专利名称：一种与植物育性相关的蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种与植物育性相关的蛋白质及其编码基因与应用。
背景技术：
植物育性是与作物产量直接相关的因子之一。育性决定遗传基础的研究，对粮食安全具有重要意义。转基因水稻植株的成功和水稻基因组测序工作的完成为研究发现新的水稻育性相关基因提供了有利条件。通过RNAi等分子生物学手段，对水稻中一些参与育性决定的基因进行功能研究，对提高水稻产量具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种与植物育性相关的蛋白质及其编码基因与应用。本发明所提供的与植物育性相关的蛋白质，来源于水稻，名称为0sY14，是如下 (a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物育性相关的由序列1衍生的蛋白质。序列表中的序列1由135个氨基酸残基组成。编码权利要求1所述蛋白质的基因也属于本发明的保护范围。所述基因具体可为如下1)或2)或3)的DNA分子1)序列表中序列2自5’端第1至408位核苷酸所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码植物育性相关蛋白的DNA分子；3)与1)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码植物育性相关蛋白的DNA 分子。所述严格条件可为在0. IXSSPE(或0. 1XSSC)、0. 1% SDS的溶液中，65°C条件下杂交并洗膜。序列表中的序列2由408个核苷酸组成。含有上述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒，也属于本发明的保护范围。可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA 片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导 (Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV) 35S启动子、 玉米的泛素启动子⑴biquitin)，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，
3使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子， 这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的， 可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。本发明所提供的应用是利用上述蛋白质的编码基因培育转基因植物。本发明所提供的培育转基因植物的方法，是降低目的植物中所述蛋白质的编码基因的表达，得到育性低于所述目的植物的转基因植物。所述育性降低具体可体现为结实率降低。所述降低目的植物中所述蛋白质的编码基因的表达是通过将如下式I所示的DNA 片段导入目的植物中实现的SEQ 正向-X-SEQ 反向(I)所述SEQ丨自是序列表中序列2中包括第87-408位核苷酸的任何一段；所述SEQfi^1的序列与所述SEQmW序列反向互补；所述X是所述SEQ1^1与所述SEQfi^1之间的间隔序列，在序列上，所述X与所述SEQ
^向及所述SEQfi^1均不互补。所述SEQ1^1的核苷酸序列具体可为序列2中第87-408位核苷酸。所述式I所示的DNA片段具体可为用BamHI和&icl从重组载体pTCK303_0sY14i 中切下的小片段。其核苷酸序列可为序列表中的序列3。所述降低目的植物中所述蛋白质的编码基因的表达量可通过将如下重组表达载体pTCK303-0sY14i导入目的植物中实现的将序列2中第87-408所示DNA沿着从SpeI至 SacI的方向插在载体PTCK303的SpeI和McI位点间，得到的重组载体记作中间重组载体； 将序列2中第87-408位核苷酸的反向互补序列所示的DNA沿着从KpnI至BamHI的方向插在所述中间重组载体的KpnI和BamHI位点间，得到的重组载体pTCK303_0sY14i。所述植物可为单子叶植物或双子叶植物，所述单子叶植物具体可为水稻。实验证明，降低本发明的0sY14的表达量，可以降低植物的育性，说明0sY14是与植物育性相关的蛋白质。本发明所得到的育性降低的转基因植物，可作为筛选可提高植物育性基因的模型，理解育性决定的分子机理。
图1为0sY14的PCR电泳图。左侧泳道为Marker DL2000，右侧泳道为0sY14基因的PCR产物图 2 为 OsYH-RNAi 的 PCR 电泳图。左侧泳道为Marker DL2000，右侧泳道为0sY14_RNAi的PCR产物
图3为pTCK303_0sY14i相关片段的结构示意图。图4为野生型与转基因植株结实率的比较。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例l、0sY14的制备用如下引物从水稻中扩增0sY14的编码基因0sY14F(ATGGCTGCGGTGACCAACG)和 OsY 14R(CTCAGTATCTTCTCCTCGGTG)。取水稻叶片提取总RNA，反转录为cDNA并以其为模板进行扩增，得到长度约为400bp的DNA片段(图1)。扩增产物连接到pGEM-T Easy载体上， 得到重组载体pGEM-T-0sY14。经克隆测序，获得408bp的cDNA片段(其核苷酸序列如序列2)，它含有完整的开放阅读框，共编码含有136个氨基酸的蛋白质(其氨基酸序列如序列 1)，将其命名为0sY14。实施例2、培育育性降低的转基因水稻1、OsYH-RNAi 载体构建由于基因组扫描，发现0sY14为单拷贝基因，因此根据已获得的0sY14的cDNA片段设计特异引物，构建RNAi载体以达到特异性敲除0sY14的转录表达。首先用如下引物从 pGEM-T-0sY14 中 PCR 扩增 0sY14_RNAi :0sY14RNAiF(TAGGTACCACTAGTTGAAGGATGGATTGTGCTAG)和 0sY14RNAiR(ATGGATCCGAGCTCAGTATCTTCTCCTCGGTG)。PCR 扩增得到 322bp 的片段(图 2)。 回收该长度为322bp的片段，然后通过两步酶切和链接，即一半回收产物经限制性内切酶 SpeI和SacI酶切后，连到用限制性内切酶SpeI和SacI酶切回收的pTCK303载体(Zhen Wang,Changbin Chen,Yunyuan Xu,Rongxi Jiang,Ye Han,Zhihong Xu,Kang Chong (2004)A practical vector for efficient knockdownof gene expression in rice (Oryza sativa L.). Plant Molecular BiologyReporter 22 :409-417 ；公众可从中国科学院植物研究所获得)上，转化大肠杆菌DH5 α，克隆、测序并提取质粒，获得中间重组载体；再用外酶KpnI和 BamHI分别对另一半回收产物和中间重组载体进行双酶切，分别纯化后进行连接反应，并转化至大肠杆菌DH5 α克隆测序，得到pTCK303-0sY14i (图3)。pTCK303_0sY14i含有位于 Rice Intron 一侧的序列2中第87-408位核苷酸所示的OsYH-RNAi及位于Ricehtron另一侧的OsYH-RNAi的反向互补片段。pTCK303-0sY14i含有序列3所示的DNA片段。将pTCK303_0sY14i通过根癌农杆菌EHA105的介导转化水稻品种中花10号。具体的方法如下取水稻品种中花10号(以下简称野生型水稻，以WT表示)种子，70%乙醇水溶液消毒1分钟，无菌水冲洗2-3遍；再用0. 的升汞溶液振荡消毒10分钟以上，无菌水冲洗4-5遍，然后在无菌条件下分离出幼胚，接在NB培养基(N6盐分和维生素，500mg/ L谷氨酰胺，500mg/L脯氨酸，300mg/L水解酪蛋白，30g/L蔗糖，2mg/L2，4-D，7g/L琼脂， PH 5.8)上，于25°C暗培养2周，得到水稻WT幼胚的愈伤组织。将愈伤组织切成小块，在 ΝΒα5(ΝΒ培养基，0.5mg/L 2，4_D)培养基上培养2_3周。农杆菌经划线活化后，挑取单菌落，摇至对数期，再按1 100的比例摇菌至0D600 = 0. 5，6000rpm离心10分钟，收集菌体重悬于AAM-AS (AAM盐分和氨基酸，500mg/L水解酪蛋白，0. 5mg/L 2,4-D, 100uM/L乙酰丁香酮，pH 5. 2)培养基中，将培养好的成熟胚愈伤组织剪成小块收集到一个培养皿中，倒于农杆菌的AAM-AS中侵染20分钟，倒出菌液，用滤纸吸干，然后倒入NB2C(NB培养基，10g/L葡萄糖，lOOuM/L乙酰丁香酮，pH 5. 2)中，25°共培养3天。共培养后的愈伤组织用头孢霉素300mg/L的无菌水中冲洗3-4遍，滤纸吸干，转入筛选培养基I (ΝΒα 5培养基，25mg/L潮霉素，600mg/L头孢霉素)上，25°共培养2周。后转入筛选培养基II (ΝΒα5培养基，50mg/L潮霉素，300mg/L头孢霉素)上，继续筛选2代，2周/代。将筛选得到的抗性愈伤组织放入带有无菌滤纸的培养皿中干燥1天，接种到分化培养基RE1 (MS培养基，lmg/L 6BA, 0. 5mg/L激动素，0. 2mg/L玉米素，0. 25mg/LNAA，50mg/L潮霉素)上暗培养1周，再转到光下培养1周。 然后转到分化培养基RE2 (MS培养基，lmg/L 6BA，0. 5mg/L激动素，0. 2mg/L玉米素，0. 5mg/ LNAA，50mg/L潮霉素)上光下培养2周。待小苗张到2cm左右高时将小苗转移入生根培养基 (1/2MS培养基，0. 2mg/LNAA)。待小苗长至IOcm左右时打开容器封口膜，炼苗2_3天，将阳性小苗移至人工气候室栽培，共得到了 7株阳性TO代转基因水稻，分别命名为Ha、3-lc、 4-2a、5-la、6-lb、7-8b和8_la。同时设转入pTCK303的稻品种中花10号作为对照。根据载体上带有的潮霉素序列设计引物对所有组培苗进行了基因组DNA的 PCR检测，结果显示它们全部为阳性的转基因植株。进一步通过Real-Time RT-PCR分析(所用引物对的序列为 YHRNAiExF :5，-GAAGGATGGATTGTGCTAGTC-3，；YHRNAiExR 5’ -GCATTCTAAAGCACCATCATCAC-3’)，精确地定量了 0sY14在这些转基因株系中的表达情况，结果表明在不同的RNAi株系中0sY14基因的表达量下降的幅度不同，在60% -90% 之间变动(表1)。转基因植物与其受体水稻在株型和营养生长等方面没有明显的差异， 但是在生殖生长发育中却有不同，主要表现为转基因植株的结实率普遍下降，其幅度为 20% -70% (图4)，具体结实率结果如表2。其中，结实率按照如下方法测定选取每一转基因植株上三个小穗，分别统计每一小穗上的饱满和干瘪籽粒数目并计算饱满籽粒的比率， 结实率=饱满籽粒数/总籽粒数，每株三个小穗结实率的平均数代表该株结实率，并以转入pTCK303的稻品种中花10号结实率作为对照。表1转基因水稻实时定量表达检测
权利要求
1.一种蛋白质，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物育性相关的由序列1衍生的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白质的基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于所述基因为如下1)或2)或3)的DNA分子1)序列表中序列2自5’端第1至408位核苷酸所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码植物育性相关蛋白的DNA分子；3)与1)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码植物育性相关蛋白的DNA分子；含有所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒。
4.一种培育转基因植物的方法，是降低目的植物中权利要求1所述蛋白质的编码基因的表达，得到育性低于所述目的植物的转基因植物。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述育性降低体现为结实率降低。
6.如权利要求4或5所述的方法，其特征在于所述降低目的植物中权利要求1所述蛋白质的编码基因的表达是通过将如下式I所示的DNA片段导入目的植物中实现的SEQ正向反向(I)所述SEQI 是序列表中序列2中包括第87-408位核苷酸段；所述SEQ的序列与所述SEQmW序列反向互补；所述X是所述SEQ1^1与所述SEQfi^1之间的间隔序列，在序列上，所述X与所述SEQ1向及所述SEQfi^1均不互补。
7.如权利要求4或5或6所述的方法，其特征在于所述SEQ1^1的核苷酸序列是序列 2中第87-408位核苷酸。
8.如权利要求4-7中任一所述的方法，其特征在于所述式I所示的DNA片段的核苷酸序列为序列表中的序列3。
9.如权利要求4-8中任一所述的方法，其特征在于所述降低目的植物中权利要求1 所述蛋白质的编码基因的表达是通过将如下重组表达载体pTCK303-0sY14i导入目的植物中实现的将序列2中第87-408位核苷酸所示DNA沿着从SpeI至McI的方向插在载体PTCK303的SpeI和McI位点间，得到的重组载体记作中间重组载体；将序列2中第 87-408位核苷酸的反向互补序列所示的DNA的沿着从KpnI至BamHI的方向插在所述中间重组载体的KpnI和BamHI位点间，得到的重组载体pTCK303_0sY14i。
10.如权利要求4-9中任一所述的方法，其特征在于所述植物为单子叶植物或双子叶植物，所述单子叶植物具体可为水稻。
全文摘要
本发明公开了一种与植物育性相关的蛋白质及其编码基因与应用。该蛋白质，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物育性相关的由序列1衍生的蛋白质。实验证明，降低本发明的OsY14的表达量，可以降低植物的育性，说明OsY14是与植物育性相关的蛋白质。本发明所得到的育性降低的转基因植物，可作为筛选可提高植物育性基因的模型。
文档编号C12R1/91GK102206261SQ20111008761
公开日2011年10月5日 申请日期2011年4月8日 优先权日2011年4月8日
发明者公丕昌, 贺超英 申请人:中国科学院植物研究所