专利名称：一种增强l-苯丙氨酸合成代谢途径的方法
一种增强L-苯丙氨酸合成代谢途径的方法
技术领域：
本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种增强L-苯丙氨酸合成代谢途径的方法。背景技术：
L-苯丙氨酸(L-phenylalanine)是人体必须的氨基酸之一，广泛应用于食品、饲料、医药和化妆品等领域，尤其是低热量、高甜度的二肽甜味剂阿斯巴甜(Aspaname)应用的日益广泛，作为合成阿斯巴甜两种原料之一的L-苯丙氨酸的市场需求量迅速增加。另外，L-苯丙氨酸也是抗肿瘤药物和氨基酸输液制剂的必需原料，随着其在医药领域的不断开发，需求量也将不断增加。国内外L-苯丙氨酸的生产方法主要有水解抽提法、化学合成法、酶法和发酵法这 4种。由于天然蛋白中L-苯丙氨酸含量较低，水解抽提法很少使用；化学合成法的工艺复杂，成本较高，在国外基本上被酶法和发酵法取代；但由于底物和酶的价格较高且来源有限，酶法应用也受到限制；由于微生物直接发酵法可利用廉价且易得的原料又可在常温常压下进行，是目前国内外生产L-苯丙氨酸的主流方法，具有较大的竞争优势。但是因L-苯丙氨酸等终产物对野生菌株体内的芳香氨基酸合成代谢途径上的关键酶有着强烈的反馈抑制作用，使其细胞不能大量蓄积苯丙氨酸，因此若要进行实际发酵生产，就必须改造野生菌株，解除其代谢调控，使得代谢终产物能过量蓄积。传统的菌株选育是从自然界中筛选有产酸能力的菌株，并建立其培养条件开始的。但该方法所能积累的氨基酸种类有限，后来在确立突变技术和阐明氨基酸合成系统调节机制的基础上发展为营养缺陷变异株、抗药性菌株的选育，但是采用常规诱变育种的方法，盲目性大，工作量繁重，不能增加基因的数量，且突变株一般都携带营养缺陷，产量进一步提高受到限制。80年代中期，随着载体和受体系统的构建及基因重组等基因工程技术的发展，开始应用基因工程的方法对生化反应的代谢网络进行调节，对细胞的酶、转运及调控体系进行修饰，主要包括消除导致副反应产品产生的酶，解除对变构酶的调控，增加或抑制代谢途径上特定基因的表达以及导入外源基因等方法。通过对大肠杆菌L-苯丙氨酸代谢途径进行调控来构建L-苯丙氨酸生产菌株的研究在国外开展广泛，并取得不少成绩。sugimoto等将L-苯丙氨酸生物合成酶系的基因放到温控启动子的质粒上，导入大肠杆菌，通过温度变化调节代谢产酸。1985年，Ozaki等人将抗苯丙氨酸类似物的谷氨酸棒杆菌上编码CM和PD的基因克隆进Pce53质粒，再导回亲本，发现其酸产量提高50% ；美国的Monsanto公司借着基因工程技术改良大肠杆菌发酵生产L-苯丙氨酸，产酸高达45g/ L，并已大规模生产，是世界上最大的L-苯丙氨酸生产企业。而国内起步较晚，1994年中国医科大学生物技术中心的史燕东等将tyrB基因克隆质粒导入不同的宿主菌，得到产酸量提高的菌株；1999年，复旦大学范长胜等通过将关键酶基因aroG、pheA进行串联表达来构建生产菌株，也大幅度地提高了工程菌的发酵产量，但国内发酵产酸率底，都未达到工业化需求水平，待进一步改良苯丙氨酸生产菌。大肠杆菌直接发酵法合成L-苯丙氨酸，生物合成途径分为共同途径和分支途径，共同途径为分支途径提供前体物质。以葡萄糖为起始物经赤藓糖-4-磷酸 (Erythrose-4-phosphate, E4P，五碳糖磷酸途径的中间产物)和糖酵解过程的中间产物——磷酸烯醇式丙酮酸(Phophoenol pyruvate,PEP) 二者缩合形成一个七碳酮糖开链磷酸化合物，称为3-脱氧-α -阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(3-deoxy- α -arobinoheptulosona te-7-phosphate, DAHP)。这是芳香族氨基酸生物合成的共同代谢途径，也是决定其产率和产量的关键步骤。因此，在大肠杆菌L-苯丙氨酸生物合成中，DAHP是L-苯丙氨酸生物合成过程中第一个也是最重要的代谢中间物，能否把中心代谢流有效地导向DAHP的合成是决定芳L-苯丙氨酸生物合成产量高低的决定因素。催化这一关键反应的酶称之为脱氧阿拉伯糖型庚酮糖磷酸合酶(DS)，是分别由ar0F、ar0G和aroH三个基因编码的三个同功酶， 分别受酩氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的反馈抑制，同时DAHP合成酶还受到苯丙氨酸和酪氨酸的协同抑制。共同途径之后，分支酸是芳香族氨基酸合成途径的分支点，在分支酸以后又分为两条途径，其中一条形成苯丙氨酸和酪氨酸，另一条形成色氨酸。分支酸在分支酸变位酶作用下，转变为预苯酸，经脱水、脱梭后形成苯丙酮酸，后者在转氨酶作用下，与谷氨酸进行转氨形成苯丙氨酸，分支酸途径是人们较早对L-苯丙氨酸改良进行遗传操作的重要环节。分支酸变位酶(CM)是与预苯酸脱水酶(PD)形成的双功能酶，其活性态是两个PheA基因编码的大小为43000D的亚基构成的同源二聚体；CM/PD酶在Phe浓度较高时形成二聚体和四聚体的混合物，使酶活性降低或完全丧失，所以它受产物Wie的反馈抑制，Tyr对此酶也有协同抑制。化学计量分析表明葡萄糖的吸收需要糖-磷酸基转移系统，一分子葡萄糖需一分子PEP，合成一分子的分支酸需两分子的PEP，所以PEP成为DAHP理论产量的限制性底物，PEP的供应量多少决定了 Phe的生物合成；而PEP又是PEP羧化酶、丙酮酸激酶、糖-磷酸基转移酶和DAHP合成酶的竞争性底物。Imol葡萄糖进入细胞要将Imol的PEP转变成丙酮酸，同时PEP又可在丙酮酸激酶和PEP梭化酶的作用下分别生成丙酮酸和草酞乙酸。丙酮酸在生物体内因为高能障而不能自发地转变回PEP，使大量的碳流就经丙酮酸而生成有机酸、二氧化碳和细胞的内容物。为了使代谢流流向Phe生成的方向，往往采取以下几种策略1)在Phe生产菌中克隆表达PEP合成酶(PpsA)和转酮酶(tktA)以及PEP羧化激酶 (pckA)的基因；2)钝化PEP的消耗去向酶如丙酮酸激酶(Pyk) ；3)磷酸转移酶系统的改造 (PTS)。大肠杆菌在高密度发酵的过程中，产生乙酸等代谢副产物，乙酸累积抑制菌体生长和外源蛋白的表达。一般认为，乙酸的产生是由于菌体对葡萄糖的摄取速率与细胞的碳代谢速率不平衡所致。大肠杆菌对葡萄糖的摄取主要通过磷酸转移酶系统完成，其中由 PtsG基因编码的酶IICB&在葡萄糖的跨膜转运中具有重要作用。利用代谢工程技术，构建 PtsG基因缺陷株，能够很大程度地降低葡萄糖的摄取速率，由此可降低乙酸的累积，促进菌体生长。丙酮酸激酶(pykA，pykF)的钝化作用也会导致PEP可获取度提高，增强L-苯丙氨酸合成代谢途径。基因敲除亦称基因打靶、基因置换技术，是八十年代后半期发展起来的技术，主要是利用活细胞染色体DNA与外源DNA的同源序列发生同源重组的性质以达到定点敲除修饰的目的。Red同源重组技术的原理是将一段携带与靶基因两翼各有40_60bp同源序列的 PCR片段导入宿主菌细胞，利用λ噬菌体Red重组酶的作用，使导入细胞的线性DNA片段与染色体(或载体)的特定靶序列进行同源重组，靶基因被标记基因置换下来，从而达到目的基因敲除的目的。这种重组技术是最近发展起来的一项可在染色体水平上进行遗传操作的新技术，只需较短的同源序列，而不需要特定的限制性酶切位点，即可在生物体内完成重组过程，省去了体外DNA酶切、连接等步骤。实验证明，这种基因打靶技术是基因功能研究和新菌株构建的有力工具。另外，本申请人在2010年4月观日公开的中国专利第200910111381. X号、名称为一种体外定向协同共进化改造L-苯丙氨酸基因工程菌的方法中揭露了构建重组表达质粒pBV-aroG-pheA的过程，为了方便阐述，本申请将该重组表达质粒pBV-aroG-pheA命名为工程质粒Mdphe-2。
发明内容本发明所要解决的技术问题在于提供一种增强L-苯丙氨酸合成代谢途径的方法，不仅能够很大程度地降低工程宿主菌对葡萄糖的摄取速率，从而可降低乙酸的积累以促进菌体的生长；而且可提高芳香族氨基酸前体物之一的PEP的获取度，进而增强了 L-苯丙氨酸合成代谢途径，提高工程菌发酵L-苯丙氨酸的能力。本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的一种增强L-苯丙氨酸合成代谢途径的方法，采用Red系统依次对L-苯丙氨酸基因工程宿主菌中ptsG基因、pykA基因及PykF基因进行敲除；然后将工程质粒Mdphe-2植入ptsG基因、pykA基因及pykF基因均已敲除的工程宿主菌内以构建新的L-苯丙氨酸基因工程菌；最后对该新的L-苯丙氨酸基因工程菌的遗传稳定性及产酸进行验证。该方法包括以下几个步骤步骤一对L-苯丙氨酸基因工程宿主菌中的ptsG基因进行敲除首先构建L-苯丙氨酸基因工程宿主菌中PtsG基因的敲除组件，具体操作是取PKD13质粒作为模板，并合成一对含有PtsG基因的短同源片段序列作为PCR的引物对，接着进行PCR扩增，PCR扩增结束后，于冰中放置15min后，对扩增产物用Dpn I酶于37°C下处理lh，酶处理结束后再于冰中放置5min，之后进行电泳回收，并将回收片段进行测序验证，序列结果显示其与理论相符，即ptsG基因的敲除组件构建成功；接着将Red系统中编码有Red重组酶的pKD46质粒植入工程宿主菌后，把该工程宿主菌制备成高效率的电转化感受态细胞；然后将PtsG基因的敲除组件导入该感受态细胞混勻后进行工程宿主菌的敲除操作，并对其进行诱导以丢失PKD46质粒；之后对工程宿主菌中PtsG基因缺失进行验证及抗性基因的消除，最终获得 PtsG基因缺失的工程宿主菌，并命名为MD-ptsG_ ；步骤二 对步骤一获得的工程宿主菌MD_ptsG_中的pykA基因进行敲除首先构建工程宿主菌MD-ptsG_中pykA基因的敲除组件，具体操作是取pKD13质粒作为模板，并合成一对含有PykA基因的短同源片段序列作为PCR的引物对，接着进行PCR扩增，PCR扩增结束后，于冰中放置15min后，对扩增产物用Dpn I酶于37°C下处理lh，酶处理结束后再于冰中放置5min，之后进行电泳回收，并将回收片段进行测序验证，序列结果显示其与理论相符，即pykA基因的敲除组件构建成功；接着将Red系统中编码有Red重组酶的pKD46质粒植入工程宿主菌MD_ptsG_后，把该工程宿主菌制备成高效率的电转化感受态细胞；然后将 PykA基因的敲除组件导入该感受态细胞混勻后进行工程宿主菌的敲除操作，并对其进行诱导以丢失PKD46质粒；之后对工程宿主菌MD-ptsG—中pykA基因缺失进行验证及抗性基因的消除，最终获得PtsG基因与pykA基因均缺失的工程宿主菌，命名为MD-ptsG_+pykA_ ；步骤三对工程宿主菌MD-ptsG.+pykA—中的pykF基因进行敲除首先构建工程宿主菌MD-ptsG_+pykA__中pykF基因的敲除组件，具体操作是取pKD13质粒作为模板，并合成一对含有PykF基因的短同源片段序列作为PCR的引物对，接着进行PCR扩增，PCR扩增结束后，于冰中放置15min后，对扩增产物用Dpn I酶于37°C下处理lh，酶处理结束后再于冰中放置5min，之后进行电泳回收，并将回收片段进行测序验证，序列结果显示其与理论相符， 即pykF基因的敲除组件构建成功；接着将Red系统中编码有Red重组酶的pKD46质粒植入工程宿主菌MD-ptsG_+pykA__后，把该工程宿主菌制备成高效率的电转化感受态细胞；然后将PykF基因的敲除组件导入该感受态细胞混勻后进行工程宿主菌的敲除操作，并对其进行诱导以丢失PKD46质粒；之后对工程宿主菌MD-ptSG-+pykA-中pykF基因缺失进行验证及抗性基因的消除，最终获得PtsG基因、pykA基因及pykF基因均缺失的工程宿主菌，命名为 MD_ptsG、pykA、pykF_ ；步骤四将工程质粒Mdphe-2植入工程宿主菌MD-ptsG_+pykA_+pykF_当中进行表达，以完成新的L-苯丙氨酸基因工程菌的构建；并对该新的L-苯丙氨酸基因工程菌的遗传稳定性及产酸进行验证。进一步地，所述工程宿主菌为大肠杆菌。本发明体一种增强L-苯丙氨酸合成代谢途径的方法的有益效果在于利用Red 介导的同源重组基因依次将工程宿主菌中的PtsG基因、pykA基因及pykF基因进行敲除， 其中，ptsG基因的缺失能够很大程度地降低工程宿主菌对葡萄糖的摄取速率，从而可降低乙酸的积累以促进菌体的生长，同时还会增强芳香族氨基酸前体物之一的PEP的获取度； pykA基因及pykF基因的缺失能够提高PEP的获取度，进而增强了 L-苯丙氨酸合成代谢途径，提高工程菌发酵L-苯丙氨酸的能力，从而为工业化生产带来更大的效益。
具体实施方式葡萄糖的吸收需要糖-磷酸基转移系统，一分子葡萄糖需一分子PEP，合成一分子的分支酸需两分子的PEP，所以PEP成为DAHP理论产量的限制性底物，PEP的供应量多少决定了 Phe的生物合成；而PEP又是PEP羧化酶、丙酮酸激酶、糖-磷酸基转移酶和DAHP合成酶的竞争性底物。Imol葡萄糖进入细胞要将Imol的PEP转变成丙酮酸，同时PEP又可在丙酮酸激酶和PEP梭化酶的作用下分别生成丙酮酸和草酞乙酸，丙酮酸在生物体内因为高能障而不能自发地转变回PEP，使大量的碳流就经丙酮酸而生成有机酸、二氧化碳和细胞的内容物。本发明为了使代谢流流向Phe生成的方向，对工程宿主菌种与丙酮酸代谢的相关基因ptsG、pykA和pykF进行敲除，其具体包括以下几个步骤步骤一、对L-苯丙氨酸基因工程宿主菌中的PtsG基因进行敲除，具体方法如下 (以大肠杆菌为L-苯丙氨酸基因工程宿主菌)
(l)ptsG基因的敲除组件的构建根据NCBI公布大肠杆菌的基因组序列，设计一对含有PtsG的短同源片段序列的引物如下，并委托生物工程(上海)有限公司利用DNA合成仪合成RED-ptsG-F :GATGCCCTGTACACGGCGAGGCTCTCCCCCCTTGCCACGCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTRED-ptsG-R :GCAGCCATCTGGCTGCCTTAGTCTCCCCAACGTCTTACGGATTCCGGGGATCCGTCGAC以pKD13质粒为模板，上述引物(RED-ptsG-F/R)为引物对进行PCR扩增，扩增反应体系(50 μ 1体系)如下
权利要求
1.一种增强L-苯丙氨酸合成代谢途径的方法，其特征在于采用Red系统依次对L-苯丙氨酸基因工程宿主菌中的PtsG基因、pykA基因及pykF基因进行敲除；然后将工程质粒 Mdphe-2植入ptsG基因、pykA基因及pykF基因均已敲除的该工程宿主菌内以构建新的 L-苯丙氨酸基因工程菌；最后对该新的L-苯丙氨酸基因工程菌的遗传稳定性及产酸进行验证。
2.如权利要求1所述的一种增强L-苯丙氨酸合成代谢途径的方法，其特征在于包括以下几个步骤步骤一对L-苯丙氨酸基因工程宿主菌中的ptsG基因进行敲除首先构建ptsG基因的敲除组件，具体操作是取PKD13质粒作为模板，并合成一对含有PtsG基因的短同源片段序列作为PCR的引物对，接着进行PCR扩增，PCR扩增结束后，于冰中放置15min后，对扩增产物用Dpn I酶于37°C下处理lh，酶处理结束后再于冰中放置5min，之后进行电泳回收， 并将回收片段进行测序验证，序列结果显示其与理论相符，即PtsG基因的敲除组件构建成功；接着将Red系统中编码有Red重组酶的pKD46质粒植入工程宿主菌后，把该工程宿主菌制备成高效率的电转化感受态细胞；然后将PtsG基因的敲除组件导入该感受态细胞混勻后进行工程宿主菌的敲除操作，并对其进行诱导以丢失PKD46质粒；之后对工程宿主菌中 PtsG基因缺失进行验证及抗性基因的消除，最终获得ptsG基因缺失的工程宿主菌，并命名为 MD-ptsG"；步骤二 对步骤一获得的工程宿主菌MD-ptSG_*&pykA基因进行敲除首先构建工程宿主菌MD-ptsG_中pykA基因的敲除组件，具体操作是取pKD13质粒作为模板，并合成一对含有PykA基因的短同源片段序列作为PCR的引物对，接着进行PCR扩增，PCR扩增结束后， 于冰中放置15min后，对扩增产物用Dpn I酶于37°C下处理lh，酶处理结束后再于冰中放置5min，之后进行电泳回收，并将回收片段进行测序验证，序列结果显示其与理论相符，即 pykA基因的敲除组件构建成功；接着将Red系统中编码有Red重组酶的pKD46质粒植入工程宿主菌MD-ptsG_后，把该工程宿主菌制备成高效率的电转化感受态细胞；然后将pykA基因的敲除组件导入该感受态细胞混勻后进行工程宿主菌的敲除操作，并对其进行诱导以丢失pKD46质粒；之后对工程宿主菌MD-ptsG—中pykA基因缺失进行验证及抗性基因的消除， 最终获得PtsG基因与pykA基因均缺失的工程宿主菌，命名为MD-ptsG_+pykA_ ；步骤三对工程宿主菌MD-ptsG.+pykA—中的pykF基因进行敲除首先构建工程宿主菌 MD-ptSG-+pykA-中pykF基因的敲除组件，具体操作是取pKD13质粒作为模板，并合成一对含有PykF基因的短同源片段序列作为PCR的引物对，接着进行PCR扩增，PCR扩增结束后， 于冰中放置15min后，对扩增产物用Dpn I酶于37°C下处理lh，酶处理结束后再于冰中放置5min，之后进行电泳回收，并将回收片段进行测序验证，序列结果显示其与理论相符，即 pykF基因的敲除组件构建成功；接着将Red系统中编码有Red重组酶的pKD46质粒植入工程宿主菌MD-ptsG_+pykA__后，把该工程宿主菌制备成高效率的电转化感受态细胞；然后将 PykF基因的敲除组件导入该感受态细胞混勻后进行工程宿主菌的敲除操作，并对其进行诱导以丢失PKD46质粒；之后对工程宿主菌MD-ptSG-+pykA-中pykF基因缺失进行验证及抗性基因的消除，最终获得PtsG基因、pykA基因及pykF基因均缺失的工程宿主菌，命名为 MD-ptsG>pykA>pykF"；步骤四将工程质粒Mdphe-2植入工程宿主菌MD-ptsG_+pykA_+pykF_i中进行表达，以完成新的L-苯丙氨酸基因工程菌的构建；并对该新的L-苯丙氨酸基因工程菌的遗传稳定性及产酸进行验证。
3.如权利要求1或2所述的一种增强L-苯丙氨酸合成代谢途径的方法，其特征在于 所述工程宿主菌为大肠杆菌。
全文摘要
本发明涉及一种增强L-苯丙氨酸合成代谢途径的方法，采用Red系统依次对L-苯丙氨酸基因工程宿主菌中的ptsG基因、pykA基因及pykF基因进行敲除；然后将工程质粒Mdphe-2植入ptsG基因、pykA基因及pykF基因均已敲除的工程宿主菌内以构建新的L-苯丙氨酸基因工程菌；最后对该新的L-苯丙氨酸基因工程菌的遗传稳定性及产酸进行验证。本发明的优点在于不仅能够很大程度地降低工程宿主菌对葡萄糖的摄取速率，从而可降低乙酸的积累以促进菌体的生长；而且可提高芳香族氨基酸前体物之一的PEP的获取度(降低PEP丙酮酸代谢支路的消耗)，进而增强了L-苯丙氨酸合成代谢途径，提高工程菌发酵L-苯丙氨酸的能力。
文档编号C12N15/63GK102191237SQ201110073090
公开日2011年9月21日 申请日期2011年3月25日 优先权日2011年3月25日
发明者吴伟斌, 吴松刚, 施巧琴, 翁雪清, 赵燕玉, 黄祥峰, 黄钦耿 申请人:福建省麦丹生物集团有限公司