专利名称：一种表达重组阳离子抗菌肽g13大肠杆菌基因工程菌的构建的制作方法
技术领域：
本发明提出的一种表达重组阳离子抗菌肽G13大肠杆菌基因工程菌的构建，属于基因工程和生物技术领域，涉及使用优化的融合头，将融合头基因与抗菌肽基因连接，构建重组质粒，转化大肠杆菌BL21感受态细胞，提高表达产量。
背景技术：
抗生素滥用已造成严重的卫生、健康和环境问题，寻找传统抗生素的天然替代物是目前研究热点。阳离子抗菌肽(cationic antimicrobial peptides, AMPs)是在诱导条件下，生物体免疫系统产生的带净正电荷的两性小分子活性肽类。阳离子抗菌肽通过与细胞膜上的阴离子相互作用，破坏膜结构，形成离子通道使胞质外泄，继而细菌裂解死亡。这种独特的杀菌机制不易产生耐药性菌株。目前，一些抗菌肽已经进入前期临床和临床实验， 在念珠菌感染、癌症病人口腔溃疡以及作为饲料添加剂方面都有研究。阳离子抗菌肽在医疗、畜牧、食品等领域有着广阔的发展前景。目前生产抗菌肽的方法主要有三种1.直接从机体中提取天然抗菌肽；2.化学方法合成抗菌肽；3.利用基因工程技术生产抗菌肽。天然抗菌肽在生物体中的含量极低，且分子量小，分离纯化困难，所以直接提取并不适合于大规模生产。化学合成法虽然发展较早，但仍存在着生产成本昂贵、准确度较低等缺点，制约了其在大规模工业化生产中的有效应用。目前，基因工程技术的发展极大地促进了抗菌肽的研究和开发，采用DNA重组技术来获得基因工程抗菌肽已经成为抗菌肽领域研究的重点之一。对于重组抗菌肽需要解决下面主要问题。1、重组抗菌肽引起宿主细胞死亡将降低表达产量，需要针对不同抗菌肽分子研发相应的高效重组表达技术和工艺。原核表达系统成本较低，仍然是首选的表达方法。采取融合表达的策略，即利用各种带净负电荷的融合头来抑制目的抗菌肽对宿主细胞的毒性，而在诱导表达后，再用化学试剂切割去掉融合头，恢复活性。这样既能得到较大的表达产量， 且以较低的纯化成本得到具有生物活性的抗菌肽。2、融合头的合理设计是影响表达效率的关键因素。通常融合表达能够提高翻译效率，增强目的片段尤其是小分子多肽在细胞内的稳定性。特别是对于阳离子抗菌肽来说，融合头所带的负电荷还可以中和其对于宿主细胞的毒性，从而提高表达产量。融合头的疏水性氨基酸所占比例还影响到融合蛋白是以可溶形式还是包涵体形式存在。但如果融合头的序列过长，会使目的片段在融合蛋白中所占比例过小，使得目的片段的实际表达产量降低。
发明内容
本发明提出的一种表达重组阳离子抗菌肽G13大肠杆菌基因工程菌的构建。阳离子抗菌肽G13是具有α螺旋结构和无规卷曲、兼具亲水性和疏水性的多肽，呈现广谱的抗菌活性，对动物细胞的毒性较低，具有开发应用价值。本方法设计一种较短的融合头，其含有较高的疏水性，C末段具有较多的负电荷，将抗菌肽基因连接到融合头基因的下游，构建重组质粒，转化大肠杆菌细胞。该融合头产生以下效果1、保护小分子目的抗菌肽；2.中和抗菌肽对宿主细胞的毒性；3.疏水性氨基酸的增加有利于形成包涵体，从而方便下游的分
离纯化。本发明的技术方案为一种表达重组阳离子抗菌肽G13大肠杆菌基因工程菌的构建，其特征在于含有核苷酸序列SEQ ID :N0 1 CAAAGATCCGTTTCTAACGCTGCTACTAGAGTTTGTAGAACTGGTAGATCCAGATGG ；SEQ ID :N0 2 ATGTCTGATAAAATTATTCATCTGACTGATGATTCTTTTGATACTGATGTACTTAAGGCAGATGGTGCA ATCCTGGTTGGTGATGACGATGACAAGGTACCTATGCATGAGCTCGAGATCTTCGAATTC。上述构建的一种表达重组阳离子抗菌肽G13大肠杆菌基因工程菌的构建，其特征在于编码的氨基酸序列是SEQ ID :N0 3 MQRSVSNAATRVCRTGRSRff ；SEQ ID :N0 4 MSDKIIHLTDDSFDTDVLKADGAILV⑶DDDKVPMHELEIFEF。上述两种的一种表达重组阳离子抗菌肽G13大肠杆菌基因工程菌的构建，其特征在于利用硫氧还蛋白的片段增强表达的稳定性，且该片段的C末端负电荷可有效抑制阳离子抗菌肽的毒性。以上所述的一种表达重组阳离子抗菌肽G13大肠杆菌基因工程菌的构建，其特征在于它的表达产物前添加溴化氢切割位点(Met)，有利于G13的纯化，便于工业化生产。技术方案所依据的科学原理阳离子抗菌肽的正电荷对于其生物学活性是必需的，它们有助于抗菌肽分子与靶标例如细菌细胞膜或核酸分子的结合。利用融合表达，融合头中的酸性氨基酸可以抑制目的抗菌肽对宿主细胞的毒性。该融合头长度较短，比通常的硫氧还蛋白融合头减少了近90 个氨基酸，融合蛋白的总长度为63个氨基酸，处在一个有利于高效表达的范围之内，同时极大提高了目的抗菌肽在融合蛋白中的比例，提高了重组抗菌肽的实际表达量。构建阳离子抗菌肽G13大肠杆菌基因工程菌的方法用限制性内切酶切割、连接酶连接等常规DNA重组与基因工程技术。构建阳离子抗菌肽G13大肠杆菌基因工程菌的步骤如下1、合成抗菌肽基因；2、基因扩增根据密码子偏好合成抗菌肽基因，末端含限制性内切酶识别序列，使用PCR技术进行扩增；3、克隆与转化用DNA重组技术将扩增的基因克隆至载体质粒，构建获得重组质粒1 ；将重组质粒1转化大肠杆菌感受态细胞，在含抗生素的培养基筛选和培养细胞；4、提取重组质粒1，以其为模板做反向PCR ；所用的引物是以融合头的DNA序列为依据设计合成的一段方向相反、中间间隔一段核苷酸序列的引物；
5、纯化扩增得到的片段，磷酸激酶处理后，连接酶重新连接，得到重组质粒2 ；6、将重组质粒2转化大肠杆菌BL21感受态细胞；7、诱导表达振荡培养基因工程菌至对数生长期，然后加入诱导剂诱导3-5小时， 培养温度37摄氏度；8、分离纯化破碎大肠杆菌细胞；将破碎液用阳离子交换树脂吸附，洗脱得到阳离子抗菌肽。技术效果1.高效稳定表达缩短的融合头仍然带足够的净负电荷，抑制了抗菌肽对宿主的毒性，融合蛋白的表达量得到显著提高。2.目的蛋白在融合蛋白中所占的比例增加。3.蛋白能大量表达在目的蛋白前引入化学切割位点，使得下游分离纯化能以较低成本进行，利于工业化生产。
图1是重组质粒构建示意图。图2是重组抗菌肽基因工程菌构建示意图。图3是纯化后的重组抗菌肽对革兰氏阴性菌大肠杆菌的抑菌效果图。
具体实施例方式图1、2表示了构建阳离子抗菌肽G13大肠杆菌基因工程菌的原理和生产流程，步骤如下1、合成抗菌肽基因由上海生工生物技术公司采用固相亚磷酰胺三酯法用DNA合成仪合成G13 ；2、基因扩增以合成的G13序列为模板，上游引物加入EcoR I酶切位点和Met密码子，下游引物加入I酶切位点和终止密码子；引物如下G13F :5，-AGAATTCATGCAGCGTTCTGTGTC TAAC-3，，G13R 5' -ATTGTCGACTTACCAACGAGAACGACCAG-3，，反应条件94°C 30s, 62 °C 15s, 72°C 15s, 30个循环，72°C IOmin, PCR产物经1 %琼脂糖电泳检测，试剂盒回收G13片段；3、克隆与转化PCR产物和载体均用EcoR I、Ml I双酶切，酶切产物经纯化后，T4DNA连接酶连接，得到重组质粒1 :PThioHisA-G13，重组质粒1转化BL21(DE!3)感受态细胞，氨苄青霉素筛选阳性克隆，提取重组质粒1测序鉴定；4、以重组质粒1为模板反向PCR，设计一对引物Pl :5，-AACCAGGATTGCACCAT-3，， P2 :5，-GGTGATGACGATGACAAG-3，，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测；5、大肠杆菌T4噬菌体多聚核苷酸激酶(T4PN)催化末端磷酸化，T4DNA连接酶连接，得出重组质粒2;6、重组质粒2转化BL21 (DE3)，氨苄青霉素筛选阳性克隆，提取重组质粒2测序鉴定；7、诱导表达
将重组质粒2的工程菌接种至含氨苄青霉素(50 μ g/mL)的LB培养基中37°C过夜振荡培养。菌液按量接种至新鲜LB培养基，37°C振荡培养至0D600 ^ 0. 5时加入终浓度 lmmol/L 的 IPTG，诱导 4h，9000r/min 离心 lOmin，收集菌体，菌体重悬于 BufferA :50mmol/ LTris · HCl ρΗ7· 9 ；0. 5mmol/L EDTA ；50mmol/L NaCl ；5%甘油；0. 5mmol/L DTT ；8、分离纯化超声破碎超声4s，间隔6s，120次，功率500W, 12000r/min离心IOmin,沉淀用 Buffer :50mmol/L Tris 'HCl ρΗ7· 9 ；0.5mmol/L EDTA ；50mmol/L NaCl ；1% Triton X-IOO ； 0. 5mmol/L DTT 洗涤，4°C 12000r/min 离心 15min ；洗涤后的包涵体溶于尿素8mol/L Urea,0. lmol/L HCl，按照蛋白质溴化氰= 1 5 (W/W)加入400mg/ml溴化氰溶液，室温避光切割MH，加入1倍体积ddH20终止反应，PB 缓冲液透析48h ；透析产物经0. 45 μ m滤膜过滤后上CM-32阳离子交换柱，0 lmol/L NaCl 梯度洗脱，收集目的峰，Tricine-SDS-PAGE电泳检测纯化产物，纯化后样品透析脱盐后冻干，溶于pH7.210mmol/L PBS缓冲液中，得到大肠杆菌基因工程菌的阳离子抗菌肽G13。图3显示了阳离子抗菌肽G13杀菌效果，阳离子抗菌肽G13对革兰氏阴性菌如大肠杆菌及革兰氏阳性菌如枯草杆菌都有抑杀效果。
权利要求
1.一种表达重组阳离子抗菌肽G13大肠杆菌基因工程菌的构建，其特征在于含有核苷酸序列SEQ ID :N0 1 CAAAGATCCGTTTCTAACGCTGCTACTAGAGTTTGTAGAACTGGTAGATCCAGATGG ；SEQ ID =NO 2 ATGTCTGATAAAATTATTCATCTGACTGATGATTCTTTTGATACTGATGTACTTAAGGCAGATGGTGCAATCC TGGTTGGTGATGACGATGACAAGGTACCTATGCATGAGCTCGAGATCTTCGAATTC。
2.根据权利要求1所述的一种表达重组阳离子抗菌肽G13大肠杆菌基因工程菌的构建，其特征在于编码的氨基酸序列是SEQ ID =NO 3 MQRSVSNAATRVCRTGRSRff ；SEQ ID =NO 4 MSDKIIHLTDDSFDTDVLKADGAILV⑶DDDKVPMHELEIFEF。
3.根据权利要求1或2所述的一种表达重组阳离子抗菌肽G13大肠杆菌基因工程菌的构建，其特征在于利用硫氧还蛋白的片段增强表达的稳定性，且该片段的C末端负电荷可有效抑制阳离子抗菌肽的毒性。
4.根据权利要求1或2所述的一种表达重组阳离子抗菌肽G13大肠杆菌基因工程菌的构建，其特征在于它的表达产物前添加溴化氢切割位点(Met)。
5.根据权利要求1或2所述的一种表达重组阳离子抗菌肽G13大肠杆菌基因工程菌的构建，其特征在于表达重组阳离子抗菌肽G13大肠杆菌基因工程菌的构建步骤如下(1)、合成抗菌肽基因用固相亚磷酰胺三酯法用DNA合成仪合成G13 ；O)、基因扩增以合成的G13序列为模板，上游引物加入EcoR I酶切位点和Met密码子，下游引物加入I酶切位点和终止密码子；引物如下G13F 5‘-AGAATTCATGCAGCGTTCTGTGTCTAAC-3‘ ，G13R:5，-ATTGTCGACTTACCAACGAGAACGACCAG-3，，反应条件-MV 30s, 62°C 15s，72°C 15s, 30个循环，72°C 10min，PCR产物经1 %琼脂糖电泳检测，试剂盒回收G13片段；(3)、克隆与转化PCR产物和载体均用EcoR I.Sal I双酶切，酶切产物经纯化后，T4DNA连接酶连接，得到重组质粒1 :PThioHisA-G13，重组质粒1转化BL21(DE!3)感受态细胞，氨苄青霉素筛选阳性克隆，提取重组质粒1测序鉴定；(4)、以重组质粒1为模板反向PCR，设计一对引物Pl:5’ -AACCAGGATTGCACCAT-3’，P2 5，-GGTGATGACGATGACAAG-3，，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测；(5)、大肠杆菌T4噬菌体多聚核苷酸激酶(T4PN)催化末端磷酸化，T4DNA连接酶连接， 得出重组质粒2 ；(6)、重组质粒2转化BL21(DE3)，氨苄青霉素筛选阳性克隆，提取重组质粒2测序鉴定；(7)、诱导表达将重组质粒2的工程菌接种至含氨苄青霉素(50 μ g/mL)的LB培养基中37°C过夜振荡培养。菌液按量接种至新鲜LB培养基，37°C振荡培养至0D600 ^ 0. 5时加入终浓度 lmmol/L 的 IPTG，诱导 4h，9000r/min 离心 lOmin，收集菌体，菌体重悬于 BufferA :50mmol/ LTris · HCl ρΗ7· 9 ；0. 5mmol/L EDTA ；50mmol/L NaCl ；5%甘油；0. 5mmol/L DTT ；(8)、分离纯化超声破碎超声4s，间隔6s，120次，功率500W，12000r/min离心lOmin，沉淀用 Buffer :50mmol/L Tris 'HCl ρΗ7· 9 ；0.5mmol/L EDTA ；50mmol/L NaCl ；1%Triton X-IOO ； 0. 5mmol/L DTT洗涤，4°C 12000r/min离心15min ；洗涤后的包涵体溶于尿素8mol/L Urea, 0. lmol/L HC1，按照蛋白质溴化氰=1 5 (W/W)加入400mg/ml溴化氰溶液，室温避光切割MH，加入1倍体积ddH20终止反应，PB缓冲液透析48h ；透析产物经0. 45 μ m滤膜过滤后上CM-32阳离子交换柱，0 lmol/L NaCl梯度洗脱，收集目的峰，Tricine-SDS-PAGE电泳检测纯化产物，纯化后样品透析脱盐后冻干，溶于pH7. 2 10mmol/L PBS缓冲液中，得到大肠杆菌基因工程菌生产的的重组阳离子抗菌肽G13。
全文摘要
本发明公开了一种表达重组阳离子抗菌肽G13大肠杆菌基因工程菌的构建，属于基因工程和生物技术领域，涉及将融合头基因与抗菌肽基因连接，构建重组质粒，转化大肠杆菌BL21感受态细胞，提高表达产量，获得更有效的治疗。其目的是设计一种较短的融合头，其含有较高的疏水性，C末段具有较多的负电荷，使其能达到保护小分子目的抗菌肽；中和抗菌肽对宿主细胞的毒性；本发明的阳离子抗菌肽包括带净正电荷的α螺旋型两亲抗菌肽，并含有核苷酸序列SEQ IDNO 1和SEQ IDNO 2。构建的方法是用限制性内切酶切割、连接酶连接等DNA重组与基因工程技术。
文档编号C12N15/70GK102212541SQ20111007597
公开日2011年10月12日 申请日期2011年3月28日 优先权日2011年3月28日
发明者余忠丽, 刘杨, 卢颖虎, 彭霞, 恽辉, 查向东, 梁琳 申请人:广东希普生物科技股份有限公司