专利名称：一种无标签结核杆菌融合蛋白ESAT6-RpfE及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种结核杆菌融合蛋白ESATe-RpfE和其制备方法，以及其在制备结核亚单位疫苗中的应用。
背景技术：
结核病是长期危害人类健康的严重疾病之一。全世界仍有近1/3的人感染过结核分枝杆菌。大约有5%的结核感染者在2-5年内会发展为肺结核病人；其余的有可能会形成结核病的潜伏感染者。我国是结核病高负担的国家之一，每年约有13万人因结核病而死亡。目前，卡介苗BCG的接种是有效预防结核病的重要措施。然而，不同研究显示，BCG在不同人群中的保护性不稳定，尤其是对成人肺结核的保护效率介于0-80%不等。因此，研制和开发全面高效的抗结核疫苗是控制结核病的重要途径。可供研究的抗结核疫苗有亚单位疫苗，重组BCG，减毒的MTB活疫苗。而亚单位疫苗又包括蛋白疫苗，DNA疫苗和以病毒为载体的疫苗；其中的蛋白疫苗具有成分明确，使用安全等优点，相对易于被人们接受。利用基因工程技术将具有优势的不同的单个结核保护性抗原进行重组，从而构建成融合蛋白。大量研究表明，与单个抗原相比，融合抗原的免疫原性会增强，显示出更好的保护效果；因此受到国内外研究的重视。然而在以往的研究中，为了后期简便的纯化方法，往往构建成带有各种标签(如 His · Tag, GST · Tag, S · Tag等)形式的融合蛋白，却未考虑这种融合蛋白所带有的标签是否会影响到动物实验以及更进一步的临床学试验的认可。
发明内容
本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种无标签结核杆菌融合蛋白ESAT6-RpfE，是序列表中序列2的蛋白质。本发明的另一个目的是提供一种上述无标签结核杆菌融合蛋白ESAT6-RpfE的编
码基因。所述融合蛋白ESAT6-RpfE的编码基因，是如下1)或2)的基因a)其核苷酸序列是序列表中的序列1 ；b)在严格条件下与a)限定的DNA序列杂交且编码所述融合蛋白ESAT6_RpfE的 DNA分子。含有上述融合蛋白ESATe-RpfE的编码基因的重组表达载体，所述重组表达载体为PET30a质粒。 含有上述重组表达载体的宿主细胞，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21。本发明的第三个目的是提供一种上述无标签结核杆菌融合蛋白ESAT6-RpfE的制备方法，包括有以下步骤1)获得上述结核杆菌融合蛋白ESAT6-RpfE的编码基因；
2)将步骤1)得到的结核杆菌融合蛋白ESAT6-RpfE的编码基因导入重组表达载体；3)将步骤2)载体导入宿主细胞；4)培养步骤3)得到的宿主细胞；5)将步骤4)得到的宿主细胞进行处理得到上述结核杆菌融合蛋白ESAT6-RpfE并纯化和表达。所述编码基因为序列1所示的核苷酸序列；所述重组表达载体为PET30a质粒；所述宿主细胞为大肠杆菌BL21。本发明的第四个目的是提供一种上述无标签结核杆菌融合蛋白ESATe-RpfE在制备抗结核的候选疫苗中的应用。本发明选用的结核分枝杆菌早期分泌蛋白ESAT6，其具有多个T细胞、B细胞表位，是抗结核免疫反应的主要配体，有较强的免疫原性和免疫反应性。ESAT6能成为检测 MTB抗体的特异性抗原，其优势是能区分MTB自然感染和BCG接种以及非致病性分枝杆菌感染后产生的抗体。另外RPF (Resuscitation Promoting Factor)是一种细菌复活生长因子，以自分泌或旁分泌的形式促进休眠菌的复苏和生长，也是细菌生长真正必需的分泌蛋白之一.结核分枝杆菌 H37 Rv 株的基因 Rv0867c (RpfA)、Rvl009 (RpfB)、Rvl884c (RpfC) Rv2389c (RpfD), Rv2450c (Rpf Ε)均编码具有同源性的RPF样蛋白，RPF蛋白是迄今为止发现的第1个能使休眠的细菌恢复生长繁殖能力的分泌型蛋白，是宿主免疫系统识别的靶抗原，能引起较强的免疫应答，刺激宿主机体产生的特异性抗体，能阻断RPF蛋白对MTB的作用，阻止MTB在体内的复苏和复发，因此RPF蛋白可能是预防和控制MTB感染的一种新型途径。基于以上的研究背景情况，本发明利用基因工程技术，克隆构建了无任何标签的结核分枝杆菌融合蛋白ESAT6-RpfE，并且进行了表达和纯化，以期望成为抗结核的候选疫
田ο
图1为结核分枝杆菌基因RpfE体外扩增。图2为重组质粒pET30a_ESAT6的PCR鉴定。图3为重组质粒pET30a_ESAT6与基因RpfE的连接。其中1 未酶切的质粒pET30a_ESAT6 ；2 双酶切以及纯化的质粒pET30a_ESAT6 ； 3 双酶切以及纯化的基因RpfE。图4为融合基因ESAT6_RpfE的表达结果。其中，1=Marker ；2 :BL21 空菌上清；3 :ESAT6_RpfE 上清 4 :BL21 空菌沉淀；5 ESAT6-RpfE 沉淀。图5为结核分枝杆菌融合蛋白ESAT6-RpfE最终的纯化结果。其中，1=Marker ；2 最终纯化的 ESAT6_RpfE。
具体实施例方式材料
1、引物:ESAT6上游引物(Es)、ESAT6下游引物(Ea) ,RpfE上游引物(Rs) ,RpfE下游引物(Ra)。ESAT6 上游弓丨物(Es) CGGCATATGACAGAGCAGCAGTGGAAT ；ESAT6 下游引物(Ea) TTGGAATTCTGCGAACATCCCAGTGAC ；RpfE 上游弓丨物(Rs) CGGGAATTCATGGACGACGCGGGCTTGGA ；RpfE 下游弓丨物(Ra) ATAAAGCTTTCAGCCGCGGCGGCCGCAGA。2、引物由上海生物生工工程有限公司合成；结核分枝杆菌株H37Rv及临床耐药株来自甘肃省疾病控制中心；质粒pET30a、E. coli DH5 α与BL21(DE3)由复旦大学王洪海教授惠赠；、0.45um 滤器购买于 Beyotime Biotechnoly, lot R0KA590211、尿素购买于 Bio Basic INC, UB0148试剂均购自兰州市鹏程生物有限公司；IPTG购自兰州市鹏程生物有限公司 Merck420332。3、下列试剂的配方50 μ g/ml卡那霉素取5mg的卡那霉素粉末溶于IOOml双蒸水中，0. 22um滤器过
滤后使用。LB液体培养基取Ig胰蛋白胨，0. 5g酵母提取物，Ig氯化钠加水定容至100ml， 121 度，高压 20min。20mM PB (pH7. 4)配制方法配制时，先配制 0. 2mol/L 的 NaH2PO4 和 0. 2mol/L 的 Na2HPO4,两者按19 81的比例混合即成0. 2mol/L的磷酸盐缓冲液(PB)。PBS缓冲液称取0. 29g磷酸氢二钠，0. 02g磷酸二氢钾，0. 02g氯化钾，0. 8g氯化钠，加水溶解定容至100ml。4、酶的来源T4DNA连接酶购买于 Fermentas，#EL10014，lot 0042595、限制性内切酶EcoR I 购买于 Fermentas，#ER0271，lot00031477。HindIII 购买于 Fermentas, #ER0507 lot 00017410。Nde I 购买于 Fermentas, #ER0585，lot 00025089。5、弱阴离子交换柱 DEAE 购买于 GE healthcare, 17-6002-33，lotl00299 ；HiC Octylg 柱购买于 GE healthcare, 28-4110-07, lot 10034003。实施例1一、重组质粒pET30a-ESAT6_RpfE的克隆构建；1、根据GenBank中H37Rv中的ESAT6和RpfE的基因序列，设计4对引物，分别为 ESAT6上游引物(Es)含酶切位点Nde I及起始密码子；ESAT6下游引物(Ea)含酶切位点 EcoR I ；RpfE上游引物(Rs)含酶切位点EcoR I ；RpfE下游引物(Ra)含酶切位点HindIII 及终止密码子。以H37Rv的DNA为模板，PCR扩增的ESAT6基因；临床耐药株为模板， PCR扩增436bp的RpfE基因(见图1)。ESAT6基因的PCR为98°C变性10s，60°C退火15s， 72°C聚合30s，共30个循环。RpfE基因的PCR均为98°C变性15s，63°C退火15s，72°C聚合 50s，共35个循环。2、Nde I、EcoR I双酶切并纯化后的ESAT6基因和质粒pET30a，在T4连接酶的作用下将两者进行连接，转化入E. Coli DH5a中。PCR验证筛选阳性克隆进行测序鉴定(北京华大基因科技完成测序)见图2。即保存菌种为pET30a-ESAT6 (DH5 a )。
3、提取以上鉴定正确的重组质粒pET30a-ESAT6。EcoR I和HindIII双酶切RpfE 基因和重组质粒pET30a-ESAT6，分别纯化后用T4连接酶进行连接，转化入E. Coli DH5 α。 PCR验证筛选阳性克隆进行测序鉴定(北京华大基因科技完成测序)(见图4)。即保存菌种为 pET30a-ESAT6-RpfE (DH5 α )。二、融合基因ESAT6_RpfE的诱导表达；1、从以上 E. Coli pET30a-ESAT6_RpfE (DH5 α )提取重组质粒 pET30a-ESAT6-RpfE，转化入Ε. Coli BL21(DE3)中，PCR验证筛选阳性克隆进行测序鉴定 (北京华大基因科技完成测序)。即为保存菌种为pET30a-ESAT6-RpfE(BL21)。2、将菌种pET30a-ESAT6-RpfE (BL21)接种于含有50 μ g/ml卡那霉素的LB液体培养基，37°C振荡培养约3小时，至A600值为0. 6 0. 8，加入IPTG至终浓度为0. 5mmol/L, 37°C诱导表达6 8h，收集菌体。3、上述菌体重悬于20mM PB缓冲液中，冰浴下超声破碎40min左右至液体澄清， 40C，IOOOOrpm离心20min后，将上清和沉淀分别进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE凝胶电泳)。4、经SDS-PAGE分析，与BL21空菌相比，有明显的特异蛋白表达条带，以包涵体形式表达为主，上清中蛋白很少(见图5)。三、融合蛋白ESAT6_RpfE的纯化步骤；1、配制以下缓冲液1 液 20mM PB (pH7. 4) ；II 液 20mM PB+1M NaCl (ρΗ7· 4) ；III 液 20mM PB+2M NaCl(ρΗ7· 4) ·2、大量表达融合蛋白ESAT6-RpfE，收集的菌体重悬于20mM PB缓冲液中，冰浴下超声破碎Ih左右，4°C，IOOOOrpm离心20min离心后收集沉淀，8M尿素溶解。3、预先处理透析袋，配制复性液6M尿素，4M尿素，2M尿素，IM尿素，OM尿素各 5000ml，4 0C下进行梯度透析复性。4、用0.45um滤器过滤复性后的蛋白，并测定蛋白浓度(mg/ml)，根据所选层析柱的载量，计算确定蛋白的上样量。5、第一步纯化离子交换层析。选用弱阴离子交换柱DEAE进行纯化，收集不同梯度洗脱液进行SDS-PAGE分析得初步纯化物。6、第二步纯化疏水层析。经过离子交换层析初步纯化后的蛋白，加入等体积的III液，使蛋白含高盐上柱。选用HiC Octyl柱进行纯化，收集不同梯度洗脱液进行 SDS-PAGE分析得最终纯化物。7、将最终得到的蛋白纯化物，在PBS溶液中进行透析后即可用。
权利要求
1.一种无标签结核杆菌融合蛋白ESAT6-RpfE，是序列表中序列2的蛋白质。
2.权利要求1所述的无标签结核杆菌融合蛋白ESAT6-RpfE的编码基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于所述融合蛋白ESAT6-RpfE的编码基因，是如下1)或2)的基因a)其核苷酸序列是序列表中的序列1；b)在严格条件下与a)限定的DNA序列杂交且编码所述融合蛋白ESAT6-RpfE的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述融合蛋白ESAT6-RpfE的编码基因的重组表达载体，所述重组表达载体为PET30a质粒。
5.含有权利要求4所述重组表达载体的宿主细胞，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21。
6.一种如权利要求1所述的结核杆菌融合蛋白ESAT6-RpfE的制备方法，其特征在于 包括有以下步骤1)获得如权利要求2所述的结核杆菌融合蛋白ESAT6-RpfE的编码基因；2)将步骤1)得到的结核杆菌融合蛋白ESAT6-RpfE的编码基因导入重组表达载体；3)将步骤2、载体导入宿主细胞；4)培养步骤幻得到的宿主细胞；5)将步骤4)得到的宿主细胞进行处理得到如权利要求2所述的结核杆菌融合蛋白 ESAT6-RpfE并纯化和表达。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于所述编码基因为序列1所示的核苷酸序列；所述重组表达载体为PET30a质粒；所述宿主细胞为大肠杆菌BL21。
8.—种如权利要求1所述的结核杆菌融合蛋白ESAT6-RpfE在制备抗结核的候选疫苗中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种无标签结核杆菌融合蛋白ESAT6-RpfE，是序列表中序列2的蛋白质，并提供了其制备方法和制备疫苗的应用。本发明选用的结核分枝杆菌早期分泌蛋白ESAT6，是抗结核免疫反应的主要配体，有较强的免疫原性和免疫反应性。RPF是一种细菌复活生长因子，以自分泌或旁分泌的形式促进休眠菌的复苏和生长，也是细菌生长真正必需的分泌蛋白之一。RPF蛋白是迄今为止发现的第1个能使休眠的细菌恢复生长繁殖能力的分泌型蛋白，是宿主免疫系统识别的靶抗原，能引起较强的免疫应答，刺激宿主机体产生的特异性抗体，能阻断RPF蛋白对MTB的作用，阻止MTB在体内的复苏和复发，因此RPF蛋白可能是预防和控制MTB感染的一种新型途径。
文档编号C12N1/21GK102190733SQ201110068819
公开日2011年9月21日 申请日期2011年3月22日 优先权日2011年3月22日
发明者张颖, 李志 , 王秉祥, 祝秉东, 章国平, 胡丽娜, 达泽蛟 申请人:兰州大学