专利名称：一株γ-聚谷氨酸合成菌及其发酵方法
技术领域：
本发明涉及利用微生物发酵的方法合成生物大分子Y-聚谷氨酸，具体涉及到一株地衣芽孢杆菌Bacillus lincheniformis CDL-1及其发酵方法。
背景技术：
二十世纪30年代，人们首先在炭疽杆菌的荚膜中发现了 Y-聚谷氨酸。Y-聚谷氨酸是一种由D-谷氨酸和L-谷氨酸单体通过Y-酰胺键缩合而成的多肽分子。通常其相对分子质量在10万到1000万之间。它的结构式如图所示y -PGA具有优良的生物相容性，是一种可降解的生物高分子材料。它的水溶性极佳；主链上含有大量游离的羧基，使Y-PGA具有水溶性聚羧酸的性质。交联Y-PGA具有强吸水保湿性能，可用于土壤、沙地的蓄水保水剂，化妆品的保湿剂，水果、蔬菜的防冻剂， 食品的增稠剂，以及作为废水处理所需的生物絮凝剂、重金属螯合剂，用作分散剂等。对 Y-PGA进行一些功能化修饰，其衍生物能够在血液循环中保留较长时间，对靶向给药和药物缓释具有重要意义。Y-聚谷氨酸的分子量与其应用密切相关。一般高分子量的Y-聚谷氨酸可以用作高强吸水材料，但分子量越大其流变性越难控制，也很难被化学试剂修饰，从而限制了 Y-聚谷氨酸的应用。目前关于Y-聚谷氨酸分子量与发酵条件的关系的研究也已经广泛受到了人们的关注。
发明内容
本发明的目的之一是提供一株Y-聚谷氨酸合成菌地衣芽胞杆菌本发明所提供的菌株地衣芽胞杆菌Bacillus lincheniformis CDL-1分离自发酵食品，在固体平板上表现为菌落呈圆形、边缘整起湿润、粘稠、半透明状。革兰氏染色呈阳性，通过16S rDNA以及微生物鉴定系统BIOLOG的实验结果，确定为地衣芽孢杆菌，命名为地衣芽孢杆菌Bacillus lincheniformis CDL-1。将该菌株保藏在中国典型培养物保藏中心(中国武汉，武汉大学内)，保藏编号为CCTCC NO :2011076，保藏日期为:2011年 3 月 22 日。本发明的第二个目的是提供利用地衣芽孢杆菌Bacillus lincheniformis CDL-1 发酵生产Y-聚谷氨酸的培养方法。本发明采取以下技术方案(1)菌种活化接种地衣芽孢杆菌Bacillus lincheniformis CDL-1至LB固体培养基，37°C恒温培养M小时；
Bacilluslincheniformis CDL-1。
(2)种子培养将固体平板活化的菌种接种至5ml种子培养基中，37 °C， 170-200rpm震荡培养12小时；(3)摇瓶发酵以至2%的接种量将种子液接入发酵培养基中，37°C， 170-220rpm振荡培养24-48小时；(4)将发酵液调至pH 6. 0，8000rpm，4°C离心20min，取上清用4倍无水乙醇沉淀， 收集沉淀用蒸馏水溶解，透析处理M-48小时，然后经冷冻干燥得到发酵产物。利用地衣芽胞杆菌Bacillus lincheniformis CDL-1发酵合成Y-聚谷氨酸的方法中各培养基组分如下(I)LB 固体培养基蛋白胨 10g/L，酵母粉 5g/L，NaCl 5g/L，琼脂％ 2，ρΗ7· 0-7. 2。(2)种子培养基葡萄糖 50g/L，L-谷氨酸 15g/L，NaCl 0. 5g, KH2P042. 7g/L, Na2HPO4 ‘ 12H20 4. 2g/L，MgSO4 ·7Η20 0. 5g/L，生物素 5 X l(T4g/L，pH 6. 4-7. O0 (3)发酵培养基葡萄糖 50-75g/L, L-谷氨酸 15-20g/L, NaCl 0. 5g, ΚΗ2Ρ042· 7g/L, Na2HPO4 · 12H20 4. 2g/ L, MgSO4 · 7H20 0. 5g/L,生物素 5X l(T4g/L，pH 6. 4-7. 0。本发明的突出优点在于提供了一株能够稳定合成Y-聚谷氨酸的菌株地衣芽孢杆菌Bacillus lincheniformis CDL-1，其发酵方法简单易行，条件易于控制；且其发酵产物纯度高，分子量分布窄，能够较好的应用于Y -聚谷氨酸的生产。
图1是地衣芽孢杆菌Bacillus lincheniformis CDL-I的系统进化树。
具体实施例方式在下面的实施例中所用菌种均为地衣芽孢杆菌Bacillus lincheniformis CDL-1,实施例中不同培养基及溶液配方如下(I)LB 固体培养基蛋白胨 10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 5g/L，琼脂％2，pH 7.0-7.2。(2)菌种筛选培养基葡萄糖 50g/L, L-谷氨酸 15g/L，NaCl 0. 5g，KH2P042. 7g/L， Na2HPO4 ‘ 12H20 4. 2g/L，MgSO4 · 7H20 0. 5g/L，生物素 5X l(T4g/L，琼脂 2%，pH 7.0。(3)种子培养基葡萄糖 50g/L, L-谷氨酸 15g/L，NaCl 0. 5g，ΚΗ2Ρ042· 7g/L， Na2HPO4 · 12H20 4. 2g/L, MgSO4 · 7H20 0. 5g/L,生物素 5X l(T4g/L，pH 6. 4-7. 0。(4)发酵培养基葡萄糖 50-75g/L，L-谷氨酸 15_20g/L，NaCl 0. 5g，KH2P042. 7g/ L, NaHPO4 · 12H20 4. 2g/L, MgSO4 · 7H20 0. 5g/L,生物素 5 X 10_4g/L，pH 6. 4-7. 0。以下实例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1、分离鉴定地衣芽孢杆菌Bacilluslincheniformis CDL-I该菌株分离至豆腐乳类发酵食品。具体实施步骤如下从发酵食品中取Ig实验材料接入已灭菌的100ml LB培养液中，磁力搅拌30分钟，使其分散均勻。于100°C处理15min，然后将三角瓶置于摇床中37°C， 170r/min振荡培养1 富集菌种。而后用0. 85%的生理盐水10倍梯度稀释菌液。将10_2， 10_3两个梯度分别吸取200 μ L涂布固体平板，置于37°C恒温箱中培养Mh。而后观察黏性的单菌落，挑出在固体平板上多次划线纯化。经过革兰氏染色、16S rDNA基因序列分析以及BIOLOG微生物分类鉴定系统确定该菌株为地衣芽孢杆菌，命名为地衣芽孢杆菌Bacillus IincheniformisCDL-I。实施例2、利用地衣芽孢杆菌Bacilluslincheniformis CDL-1发酵生产Y -聚谷氨酸以及发酵产物的理化性质检测1)菌种活化将_80°C保藏的地衣芽孢杆菌Bacillus lincheniformis CDL-1接种至LB固体平板上，37°C恒温静置培养M小时；(2)种子培养将固体平板活化的菌种转接至5ml种子培养基中，37°C，170rpm振荡培养12小时；(3)摇瓶发酵以的接种量将种子液接入发酵培养基中，37°C，170rpm振荡培养24小时；(4) γ -聚谷氨酸产量的测定将发酵液调PH至6，8000rpm，4°C离心20分钟取出菌体，用4倍体积无水乙醇沉淀上清液，6000rpm, 4°C离心20分钟得到沉淀。用蒸馏水溶解， 透析处理48小时，然后冷冻真空干燥，称重。(5)采用FT-IR^H-NMR，紫外吸收光谱等确定发酵产物为Y -聚谷氨酸。(6) γ -聚谷氨酸分子量的测定采用凝胶渗透色谱法测定发酵产物Y -聚谷氨酸的分子量，结果表明，通过本培养条件培养地衣芽孢杆菌Bacilluslincheniformis CDL-1， 发酵得到的Y-聚谷氨酸的分子量为351KD。实施例3、地衣芽孢杆菌Bacillus lincheniformis CDL-1发酵48小时后产物分
子量的测定。摇瓶发酵，振荡培养48小时，其它条件与实施例2同。结果表明，经过48小时培养后地衣芽孢杆菌Bacillus lincheniformis CDL-I发酵得到的Y-聚谷氨酸的分子量为 347KD。
权利要求
1.一株γ-聚谷氨酸合成菌地衣芽胞杆菌Bacillus lincheniformis CDL-1。
2.利用地衣芽胞杆菌Bacilluslincheniformis CDL-1发酵合成Y-聚谷氨酸的方法为(1)菌种活化接种地衣芽孢杆菌Bacilluslincheniformis CDL-I至LB固体培养基， 37 °C恒温培养M小时；(2)种子培养将固体平板活化的菌种接种至5ml种子培养基中，37°C，170rpm振荡培养12小时；(3)摇瓶发酵以1%至2 %的接种量将种子液接入发酵培养基中，370C，170rpm振荡培养24-48小时；(4)将发酵液调至pH6. 0，8000rpm，4°C离心20min，取上清用4倍无水乙醇沉淀，收集沉淀，用蒸馏水溶解，透析处理48小时，然后经冷冻干燥得到发酵产物Y-聚谷氨酸。
3.根据权利要求2所述的利用地衣芽胞杆菌Bacilluslincheniformis CDL-I发酵合成Y-聚谷氨酸的方法，其特征在于所用的培养基组分⑴种子培养基葡萄糖 50g/L, L-谷氨酸 15g/L，NaCl 0. 5g，KH2P042. 7g/L， Na2HPO4 · 12H20 4. 2g/L，MgSO4 ·7Η20 0. 5g/L，生物素 5X l(T4g/L，pH 6. 4-7. 0 ； (2)发酵培养基葡萄糖 50-75g/L, L-谷氨酸 15-20g/L, NaCl 0. 5g, ΚΗ2Ρ042· 7g/L, Na2HPO4 · 12H20 4. 2g/ L, MgSO4 · 7H20 0. 5g/L,生物素 5X l(T4g/L，pH 6. 4-7. 0。
全文摘要
本发明公开了一株γ-聚谷氨酸合成菌地衣芽胞杆菌Bacillus lincheniformisCDL-1及其发酵方法。本发明提供的γ-聚谷氨酸合成菌株能够合成分子量为300-350KD的γ-聚谷氨酸，且分子量分布窄，其流变性容易控制，易被化学试剂加工修饰，能够较好的应用在不同的领域。本发明提供的菌株传代稳定，培养方法简单易行，具有良好的应用前景。
文档编号C12R1/10GK102206597SQ20111007961
公开日2011年10月5日 申请日期2011年3月31日 优先权日2011年3月31日
发明者冯俊, 宋存江, 曹名锋, 李文炯, 杜阳, 杜骁, 王淑芳, 解慧 申请人:南开大学