述多核苷酸可以整合在细胞的基因组上表达，也可以游离表达。通常，由于产L-赖氨酸的菌本身不适于作为克隆宿主菌，因此优选所述多核苷酸是通过穿梭质粒导入产L-赖氨酸的菌的。其中，所述穿梭质粒优选是大肠杆菌和产L-赖氨酸的菌的穿梭质粒。这样便能够很方便地在大肠杆菌宿主中进行DNA重组操作。产L-赖氨酸的菌有许多种，本领域技术人员所知晓的包括埃希氏杆菌、棒状杆菌和沙雷氏杆菌，优选是棒状杆菌。在本发明的具体实施方式
中，所述产L-赖氨酸的菌是Corynebacterium glutamicum。优选本发明第一方面的发酵方法中，所述发酵条件的发酵温度为观_351，优选为 29-33 0C，更优选为 30-32 0C，如 30 °C。也优选本发明第一方面的发酵方法中，所述发酵条件的培养基包含糖，NH4Cl, CaCl2,KH2PO4，蛋白胨，MgSO4,FeSO4,MnSO4，生物素，和叶酸。在本发明的具体实施方式
中，所述培养基的配方为:40g蔗糖，20g NH4Cl, 2g CaCl2, IgKH2PO4, Ig蛋白胨，5OOmg MgSO4 ·7Η20， 15mg FeSO4 ·7Η20，IOmgMnSO4 ·7Η20，200 μ g 生物素，和 50 μ g 叶酸，ρΗ7· 3，用水补足至 1 升。在第二方面，本发明提供了 L-赖氨酸饲料添加剂的制备方法，其包括(1)实施本发明第一方面的发酵方法中的步骤O)；和(2)收集发酵液依次进行膜分离并对滤液进行喷雾干燥；(3)对步骤(2)喷雾干燥获得的颗粒进行筛分；(4)将筛分得到的粒径大于等于1. 5mm的颗粒破碎，并将其与筛分得到的粒径小于1. 5mm的颗粒混合，再次进行喷雾干燥；和(5)对步骤(4)喷雾干燥获得的颗粒进行筛分，收集粒径小于1. 5mm的颗粒。其中，为了使最终颗粒饲料添加剂的形状更为均勻，流化床干燥机内尾气温度不宜过高，通常不应高于85 °C，优选保持在80 士 3°C。本发明第二方面的制备方法还可以在实施本发明第一方面的发酵方法中的步骤 (2)之前，包括实施本发明第一方面的发酵方法中的步骤(1)。但是，这通常不是优选的，因此本发明第二方面的制备方法不包括实施本发明第一方面的发酵方法中的步骤(1)，而包括在发酵条件下培养产L-赖氨酸的菌(尤其是高产L-赖氨酸的菌)的步骤，这也涵盖在本发明的范围内。由于本发明第二方面的制备方法已经能够生产出符合国家标准的颗粒饲料添加剂，因此优选其中不包括包衣的过程，相应可以降低成本，更便于商业推广。在第三方面，本发明提供了根据本发明得到的产品以及本发明中使用的中间产物。具体而言，本发明提供了根据本发明第二方面的制备方法得到的L-赖氨酸饲料添加剂，优选其中不含包衣剂(如，环糊精等)。另外，本发明提供了吡啶核苷酸转氢酶变体，其包括吡啶核苷酸转氢酶β亚基变体和吡啶核苷酸转氢酶α亚基变体。优选所述吡啶核苷酸转氢酶β亚基变体在Α398或 D400的位置上被其他天然氨基酸替换，优选替换选自A398S和D400H，最优选其氨基酸序列如SEQ ID Νο:2所示。另外，也优选所述吡啶核苷酸转氢酶α亚基变体在Μ102、L127或 Q322的位置上被其他天然氨基酸替换，优选替换选自M102L、L127R和Q322K，最优选其氨基酸序列如SEQ ID No:4所示。本发明还分别提供了上述吡啶核苷酸转氢酶β亚基变体和吡啶核苷酸转氢酶α亚基变体。相应地，本发明提供了编码吡啶核苷酸转氢酶变体的多核苷酸，即顺序编码吡啶核苷酸转氢酶β亚基变体和吡啶核苷酸转氢酶α亚基变体的多核苷酸，优选其核苷酸序列如SEQ ID Νο:1所示。本发明还分别提供了编码上述吡啶核苷酸转氢酶β亚基变体和吡啶核苷酸转氢酶α亚基变体的多核苷酸，优选它们的核苷酸序列分别如SEQ ID No :3和 5所示。
本发明具有以下有益效果赖氨酸的发酵产量得到有效提高；发酵液质量稳定； 变体酶与野生型酶结构差异不大，都可以顺利降解，无安全隐患；发酵液可以直接用于生产颗粒饲料添加剂；生产颗粒饲料添加剂的步骤简便，无需引入包衣剂即可达到国家标准的要求。为了便于理解，以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。另外，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。
具体实施例方式以下通过实施例进一步说明本发明的内容。如未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段和市售的常用仪器、试剂，可参见《分子克隆实验指南(第3版)》(科学出版社)、《微生物学实验(第4版)》(高等教育出版社)以及相应仪器和试剂的厂商说明书等参考。实施例1吡啶核苷酸转氢酶变体基因构建体的制备根据我们设计的序列，通过商业途径委托上海生工生物技术有限公司合成编码两个吡啶核苷酸转氢酶亚基变体的吡啶核苷酸转氢酶变体基因构建体并构建入大肠杆菌-棒状杆菌穿梭质粒pMS2(可购自美国典型微生物保藏中心(ATCC)，商品编号ATCC 67189)中。克隆过程参照《分子克隆实验指南》以及所用商品化试剂的操作指南进行，简要过程如下通过DNA自动合成仪，合成非天然顺序的吡啶核苷酸转氢酶变体基因构建体的核酸片段，用T4多核苷酸激酶(购自TaKaRa公司)将这些核酸片段的5’端进行磷酸化，然后等摩尔比混合这5个核酸片段后于65°C变性5分钟，退火降温至16°C，加入T4 DNA连接酶(购自TaKaRa公司)连接12小时。然后，取1 μ L上述连接产物在50 μ L反应体积中进行PCR扩增，其中正向引物如序列表的SEQ ID No :6所示(引入了 EcoR I内切酶位点)、 反向引物如序列表的SEQ IDNo 7所示(引入了 )(ba I内切酶位点)，反应条件为以94°C 变性4分钟，然后以94°C变性30秒、63°C退火60秒并72°C延伸30秒进行35个循环，最后以72°C延伸4分钟并降温至4°C。琼脂糖凝胶电泳上述PCR产物，回收约2. 91Λ大小的片段，用EcoR I和)(ba I双酶切该片段，并与经这两个内切酶酶切的PMS2质粒用T4DNA连接酶进行连接，转化入大肠杆菌ToplOF’中。挑出阳性克隆，抽提出其中的质粒，经测序验证，相应核苷酸序列如序列表的SEQ ID No :1所示，顺序编码了如SEQ ID No 2和SEQ ID No 4所示的两个吡啶核苷酸转氢酶亚基变体的完整0RF，由公司将构建好的质粒(命名为pMS2-tanspnt)以及相应大肠杆菌转化株(命名为E.coli-transpnt)寄回。实施例2大肠杆菌的活性测定及棒状杆菌的发酵实验根据现有的转氢酶活性测定方法(可参见Clarke DM等.Cloning andexpression of the transhydrogenase gene of Escherichia coli. J. Bacteriol. ,162 :367-373),对转化有pMS2-CiSpnt质粒的Ε. coli-tanspnt菌株与作为对照的阴性ToplOF’菌株分别测定转氢酶活性，发现的E. coli-tanspnt菌株的酶比活性比阴性ToplOF’菌株的酶比活性提高了 138%，远高于现有技术中用野生型吡啶核苷酸转氢酶表达的酶比活性提高比率。通过电转化法将pMS2-tanSpnt质粒转入L-赖氨酸发酵的棒状杆菌工程菌(可购自美国典型微生物保藏中心(ATCC)，商品编号ATCC 31269)中，其简要过程是将棒状杆菌在50mL LB液体培养基中振荡培养至0D500达到0. 7，离心收集菌体，用0°C预冷的 10% (V/V)甘油溶液洗涤后将菌体重悬于200yL预冷的10% (V/V)甘油溶液中，加入 pMS2-tanspnt质粒，混合均勻后转移入0. Icm电击杯中，于2kV持续5ms的条件进行电击， 然后立即加入ImL含0. 5% (M/M)葡萄糖的液体LB培养基，于42°C温浴5分钟，然后涂布在含100 μ g/mL氨苄青霉素和35 μ g/mL卡那霉素的固体LB培养基上于30°C培养36小时。 生长出的转化菌株提取总DNA后，用上述正向引物和反向引物PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳发现有约2. 9kb大小的片段，表明已经将如序列表的SEQ ID No 1所示的基因构建体导入了棒状杆菌工程菌中。同时将PMS2质粒电转化入L-赖氨酸发酵的棒状杆菌工程菌，形成阴性对照菌。将上述电转化的阳性棒状杆菌工程菌和阴性对照菌分别在液体LB培养基中振荡培养至0D500达到0. 5，以5%的接种量接入赖氨酸发酵培养基(每升培养基配方为 40g 蔗糖，20g NH4Cl, 2g CaCl2, Ig KH2PO4, Ig 蛋白胨，500mgMgS04 · 7H20，15mg FeSO4 · 7H20， IOmg MnSO4 · 7H20, 200 μ g 生物素，和 50 μ g 叶酸，用 Tris-HCl 调节至 ρΗ7· 3)中以 30°C振荡(150rpm)培养72小时。离心收集培养基上清液(即，发酵液)，用纸层析法分离并定量培养基中的L-赖氨酸。结果发现，阳性棒状杆菌工程菌的发酵培养基中L-赖氨酸的含量达到了 14. 3g/L，而阴性对照菌的发酵培养基中L-赖氨酸的含量仅为12. Og/L，表明导入了如序列表的SEQ ID No :1所示的基因构建体，产量提高了 19.2%，也高于现有技术中导入野生型吡啶核苷酸转氢酶的工程菌的产量提高比率。实施例3L-赖氨酸饲料添加剂的制备用实施例2制备的发酵液通过Simtar-III型超滤膜(可购自三达膜科技有限公司)进行膜分离。然后，将滤液直接以雾状喷入流化床干燥机内并保持尾气温度在80士3°C 不变，收集出料的颗粒。对出料的颗粒进行筛分，对于粒径大于等于1. 5mm的颗粒送入破碎机破碎，然后将破碎后的颗粒与筛分得到的粒径小于1. 5mm的颗粒混合并再次喷入流化床干燥机内并保持尾气温度在80士3°C不变，收集出料的颗粒并筛分出粒径小于1. 5mm的颗粒，即为L-赖氨酸饲料添加剂。粒径大于1. 5mm的颗粒再次破碎后，与下一批次的滤液干燥得到的出料的颗粒混合。以上制备的L-赖氨酸饲料添加剂经检测，含水量< 1 % ；颗粒粒径小于1. 5mm,无明显可见粉尘；混合变异系数为7 9 ；堆积密度为550 630g/L ；不含其他添加剂，完全达到了国家标准。
权利要求
1.L-赖氨酸的发酵方法，其包括(1)将编码吡啶核苷酸转氢酶的多核苷酸导入产L-赖氨酸的菌，从而使所获得的菌表达所述吡啶核苷酸转氢酶，其中所述多核苷酸依次编码吡啶核苷酸转氢酶β亚基和吡啶核苷酸转氢酶α亚基；和(2)在发酵条件下培养步骤(1)获得的菌。
2.权利要求1所述的发酵方法，其中所述多核苷酸依次编码吡啶核苷酸转氢酶β亚基变体和吡啶核苷酸转氢酶α亚基变体，优选其中所述多核苷酸编码的吡啶核苷酸转氢酶变体相对于野生型吡啶核苷酸转氢酶的活性提高，最优选其核苷酸序列如SEQ ID Νο:1所
3.权利要求2所述的发酵方法，其中所述吡啶核苷酸转氢酶β亚基变体在Α398或 D400的位置上被其他天然氨基酸替换，优选替换选自A398S和D400H，最优选其氨基酸序列如SEQ ID No 2所示；和，所述吡啶核苷酸转氢酶α亚基变体在Μ102、L127或Q322的位置上被其他天然氨基酸替换，优选替换选自M102L、L127R和Q322K，最优选其氨基酸序列如 SEQ ID No 4 所示。
4.权利要求1所述的发酵方法，其中所述多核苷酸是通过穿梭质粒导入产L-赖氨酸的菌的。
5.权利要求1所述的发酵方法，其中所述菌是棒状杆菌。
6.权利要求5所述的发酵方法，其中所述发酵条件的发酵温度为观-351，优选为 29-33 0C，更优选为 30-32 0C，如 30 °C。
7.权利要求2所述的发酵方法，其中所述发酵条件的培养基包含糖，NH4Cl,CaCl2, KH2PO4,蛋白胨，MgSO4, FeSO4, MnSO4,生物素，和叶酸。
8.L-赖氨酸饲料添加剂的制备方法，其包括(1)实施权利要求1-7之任一所述的发酵方法的步骤O)；和(2)收集发酵液依次进行膜分离并对滤液进行喷雾干燥；(3)对步骤( 喷雾干燥获得的颗粒进行筛分；(4)将筛分得到的粒径大于等于1.5mm的颗粒破碎，并将其与筛分得到的粒径小于 1. 5mm的颗粒混合，再次进行喷雾干燥；和(5)对步骤(4)喷雾干燥获得的颗粒进行筛分，收集粒径小于1.5mm的颗粒。
9.根据权利要求8所述的制备方法得到的L-赖氨酸饲料添加剂。
10.吡啶核苷酸转氢酶变体及其编码基因。
全文摘要
本发明提供了L-赖氨酸的发酵方法，其包括将以非天然顺序编码吡啶核苷酸转氢酶的多核苷酸导入产L-赖氨酸的菌，从而使所获得的菌表达所述吡啶核苷酸转氢酶；和在发酵条件下培养获得的菌。另外，本发明还提供了所述发酵方法中所用的中间产物，和利用所述发酵方法进一步生产产品等。
文档编号C12R1/15GK102191288SQ20111006569
公开日2011年9月21日 申请日期2011年3月18日 优先权日2011年3月18日
发明者刘鑫, 孟刚, 曹洪, 程耀东, 陈崇安, 马吉银 申请人:宁夏伊品生物科技股份有限公司