专利名称：一株产咖啡酸的刺五加内生细菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株内生细菌。
背景技术：
植物内生菌是一个多样性十分丰富的微生物类群，它们生活在健康植物的各种组织和器官内部的细胞或细胞间隙内而不引起植物病变，是与寄主植物在长期的共同进化过程中建立起互惠共存、相互制约的和谐联合关系的一类微生物。近年来，植物内生菌作为一种新的微生物资源引起了广泛。植物内生细菌是产生活性物质和新化学物质的潜在资源，不但可以帮助维护人类健康，也可以维护动物和植物的健康。药用植物本身就能产生多种活性物质，实验研究表明，植物与内生细菌在相互作用的过程中，有内生细菌能产生与植物相同或相似的活性物质，因此从药用植物中分离到产生活性物质的内生细菌已成为当今学者的研究趋势。
发明内容
本发明提供了一株产咖啡酸的刺五加内生细菌。产咖啡酸的刺五加内生细菌，它为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CX33，属于芽孢杆菌属(Bacillus)，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC No M2011078，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏日期为2011年3月22日；它为革兰氏阳性杆菌，长为2. 0 3. 0 μ m，宽为0. 7 0. 8 μ m,有芽孢、鞭毛和菌膜，在牛肉膏蛋白胨培养基上形成白色圆形菌落。本发明中产咖啡酸的刺五加内生细菌，它为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) CX33，其淀粉水解呈阳性、明胶液化呈阳性、接触酶试验呈阳性、脂酶试验呈阴性、甲基红呈阴性、乙酰甲基甲醇反应呈阳性，生长温度为10 50°C，最适生长温度为40°C，生长耐盐度为0. 5% 20%，生长耐盐度为2%，最适生长pH值为6. 8 7. 6。本发明中产咖啡酸的刺五加内生细菌，它为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) CX33，其16S rDNA序列通过GENBANK序列比对，CX33与序列号为AB199317. 1的枯草芽孢杆菌TCCC11021菌株序列相似性达到99%，结合细菌形态特征、生长条件、生理生化鉴定结果，确定枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CX33为芽孢杆菌属的一个新菌种。本发明中产咖啡酸的刺五加内生细菌，它为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) CX33，属于芽孢杆菌属(Bacillus)，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC No :M2011078，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏日期为2011年3月22日。本发明利用微生物制药手段提取分离刺五加健康植株的内生细菌，以抑菌活性为指标，采用滤纸片法进行抑菌实验，筛选得到某些抑菌活性较强的目的菌株，并以薄层层析法，HPLC法为分析手段，从刺五加内生细菌中找到能够产生活性成分的菌株，并从其发酵液中提取分离活性物质，测定其活性代谢产物，最后将获得的目的菌株通过形态学观察、生理生化实验测定和16S rDNA序列分析鉴定其种属。
本发明中产咖啡酸的刺五加内生细菌，它为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) CX33，其代谢物具有较好的抑菌活性，可为新型抗菌药物的筛选提供参考；同时从其代谢物中发现其含有咖啡酸，咖啡酸为止血升白细胞药，具有收缩增固微血管、提高凝血因子的功能、升高白细胞和血小板的作用，用于外科手术时预防出血或止血，以及内科、妇产科等出血性疾病的止血。也用于各种原因引起的白细胞减少症、血小板减少症。本发明对采用刺五加内生细菌CX33生产咖啡酸具有指导意义。
图1为具体实施方式
一中咖啡酸对照品的HPLC色谱图，其中a表示咖啡酸；图2 为具体实施方式
一中供试品的HPLC色谱图，其中a表示供试品CX33 ；图3为具体实施方式
一中加入对照品后供试品的HPLC色谱图，其中a表示加咖啡酸后供试品CX33a。
具体实施例方式具体实施方式
一本实施方式产咖啡酸的刺五加内生细菌，它为枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) CX33，属于芽孢杆菌属(Bacillus)，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC No :M2011078，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏日期为2011年3月 22日；它为革兰氏阳性杆菌，长为2. 0 3. 0 μ m，宽为0. 7 0. 8 μ m，有芽孢、鞭毛和菌膜， 在牛肉膏蛋白胨培养基上形成白色圆形菌落。本实施方式中枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) CX33，其进行常规生理生化鉴定，实验结果为淀粉水解呈阳性、明胶液化呈阳性、接触酶试验呈阳性、脂酶试验呈阴性、 甲基红呈阴性、乙酰甲基甲醇反应呈阳性。本实施方式中枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CX33，其生长温度为10 50°C，最适生长温度为40°C，生长耐盐度为0.5% 20%，生长耐盐度为2%，最适生长pH 值为6. 8 7.6。本实施方式中产咖啡酸的刺五加内生细菌，它为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CX33，该菌株分离自健康野生刺五加植株，采自黑龙江省帽儿山地区，经黑龙江省中医研究院傅克治研究员鉴定为五加科植物刺五加Acanthopanax senticosus (Rupr. et Maxim) Harms，其样本现存于黑龙江大学生命科学学院生物制药专业实验室；它按以下步骤进行分离培养(1)材料预处理选取健康刺五加的根茎用自来水冲洗干净后以无菌滤纸吸干水分，切成Icm小段，备用；(2)表面消毒于无菌超净台内将刺五加的根茎按下述方法进行表面消毒95% 酒精浸泡Imin-IO %次氯酸钠浸泡5min-95%酒精浸泡30s_无菌水冲洗3次或者75%酒精浸泡lmin-10%双氧水浸泡15min-75%酒精浸泡Imin-无菌水冲洗3次；(3)阴性对照取最后一次无菌水冲洗液涂布培养平板或取适量此冲洗液倒入牛肉膏蛋白胨液体分离培养基内作对照，另将消毒后的实验材料在牛肉膏蛋白胨固体分离培养基上滚动一周作对照，于相同的条件下培养；(4)菌体培养将消毒后的实验材料分别置于液体和固体分离培养基中，于37°C 恒水浴摇床和温培养箱中，培养3 5d，待实验材料周围长出菌体，挑取菌体转入平板多次划线分离纯化，将纯化后的菌株置于斜面固体培养基中，4°C保存备用；
其中牛肉膏蛋白胨固体分离培养基每L由3. Og的牛肉膏、10. Og的蛋白胨、5. Og 的NaCl,16. Og的琼脂粉和余量的H2O组成，pH值为7. 0 7. 2，121°C下高压灭菌30min ；
牛肉膏蛋白胨液体分离培养基每L由3. Og的牛肉膏、10. Og的蛋白胨、5. Og的 NaCl和余量的H2O组成，pH值为7. 0 7. 2，121°C下高压灭菌30min ；斜面固体培养基为取5mL牛肉膏蛋白胨固体分离培养基装于试管中，121°C高压灭菌30min后，铺成斜面冷却，以备保存菌种。结果从刺五加根茎中分离出内生细菌，并且阴性对照中对照平板和对照液体培养基内均无任何菌长出，多次重复均如此，证明所分到的菌是植物内生细菌，而不是表面的附生菌。对筛选出的产咖啡酸的刺五加内生细菌进行常规生理生化鉴定；分子鉴定应用国际细菌鉴定通用引物进行pcr，得到约ieoobp的扩增片段，纯化后连入τ载体进行测序，转化的进行重组子检测，表明目的片段已经转入T载体，并成功在大肠杆菌中扩增，将菌液送往测序公司测序；其16S rDNA序列通过GENBANK序列比对，与序列号为AB199317. 1的枯草芽孢杆菌TCCC11021菌株序列相似性达到99%，结合细菌形态特征、生长条件、生理生化鉴定结果，确定筛选出的产咖啡酸的刺五加内生细菌为芽孢杆菌属的一个新菌种，命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CX33。本实施方式中产咖啡酸的刺五加内生细菌，它为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) CX33，它发酵液的抑菌活性实验，结果如表1所示，刺五加内生细菌发酵液的抑菌活性实验结果表明，CX33对屎肠球菌，粪肠球菌，酿脓链球菌，肺炎克雷伯菌均具有较强的抑制作用。表1CX33发酵液对12种试验菌的抑菌活性筛选结果
^lSt A__^__C__D__E__F____I__J__K__1_
CX33 ++ ++ ++ +++ +++ + +++ ++ ++ ++ +++ + Str +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ -Nys----------- 十十十注A 枯草芽孢杆菌；B 短小芽孢杆菌；C 金黄色葡萄球菌；D 粪肠球菌；E 屎肠球菌；F 单增李斯特菌；G 酿脓链球菌；H 大肠杆菌；I 铜绿假单孢菌J 鲍曼不动杆菌；K 肺炎克雷伯菌；L 白假丝酵母；Str 链霉素；Nys 制霉素；-无活性；+活性较弱，抑菌圈直径< Ilmm ；++活性中等，抑菌圈直径11 15mm ；+++活性较强，抑菌圈直径> 15mm。本实施方式中产咖啡酸的刺五加内生细菌，它为枯草芽孢杆菌(Bacillus subti 1 iS) CX33，它活性代谢物的检测如下a、CX33发酵液各组分的制备硅胶G板于120°C烘箱中活化lh，置干燥器内备用，分别吸取CX33供试品液各 5 μ L，以定量毛细管分别点于硅胶板(硅胶G+0. 25% CMC，相对湿度90%)上，以氯仿甲醇=9 1 (ν/ν)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯(254nm)下检视；供试品液有相应的清晰亮暗斑点，阴性对照液在相应位置上无任何斑点；将大量的供试品液进行薄层层析实验，在紫外灯(254nm)下记录层析后各个组 分的位置，刮取各部位的暗斑，溶于甲醇中，超声60min，以0. 45 μ m微孔滤膜过滤，取滤液，将滤液置于室温，挥干甲醇，得到少量固体，经过多次重结晶，得到纯度较高的各组分晶体，依次命名为CX33a，CX33b，置于4°C冰箱保存，备用；b、采用滤纸片法对CX33的活性组分进行抑菌实验，结果如表2所示，CX33的组分 CX33a, CX33b具有一定的抑菌活性；表2CX33各组分对12种试验菌的抑菌活性筛选结果
权利要求
1. 一株产咖啡酸的刺五加内生细菌，其特征在于它为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CX33，属于芽孢杆菌属(Bacillus)，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC No :M2011078，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏日期为2011年3月22日。
全文摘要
一株产咖啡酸的刺五加内生细菌，它涉及一株内生细菌。产咖啡酸的刺五加内生细菌，它为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CX33，属于芽孢杆菌属(Bacillus)，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NOM2011078，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏日期为2011年3月22日。本发明中产咖啡酸的刺五加内生细菌的代谢物具有较好的抑菌活性，可为新型抗菌药物的筛选提供参考；同时从其代谢物中发现其含有咖啡酸，咖啡酸为止血升白细胞药，具有收缩增固微血管、提高凝血因子的功能、升高白细胞和血小板的作用；对采用刺五加内生细菌CX33生产咖啡酸具有指导意义。
文档编号C12R1/125GK102154185SQ201110080188
公开日2011年8月17日 申请日期2011年3月31日 优先权日2011年3月31日
发明者刘玉洁, 卢玢宇, 孙婷媛, 徐翠, 郑春英 申请人:黑龙江大学