专利名称：一种新型泥鳅蛋白降压肽及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种从泥鳅肉的酶解产物中分离纯化出具有新的氨基酸序列的降压肽及其制备方法与应用，将现代生物技术应用于淡水水产品深加工，属于淡水水产品深加工技术领域。
背景技术：
食源性蛋白经酶解得到的水解产物大部分是几个氨基酸残基组成的短肽，这些短肽以完整的形式被吸收进入循环系统而被组织利用，具有许多生理活性抗氧化，提高免疫力，抗菌消炎，促进微量元素的被动转运过程及在体内储存、抗高血压活性等。血管紧张素转换酶(ACE)是一种含锌的二肽羧酸基肽酶，对调节血压起着关键性的作用，血管紧张素I(AngiotensinI)不具有活性，但是AI在ACE的作用下可以转变为具有活性的血管紧张素II，AII具有收缩血管平滑肌的活性功能，从而引起血压升高。ACE 抑制肽是对ACE活性区域亲和力较强的竞争性抑制剂，它们与ACE的活性中心的亲和力比 AngI或舒缓激肽对ACE的亲和力更强，并且降血压肽一旦和ACE活性中心结合，就难以释放出来，从而阻碍AngI转化为AngII以及催化水解舒缓激肽成为失活片段，起降血压作用。 人工合成的ACE抑制剂具有明显的降压效果，但是副作用太大。食源性蛋白通过不同的酶进行酶解，在其酶解物中发现了许多ACE抑制肽，这些ACE抑制肽安全、新颖、高效。目前报道的ACE抑制肽主要来源于牛奶、大豆、乳酪、鸡蛋、蛇毒、玉米、食用菌等， 水产动物蛋白也陆续报道，如马氏珠母贝、鲨鱼、草鱼等。泥鳅药用价值高，《本草纲目》记载泥鳅“暖中益气、醒酒、解消渴”。中医认为，泥鳅性味甘平，具有补中益气，祛湿邪之功效，经常食之、可防血管硬化，对高血压、贫血等心血管疾病患者都有辅助治疗作用。目前对泥鳅的研究和应用只限于泥鳅蛋白的抗氧化肽和粘液多糖的抗菌及免疫调节活性方面研究，但是泥鳅蛋白降血压肽研究未见报道。
发明内容
发明目的本发明的目的是为提供一种将泥鳅蛋白酶解及纯化得到的ACE活性较高的、易于消化吸收的新型降压肽。针对现有技术的不足，提供一种泥鳅蛋白降压肽的制备方法与应用。本发明所述的泥鳅蛋白降压肽Leu-Glu-Tyr，为白色粉末状，易溶于水，具有较高的血管紧张素转换酶(ACE)抑制活性，IC5tl值为0. 10;3mg/mL。技术方案本发明所述的泥鳅蛋白降压肽的制备方法酶解泥鳅蛋白制备酶解液、酶解液中降血压肽的分离纯化和序列测定，具体步骤如下(一)酶解泥鳅蛋白制备酶解液将泥鳅肉绞成肉糜，加水打浆，然后加入3% 0(w/w)菠萝蛋白酶(活力3X105U/g)，调节pH值到5. 5-6. 0，温度55-600C，搅拌酶解6小时，灭酶，转速3000rpm离心20min,
取上清液，即酶解液。( 二 )从酶解液中分离纯化降血压肽酶解液2%活性碳脱色20min，然后过2500Da的超滤膜超滤，将超滤小于2500Da 的超滤液过kphadex G-15柱，流速1. OmL/min，用蛋白质核酸检测仪，在^Onm处进行检测，自动部分收集仪收集洗脱液，冻干秤重后，测定ACE抑制活性，将抑制活性高的组分多次收集，然后进一步用反相高效液相色谱分离；半制备柱ZORBAX SB-C18，流速0.8mL/min， 流动相=A 水(含0. 1 % TFA, ν/ν) ；B 乙腈(含0. 1 % TFA, ν/ν)。紫外洗脱液在波长280nm 下进行检测，同一峰下的组分收集混合，冷冻干燥，测定ACE抑制活性，得到高活性的ACE抑制肽。(三)降血压肽的序列测定将分离纯化得到的具有高活力的ACE抑制肽，用6N的HCl在110°C全水解M小时， 用氨基酸自动测定仪测定氨基酸组成。同时，通过质谱仪分析肽的分子量和肽段的分布，然后进行肽的氨基酸序列分析。所述的(二)中测定肽的ACE抑制活性方法优选的是以N-[3_(2-呋喃)丙烯醇酰]-2-苯丙氨酰甘氨酰甘氨酸(FAPGG)为AngI模拟物的分光光度法，在酶标仪 (LB941Tristar, BertholdTechnologies, Bad ffilbad, Germany)上测定。FAPGG 在 ACE 的水解下生成N-[3-(2-呋喃)丙烯醇酰]-2-苯丙氨酸(FAP)和双甘肽(GG)，FAPGG的水解使340nm吸光度降低，降低速率与样品的ACE活性成正比。具体步骤如下将10 μ L的ACE溶液(0. 25U/mL)和10 μ L的蛋白酶解液加入微孔板的微孔中但不混合，然后加入150 μ L经过预热的ImM FAPGG(溶剂为50mM Tris-HCl缓冲液，pH 7. 5， 含0. 3M NaCl)，使其开始反应。同时，迅速将微孔板放入酶标仪中并加热到37°C，每Imin 纪录一次在;MOnm下的吸光值，共记录20min。空白对照用10 μ L缓冲液(50mM Tris-HCl, PH7.5，含0.3MNaCl)代替蛋白酶解液。以吸光值对时间做出曲线，计算出斜率(通常取 10-20min的斜率来计算)。ACE抑制活性(％ ) = (1- Δ A抑制剂/ Δ A空白)X 100Δ Amm 样品的吸光值对时间曲线的斜率，Δ Ase 空白的吸光值对时间曲线的斜率。IC50值定义为抑制50%的ACE活力的ACE抑制剂的浓度。上述反应试剂和实验操作，如未作特别说明的，均为本领域常规反应试剂及实验操作。本发明的优点及有益效果在于本发明泥鳅蛋白降血压肽具有较高的ACE抑制活性，降血压效果好。本发明所得的短肽产品干燥处理后为白色粉末，易溶于水，可用于制备降压药物。同时，本发明将生物酶工程技术应用于泥鳅的深层次开发。具体表现在1.泥鳅属淡水产低值鱼类，食品安全性高，药用价值好。泥鳅繁殖力强，价格低廉， 来源稳定，易于实现产业化。2.集酶工程和肽的纯化鉴定技术于一体，对泥鳅蛋白进行了深入的开发利用，发现了新的氨基酸序列组成的ACE抑制肽Leu-Glu-Tyr。
3.本发明的短肽IC5tl值为0. 10;3mg/mL，具有较高的ACE抑制活性，在消化道内很难被进一步酶解，可被直接吸收利用，推测在体内也会发挥较好的降压活性，为降压药物的开发奠定基础。
四
图1是经过2500Da的膜超滤的泥鳅蛋白酶解液经过kphadex G_15柱分离的色谱图。图2是kphadex G_15柱分离的A组分样品在反相高效液相C18柱上分离得到的色谱图。图3是反相高效液相C18柱上分离得到的色谱峰中的高活性组分All的纯度鉴定。图4、图5分别是高活性组分All的一级质谱图和二级质谱图。证明All样品的分子量为423Da，氨基酸序列Leu-Glu-Tyr。
五具体实施例方式实施例1.从泥鳅蛋白酶解物中分离纯化得到高活力的ACE抑制肽Leu-Glu-Tyr。(1)酶解泥鳅蛋白制备酶解液将泥鳅肉绞成肉糜，加水打浆，然后加入3%。(w/w)菠萝蛋白酶(活力3X105U/g)， 调节PH值到5. 5，温度55°C，搅拌酶解6小时，灭酶，转速3000rpm离心20min，上清液即酶解液。(2)从酶解液中分离纯化降血压肽将酶解液用2 % (w/v)活性碳脱色20min，然后过2500Da的超滤膜超滤，将超滤小于 2500Da 的超滤液过 S印hadex G-15 柱(1. 6 X 100cm，Amersham Pharmacia Biotech, PiSCataWay，NJ，USA)，流速1. OmL/min，分离得到5个峰，自动部分收集仪收集洗脱液，测定 ACE抑制活性，得到A号峰具有较高的ACE抑制活性(见图1)，将A组分反复收集，进一步用反相高效液相色谱柱(9. 4 X 250mm，AKTA，Agi lent Technologies Co. ,Ltd. ,USA)分离， 得到12个色谱峰(见图幻，其中5号峰具有较高的ACE抑制活性，将5号峰多次收集，冷冻干燥(EYELAFDU-1200，Tokyo Rikakikai Co.，Ltd.，Japan)，再次上反相高效液相色谱柱， 鉴定纯度(见图3)。(3)降血压肽的序列测定将步骤(3)分离纯化得到的具有高活力的ACE抑制肽，用6N的HCl在110°C全水解M小时，用氨基酸自动测定仪测定氨基酸组成为Leu、Glu和Tyr。同时，通过质谱仪 (TSQQuantum-LC/MS/MS，Finnigan，USA)，分析肽的分子量和肽段的分布，如图4、图5所示， 分析出该肽的氨基酸序列为Leu-Glu-Tyr，IC5tl值为0. 10;3mg/mL，泥鳅蛋白酶解液中分离纯化的降血压短肽具有较高的ACE抑制活性。
权利要求
1.一种新型泥鳅蛋白降压肽Leu-Glu-Tyr。
2.如权利要求1所述的泥鳅蛋白降压肽，其特征在于，所述的泥鳅蛋白降压肽具有较高的血管紧张索转换酶(ACE)抑制活性，IC5tl值为0. 10;3mg/mL。所述的泥鳅蛋白降压肽为白色粉末，易溶于水。
3.—种权利要求1所述的泥鳅蛋白降压肽的制备方法酶解泥鳅蛋白制备酶解液、酶解液中降血压肽的分离纯化和序列测定。具体步骤如下(1)酶解泥鳅蛋白制备酶解液将泥鳅肉绞成肉糜，加水打浆，然后加入3% 0(w/w)菠萝蛋白酶(活力3X105U/g)，调节pH值到5. 5-6. 0，温度55-60°C，搅拌酶解5小时，灭酶，转速3000rpm离心20min，取上清液，即酶解液。(2)从酶解液中分离纯化降血压肽酶解液经2%活性碳脱色20min，然后过2500Da的超滤膜超滤，将超滤小于2500Da的超滤液过kphadex G-15柱，流速1. OmL/min，用蛋白质核酸检测仪，在^Onm处进行检测， 自动部分收集仪收集洗脱液，冻干秤重后，测定ACE抑制活性，将抑制活性高的组分多次收集，然后进一步用反相高效液相色谱分离；半制备柱ZORBAX SB-C 18，流速0.8mL/min，流动相=A 水(含0. TFA, ν/ν) ；B 乙腈(含0. TFA, ν/ν)。紫外洗脱液在波长280nm 下进行检测，同一峰下的组分收集混合，冷冻干燥，测定ACE抑制活性，得到高活性的ACE抑制肽。(3)降血压肽的序列测定将分离纯化得到的具有高活力的ACE抑制肽，用6N的HCl在110°C全水解M小时，用氨基酸自动测定仪测定氨基酸组成。同时，通过质谱仪分析肽的分子量和肽段的分布，进行肽的氨基酸序列分析。
4.如权利要求3所述的泥鳅蛋白降压肽的制备方法，其特征在于，所述步骤( 中测定肽的ACE抑制活性方法是以N-[3-(2-呋哺)丙烯醇酰]-2-苯丙氨酰甘氨酰甘氨酸(FAPGG) 为AngI模拟物的分光光度法。
全文摘要
本发明提供了一种新型泥鳅蛋白降压肽及其制备方法，属于生物技术领域。从泥鳅的蛋白酶解产物中分离纯化出新的降血压短肽，具有较高的血管紧张索转换酶(ACE)抑制活性。制备步骤包括酶解泥鳅蛋白制备酶解液、从酶解液中分离纯化降血压肽和降血压肽序列的测定。本发明集现代酶工程技术与肽的纯化鉴定技术于一体，对泥鳅蛋白进行了深入的开发利用，发现了ACE抑制活性较高的新序列短肽Leu-Glu-Tyr，具有较高的ACE抑制活性，IC50值为0.103mg/mL。
文档编号C12P21/06GK102190706SQ201110085378
公开日2011年9月21日 申请日期2011年4月7日 优先权日2011年4月7日
发明者周剑忠, 张丽霞, 曾晓雄, 李莹, 王英, 马艳弘, 黄开红 申请人:江苏省农业科学院