专利名称：一组应用于检测家蚕质型多角体病毒的引物及检测方法
技术领域：
本发明属于分子诊断和鉴定技术领域，具体涉及一组应用于检测家蚕质型多角体病毒的引物及快速检测家蚕质型多角体病毒的方法。
背景技术：
家蚕质型多角体病又称中肠型脓病，病原为桑蚕质型多角体病毒力# mori cytoplasmic polyhedrosis virus,简称BmCPV)，是呼肠孤病毒科质多角体病毒属的模式种。华东 蚕区在夏、秋蚕期多发生本病，华南蚕区则多发生在夏秋蚕期高温季节，每年的第 3 6造，据我们调查中肠型脓病(又简称BmCPV病)占广东第三造蚕总发病数的30 50%， 由于该病常与浓核病DNV病并发，在广东称之为“白口仔”病。病蚕主要由家蚕食下污染 BmCPV的桑叶而侵入中肠后发病所致。致病后的病蚕发育缓慢，体躯瘦小，呆滞，体色略带乳白，常排出带乳白色的软粪，而后陆续死亡。从感染到发病约6 10日。中肠型脓病在气温相对较低的1、2、8造发病较少；在高温各蚕造发病较多。在1986-1987年广东省西江沿岸的德庆县、粤北丘陵山地的翁源县等地的蚕病普查工作发现，德庆县王屋村第四造CPV 发病率8. 12%，有的村甚至高达11. 91% ；即以3 7造，日平均气温为28 31°C，有时达到 34°C时多发生。目前根据其多角体的形状和在细胞内形成的部位分为9个株系，其中BmCPV-I株的dsRNA基因全序列已被测定，并且报道了各基因序列的分析及蛋白结构的预测等，但是对其基因快速检测BmCPV等方面的研究报道还较少(吕鸿声，昆虫病毒分子生物学，北京， 中国农业科技出版社，1998. 411 442)，技术上尚属空白，亟需解决方案。
发明内容
本发明的目的是克服现有家蚕质型多角体病毒BmCPV检测技术的不足，提供一组应用于检测家蚕质型多角体病毒的引物。本发明的另一个目的是，基于所述引物，提供一种快速检测家蚕质型多角体病毒的方法。依据本发明方法可有效地检测中肠型脓病病毒，为生产上早期检测和预知检查家蚕中肠型脓病提供了重要的技术基础。本发明的目的通过以下技术方案予以实现
本发明基于(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/nuccore/AF433660. 1) NCBI 网站上报道的BmCPV dsRNA基因组第5片段的核苷酸序列资料(AF 433660，gi 1666064)，设计了一对特异的引物，应用RT-PCR技术实现对家蚕质型多角体病毒的检测。所述引物BmCPVf和BmCPVr，上游引物18bp，位于其5’端从2188bp到2205bp，下游引物18bp，位于从2400bp到2417bp之间的序列，两引物的核苷酸序列如SEQ ID N0:1和 SEQ ID NO: 2所示，分别为
BmCPVf 5' CAGAGCCATAATGAAACG 3'； BmCPVr 5' GTTGCTCCTGTTTTGTGG 3，；扩增的目的片段为230 bp。同时，本发明提供的家蚕质型多角体病毒的快速检测方法包括以下步骤
(1)抽提家蚕质型多角体病毒基因组dsRNA;
(2)应用所述引物对提取的家蚕质型多角体病毒BmCPV的基因组dsRNA进行PCR扩增；
(3)取5μ L步骤(2) PCR扩增产物用1. 2 %的琼脂糖凝胶电泳检测，用核酸染料 Goldview进行染色检测。步骤(2)所述PCR反应采用 25 μ L体系2· 5 μ L IOXPCR Buffer, 1 μ L dNTPs, 正反向引物浓度为10 μΜ，各加1 yL，l yL DNA模板，18 yLddH20，0.5 yL Γ即酶(2.5 U/μ L)0 引物扩增的 PCR 循环为94°C 5 min ； 94°C 45 s，50°C 45 s ；72°C 1 min，30 循环；72°C 10 min，4°C保存。本发明的有益效果是
本发明提供了一对特异的引物BmCPVf/ BmCPVr，采用所述特异性引物可以有效地扩增检测出家蚕中肠型脓病病毒，本发明方法特异性强，检测快速准确，适于小量样本操作，操作简单，为生产上早期检测和预知检查家蚕中肠型脓病提供了重要的技术基础。
图1家蚕质型多角体病毒基因组dsRNA的RT-PCR扩增结果。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例进一步说明本发明。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。实施例1
(1)家蚕质型多角体病毒的人工繁殖与纯化
生物材料家蚕质型多角体病毒液由华南农业大学蚕桑生物技术实验室经人工桑叶继代繁殖(仅为说明本发明方法使用，也可采用其他实验室相关实验使用的所述家蚕质型多角体病毒)；琼脂糖(Spanish)等购自广州百康生物技术有限公司；DL 2000分子量标准核酸为北京天根生化科技有限公司产品；Loading Buffer,^ DNA Polymerase,dNTPs,DEPC 购自北京鼎国生物技术有限公司；氯仿、异丙醇、无水乙醇由天津大茂化学试剂厂生产； TaKaRa PrimeScript RT-PCR Kit反转录试剂盒购自瑞真公司；PCR仪为美国生产的PE Applied Biosystem 9700 ；凝胶成像系统为英国生产的UVP。接种方法取浓度为IO6个/mL的家蚕质型多角体悬浮液于100 mL小烧杯中，桑叶切成2cmX 2cm的小块，用镊子夹桑叶于病毒多角体悬浮液中浸泡(正反两面浸湿)，在小烧杯杯壁上浙掉多余的病原液，然后叶背朝上平铺于四龄眠起的家蚕上，添毒后6小时以正常桑叶按常规方法给桑，每天注意观察蚕的发病情况。收集方法从蚕座中挑取病蚕，用剪刀剪开其背部，收集乳白色的中肠于灭菌的三角瓶中，密封后4°C冰箱保存，待纯化。纯化方法将收集的乳白色中肠加灭菌水在研钵中研磨后，分装于13 mL的离心管中，经平衡后2500 3000 rpm离心20min，弃上清，沉淀加水至13 mL，混勻，平衡后重复离心洗涤2 3次。弃上清，可见沉淀分为三层，上层淡黄色，中间为乳白色，底部为黑色， 加2 3 mL灭菌水，先用移液枪轻轻刮掉上层淡黄色沉淀，吸出弃掉，再加2 3 mL灭菌水，轻轻刮勻中间乳白色沉淀，小心收集于灭菌的IOmL离心管中，4°C冰箱保存。(2)
(A)家蚕质型多角体病毒基因组dsRNA的抽提
步骤(1)所述感染家蚕质型多角体病毒BmCPV的基因组dsRNA的提取方法参照常规， 具体是在EP管中加入1 ml Trizol (总RNA抽提试剂)，再加入200 μ 家蚕质型多角体悬浮液，枪头吹吸混勻1 min，静置5 min;加入200 μ 氯仿，剧烈振摇15 30s，静置3 min ；在 4°C预冷的离心机中12000 rpm离心5 min，从离心机取出时避免晃动，破坏水油界面；小心吸取上层水相转入一新的EP管中，为避免吸到中间界面，可适量少吸取一些水相；加入和水相等体积的异丙醇(500 μ 左右)，上下颠倒10次，静置10 min ；4°C，12000 rmp离心10 min ；小心倒去上清，用枪头吸去管底残留的液体；加入-20°C预冷的75%乙醇，轻轻转动EP 管数次，使乙醇浸润沉淀和管壁；4°C，7500 rpm离心5 min ；弃上清，用枪头吸去管底残留的乙醇，超净台中敞盖干燥5 min左右至乙醇挥发完全；加入适量DEPC水20 μ 溶解RNA 沉淀；取5 μ 电泳检查，其余分装保存于-70°C，或直接做反转录。(B)正常家蚕基因组RNA的抽提
将液氮冻存的家蚕放于液氮预冷的研钵中研磨成粉状，然后分装于1. 5 mL的离心管中。抽提正常家蚕基因组RNA的方法同上述抽提BmCPV基因组RNA。(3) RT-PCR 扩增
依据NCBI网站上报道的BmCPV dsRNA基因组第5片段的核苷酸序列资料(AF 433660， gi 1666064) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AF433660. 1)，设计合适的 RT— PCR扩增引物BmCPVf/ BmCPVr，上游引物18bp，位于其5’端从2188bp到2205bp，下游引物 18bp，位于从2400bp到2417bp之间的序列，两引物的核苷酸序列分别为 BmCPVf 5' CAGAGCCATAATGAAACG 3'；
BmCPVr 5，GTTGCTCCTGTTTTGTGG 3，；扩增的目的片段为 230 bp。上述引物由上海英俊生物技术有限公司合成。所有基因组RNA模板的反转录反应使用TaKaRa PrimeScript TM RT-PCR Kit反转录试剂盒，然后对反转录产物用上述引物进行PCR扩增，PCR反应采用25 yL体系2.5 μ L 10XPCR Buffer, 1 yLdNTPs，正反向引物浓度为 10 μΜ，各加 1 yL，l yL DNA 模板，18 yLddH20，0.5 yLhi 酶(2.5 U/yL)。引物扩增的 PCR 循环为94°C 5 min ； 94 °C 45 s，50°C 45 s ；72°C 1 min，30 循环；72°C 10 min，4°C保存。取5 μ L PCR产物用1. 2 %的琼脂糖凝胶电泳检测，用核酸染料Goldview进行染色检测。实验结果见附图1所示，应用本发明方法对家蚕质型多角体病毒基因组dsRNA的 RT-PCR检测结果，在250bp的下方有一条清晰的带，与预期的结果一致。泳道M. DL2000 DNA分子量标准；1. BmCPV基因组dsRNA的RT-PCR产物；2.健康家蚕基因组RNA的 RT-PCR 产物；3. ddH20。实验证明，本发明设计的特异性引物，应用于所述病毒的RT-PCR扩增检测，可以有效地扩增检测出中肠型脓病，为生产上早期检测和预知检查家蚕中肠型脓病提供了重要的实验依据。
权利要求
1.一组应用于检测家蚕质型多角体病毒的引物，其特征在于分别具有SEQ ID N0:1和 SEQ ID N0:2所示以下核苷酸序列。
2.权利要求1所述引物的应用，其特征在于制备应用于家蚕质型多角体病毒的检测方面的试剂。
3.一种应用权利要求1所述引物检测家蚕质型多角体病毒的方法，其特征在于包括以下步骤(1)抽提家蚕质型多角体病毒基因组dsRNA;(2)应用所述引物对提取的家蚕质型多角体病毒BmCPV的基因组dsRNA进行PCR扩增；(3)取步骤(2)PCR扩增产物用1. 2 %的琼脂糖凝胶电泳检测或用核酸染料Goldview 进行染色检测。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤(2)所述PCR扩增采用25yL体系 2.5 μ L IOXPCR Buffer, 1 μ L dNTPs，正反向引物浓度为 10 μΜ，各力口 1 μ L，1 μ L DNA 模板，18 μ L ddH20,0. 5 μ L Taq 酶(2.5 U/yL)。
5.引物扩增的PCR 循环条件为94°C 5 min ； 94°C 45 s，50°C 45 s ；72°C 1 min，30 循环；72°C 10 min。
全文摘要
本发明公开了一组应用于检测家蚕质型多角体病毒的引物及检测方法。本发明提供了一对特异的引物BmCPVf和BmCPVr，设计RT-PCR扩增程序，实现对家蚕质型多角体病毒的准确、快捷的检测。本发明方法特异性强，检测快速准确，适于小量样本操作，操作简单，使用本发明方法能够满足对家蚕质型多角体病毒BmCPV进行分子诊断的需要，为生产上早期检测和预知检查家蚕中肠型脓病提供了技术基础。
文档编号C12Q1/68GK102154522SQ20111008593
公开日2011年8月17日 申请日期2011年4月7日 优先权日2011年4月7日
发明者刘吉平, 王永宾 申请人:华南农业大学