专利名称：一种土壤和沉积物总dna提取方法及提取试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于土壤微生物基因组DNA分离纯化技术领域，具体涉及一种土壤和沉积物总DNA提取方法及提取试剂盒。
背景技术：
分子指纹图谱技术已经成为微生物生态学、环境生物学、环境工程学等领域普遍应用的微生物生态学技术，然而环境样品中(如土壤、海洋和湖泊沉积物等)总DNA的提取技术作为该技术体系的关键步骤和核心内容，已经受到人们的广泛关注。土壤和沉积物中总DNA提取的特异性、浓度、纯度等直接影响到微生物群落结构的客观真实性，是近年来国外期刊审稿过程中争议较多的内容之一。目前，对于从土壤和沉积物中获取总DNA，仍没有一致认同的较佳方法，而普遍应用的酶裂解法、化学药品提取法等只能针对样品中的敏感菌起作用，而且无法去除样品中的腐殖酸。这些方法均人为的改变了环境中真实的微生物群落结构，且存在以下问题1) DNA提取过程繁杂，时间过长，且需要较多的大型仪器设备，如酶提取法需要长时间的水浴过程；幻一般DNA提取过程往往应用高毒高污染的化学试剂，如DNA纯化过程中应用酚/氯仿等“三致”试剂；幻提取的DNA质量较差，碎片较多，存在腐殖酸、RNA、蛋白质等污染；4) DNA的量太少，尤其是从沉积物中获取DNA，无法满足下游实验的需要。因此，建立一种有效的从土壤和沉积物中提取总DNA的方法已成为当务之急。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速从土壤和沉积物中获得总DNA的方法，并提供成套的试剂盒新产品，应用该试剂盒，研究者可以快速从环境样品中获得需要的DNA，以进行后续的分子生物学研究。本发明首先应用腐殖酸溶解液，最大程度地溶解和去除土壤和沉积物中的腐殖酸，再将剩余腐殖酸进行络合沉淀，然后无选择地释放所有细菌体内的DNA，离心后去除溶液中的络合腐殖酸和蛋白质，而含DNA的上清溶液则通过高盐溶液调节后，以硅胶吸附膜特异吸附得以纯化回收。本发明的土壤和沉积物总DNA提取方法，依次包括如下步骤1)用腐殖酸溶解液去除样品大部分腐殖酸，得到沉淀；2)向上述步骤1)的沉淀样品中加入腐殖酸络合剂，悬浮起沉淀使剩余的腐殖酸充分络合，离心使腐殖酸络合物和细菌样品充分沉淀；3)向上述步骤2)的沉淀中加入细胞裂解液，漩涡振荡释放出细菌总DNA，离心后得到含细菌总DNA的上清液；4)向上述步骤幻的上清液中加入酸碱调节剂，离心得到去除蛋白质和糖类物质的上清溶液；5)向上述步骤4)的上清溶液中加入高盐溶剂后，过硅胶吸附膜吸附DNA;
6)将上述步骤5)吸附的DNA进行清洗后，用洗脱液洗脱得到样品的总DNA。上述的腐殖酸络合剂为钙离子水溶液，优选为氯化钙溶液，为0. 20mol/L, pH 5. 5 7. 5 ；且土壤或沉积物样品的湿重同钙离子的添加比例为1. 5g/mmol/L。上述的酸碱调节剂为0. 5 1. 5mol/L醋酸钾，pH 4. 8 5. 0，具有调节溶液体系至酸性，以进一步沉淀腐殖酸和糖类物质，以及变性蛋白质的作用。上述的步骤3)漩涡振荡释放时间为10 12min。根据上述的提取方法建立的提取试剂盒，包括如下组分1)腐殖酸溶解液和海砂，其中海砂直径为1 2mm，海砂和腐殖酸溶解液的质量体积比为0. 2 0. 3g/mL ；2)腐殖酸络合剂:0. 20mol/L氯化钙溶液，pH 5. 5 7. 53)细胞裂解液50 100mmol/L Tris-HCl，1. 5 3. 5mol/L NaCl，l% 3% CTAB, pH 8· 0 10. 0 ；4)变性剂20% SDS，pH 9. 0 ；5)酸碱调节剂0. 5 1. 5mol/L醋酸钾，pH 4. 8 5. 0 ；6)高盐溶剂:3. 0 6. Omol/L 盐酸胍，pH 5. 0 8. 0 ；7)清洗液70%乙醇；8)洗脱液2 IOmmol/L Tris-HCl, pH 8. 0 9. 0 ；9)基因组DNA吸附柱包含硅胶吸附膜内柱的2mL离心管套装。依据本发明的方法建立的试剂盒可以在70min时间内同时提取多个样品，获得的 DNA样品纯度高，无降解，可直接用于后续分子生物学分析，同时避免了传统DNA提取方法需要酚/氯仿等毒性试剂纯化DNA的步骤，具有广阔的应用前景。
图1 应用本发明试剂盒提取的不同土壤样品DNA电泳结果图。图2 不同土壤样品DNA 16S rRNA基因PCR扩增电泳结果。图3 不同土壤样品DNA 16S rRNA基因V3区PCR扩增电泳结果。图4 不同土壤样品DNA氨氧化菌特异序列PCR扩增电泳结果。其中，M为marker，各片段标注于图右；1，2，3和4分别为农田土、草地土、湿地土、 海洋沉积物，C为阴性对照。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明的方法进行详细描述。本发明从土壤和沉积物中获得总DNA的方法，依次包括如下步骤1)用海砂和腐殖酸溶解液来处理样品，离心得到去除了大部分腐殖酸的沉淀样
ρ
BFI 取0. 3g直径1 2mm海砂于2mL的离心管中，进行高压蒸汽灭菌，加入1. 0 1. 5mL 灭菌的腐殖酸溶解液(100 200mmol/L Tris, 50 IOOmmol/LNei4P2O7, 50 IOOmmol/L Na2EDTA, 1. 0 3. 0% PVP，100 200mmol/L NaCl，0· 05 0. Triton X-100， pH 8.0 10.0)，置于室温备用；
将土壤或沉积物样品0. 3g加入到装有腐殖酸溶解液和海砂的离心管中，中速涡旋振荡1 :3min，完全混勻，使土壤样品中的腐殖酸充分释放出，然后IOOOOXg离心30s， 尽量吸弃上清，得到沉淀样品；2)向上述步骤1)的沉淀样品中加入腐殖酸络合剂，悬浮起沉淀使剩余的腐殖酸充分络合，离心使海砂、腐殖酸络合物和细菌样品充分沉淀向上述步骤1)的沉淀样品加入ImL 0. 20mol/L氯化钙溶液，pH 5. 5 7. 5，然后中速涡旋1 3min，完全混勻，IOOOOXg离心30s，尽量吸弃上清，得到含有DNA的沉淀。钙离子可以与带负电荷的大分子有机物络合，形成不溶性沉淀，腐殖酸、蛋白质和 DNA等在中性条件下均为带负电荷的大分子有机物，但此时细菌细胞尚未破碎，DNA还未释放，所以加入的钙离子仅与腐殖酸络合形成不溶性沉淀。而其它腐殖酸络合试剂，由于不能与腐殖酸形成稳定的络合物沉淀，在后续的细胞裂解中又会使腐殖酸进入样品体系中。本发明需要选用水溶性好的钙盐，优选氯化钙溶液。另外，加入的腐殖酸络合剂中的钙离子浓度也对DNA提取产生重要的影响。钙离子浓度过低，将使样品中腐殖酸络合不全，而过高又将残存过多，影响后续DNA的产量和质量。本研究表明，在步骤1)中，取0.3g 土壤或沉积物的条件下，加入ImL 0.2mol/L氯化钙溶液(即样品湿重和钙离子的比例为1. 5g/mmol/L)就可以将剩余腐殖酸完全络合，而对 DNA产量影响较小。3)向上述步骤2)的沉淀中加入细胞裂解液和变性剂并漩涡振荡释放出细菌总 DNA，离心后得到含细菌总DNA的上清液沉淀中加入720 μ L 细胞裂解液 50 100mmol/L Tris-HCl, 1. 5 3. 5mol/LNaCl, l% 3%CTAB，pH 8.0 10.0;和8(^1^变性剂20%505，？!1 9. 0，最大速度漩涡振荡10 12min，IOOOOXg离心60s，将上清液(< 650 μ L，避免吸取上层气泡)转移到一个新管内；4)向上述步骤幻的上清液中加入酸碱调节剂，离心得到去除蛋白质和糖类物质的上清溶液加入100 μ L酸碱调节剂0. 5 1. 5mol/L醋酸钾，pH 4. 8 6. 0 ；颠倒5次混勻， 4°C静置5min，10000Xg离心60s，上清(< 700 μ L)移至新管；步骤3)中获得的上清液小于650 μ L，加入的酸碱调节剂为100 μ L，即为得到较理想的酸盐调节效果，二者的体积比需大于6. 5。5)向上述步骤4)的上清溶液中加入高盐溶剂后，过硅胶吸附膜吸附DNA 向步骤4)的上清溶液中加入1400 μ L高盐溶剂3. 0 6. Omol/L盐酸胍，pH5. 0 8.0 ；混勻后，分三次(每次取700 μ L)加入同一硅胶吸附膜吸附DNA，10000 Xg离心30s ；向上述步骤4)获得的上清溶液中，加入高浓度的盐溶液与DNA分子竞争有效水分时，DNA分子将被析出而与有机相中的硅胶吸附膜结合。盐酸胍具有盐的特性，同时可以高浓度溶解于水，这是其他盐类无法比拟的，这也是本发明应用高浓度盐酸胍的原因。6)将上述步骤5)吸附的DNA进行清洗后，用洗脱液洗脱得到样品的总DNA 加入700 μ L70%乙醇，IOOOOXg离心60s，去除滤过液后，再离心一次，将吸附柱置于新管，然后用10(^1^洗脱液2 10讓01/1 Tris-HCl,pH 8. 0 9. 0加入到吸附柱中， 于60°C水浴5min，IOOOOXg离心60s，收集滤过液，于_20°C保存。本发明的提取试剂盒包括如下的组分
1)腐殖酸溶解液和海砂，其中海砂直径为1 2mm，海砂和腐殖酸溶解液的质量体积比为0.2 0. 3g/ml ；2)腐殖酸络合剂:0. 20mol/L氯化钙溶液，pH 5. 5 7. 5 ；3)细胞裂解液50 100mmol/L Tris-HCl, 1. 5 3. 5mol/LNaCl，1 % 3% CTAB, pH 8. 0 10. 0 ；4)变性剂20% SDS，pH 9. 0 ；5)酸碱调节剂0. 5 1. 5mol/L醋酸钾，pH 4. 8 5. 0 ；6)高盐溶剂:3. 0 6. Omol/L 盐酸胍，pH 5. O 8. O ；7)清洗液70%乙醇；8)洗脱液2 IOmmol/L Tris-HCl, pH 8. O 9. O ；9)基因组DNA吸附柱包含硅胶吸附膜内柱的2ml离心管套装。应用本试剂盒，仅需要常规非冷冻型的高速离心机、漩涡振荡器、水浴锅及微量移液器等一般微生物学、分子生物学等实验室都具备的简单设备，对于熟练研究者，同时提取 6个样品DNA时间可缩短至70min之内，极大的节省了科研工作者宝贵的时间，同时可获得高质量的DNA样品，对下游的分子生物学操作无抑制，表现出极大的应用潜力。通过对农田土、草地土、湿地土、海洋沉积物中总DNA的提取试验，均得到理想的结果，并且不影响PCR 扩增等后续分子生物学分析。实施例1 腐殖酸络合剂浓度的选择应用本试剂盒，以湿地土、海洋沉积物和农田土为对象，探讨腐殖酸络合剂浓度对提取效率的影响。样品量为0. 3g，其中氯化钙溶液浓度分别为0，0. 1,0. 2,0. 3,0. 4， 0.5mol/L，各加入1ml，按照本发明的方法进行提取，用时约60min。将提取的DNA进行电泳、染色、照相，并应用紫外分光光度计进行定性定量分析。结果表明，氯化钙溶液浓度分别为0和0. lmol/L时(即样品湿重和钙离子的比例彡3g/mmol)，虽然DNA的回收率较高，为 10 15 μ g/g干土，但提取的DNA溶液为黄色，含有大量腐殖酸，表明腐殖酸没有被完全去除，加入的氯化钙相对量过低，这样的DNA样品将对分子生物学实验中的酶具有极大的抑制作用。同样，应用浓度为0. 3mol/L以上(即样品湿重和钙离子的比例彡lg/mmol/L)的氯化钙溶液为腐殖酸络合剂时，虽然DNA溶液透明清澈，但DNA回收率过低，电泳时低于检测限值，紫外检测表明低于lOOng/g干土，这表明过高的氯化钙溶液残留太多，也络合了大量的DNA分子，这样的DNA样品无法满足后续分子生物学需要。而加入ImL 0.2mol/L氯化钙溶液(即样品和钙离子的比例为1. 5g/mmol/L)时，不但提取的DNA浓度高(5 7 μ g/ g)，而且质量能够满足文库构建、变性梯度凝胶电泳(DGGE)等后续分子生物学的要求。实施例2 细菌细胞裂解漩涡振荡时间选择应用本试剂盒，分别以0. 3g湿地土、农田土为对象，对加入细胞裂解液和变性剂后的漩涡振荡时间做了优化。其中腐殖酸络合剂用Iml的0. 2mol/L的氯化钙溶液，pH 7. 5， 细胞裂解时的漩涡振荡时间分别选择5min，lOmin，15min，按照本发明的方法进行提取，用时约70min。DNA电泳、染色、照相，并应用紫外分光光度计进行定性定量分析。结果表明， 振荡5min的环境样品DNA回收率明显偏低，低于1. 0μ g/g干土 ；而高于15min后，DNA回收率并无明显增加，且出现了大量的DNA碎片，这对于需要长片段基因组DNA的分子生物学实验是不允许的，所以振荡时间选取10 12min为宜。
实施例3 从不同土壤样品中提取总DNA应用本试剂盒和确定的提取条件，分别对农田土、草地土、湿地土、海洋沉积物中总DNA进行提取试验，按照本发明的方法进行提取，用时约60min。取10 μ L DNA进行电泳，凝胶以EB染色，凝胶成像系统照相，并应用紫外分光光度计进行定性定量分析，电泳结果如图1所示。根据该图，该试剂盒可从不同土壤和沉积物中获得的总DNA，DNA片段长度在10 201Λ，没有降解，也没有RNA污染。分别对各样品进行紫外吸收检测，表明所获得的 DNA样品在^Onm处形成均一的DNA吸收峰，在^Onm处没有明显的蛋白吸收峰出现，OD260/ OD280 = 1. 8 1. 9，说明获得的DNA比较纯净，没有蛋白和RNA污染，计算得知DNA的回收率为5 12μ g/g干土。为确认应用本试剂盒提取DNA质量能否满足分子生物学需要，以获得的DNA为模板，分别应用细菌16S rRNA基因全长的通用引物8F/1M1R、变性梯度凝胶电泳(DGGE)常用的16S rRNA基因V3区特异引物341F/534R，以及氨氧化细菌特异的16S rRNA基因引物 CT0189f/CT0654r进行PCR扩增。PCR结束后，取5 μ L电泳，结果分别如图2，图3和图4。 图2显示以8F/1M1R为引物获得接近全长的16S RNA基因，约1500bp，浓度大约为IOng/ tL。该产物纯化后可用于16S rRNA基因文库的构建，以解析环境中微生物的种类、组成与比例。图3显示各样品均获得了约200bp目标序列，浓度大约为20ng/yL，可用于DGGE分析，以解析微生物群落的结构及动态。图4显示以TO189f/CT0654r为引物进行PCR后，各样品均得到了长度约500bp目标序列，浓度大约为lOng/yL。可见，应用本试剂盒，可以从土壤、沉积物样品中提取高质量的DNA，能够满足下游分子生物学的需要。
权利要求
1.一种土壤和沉积物总DNA提取方法，依次包括如下步骤1)用腐殖酸溶解液去除待提取样品大部分腐殖酸，得到样品沉淀；2)向上述步骤1)的待提取样品沉淀中加入腐殖酸络合剂，使剩余的腐殖酸充分络合， 离心使腐殖酸络合物和细菌样品沉淀；3)向上述步骤2)沉淀中加入细胞裂解液，漩涡振荡释放出细菌总DNA，离心得到上清溶液；4)向上述步骤幻上清溶液中加入酸碱调节剂，离心获取上清液；5)向上述步骤4)上清液中加入高盐溶剂，过硅胶吸附膜吸附DNA;6)将上述步骤5)吸附的DNA进行清洗，用洗脱液洗脱得到样品的总DNA。
2.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于所述的步骤幻待提取样品沉淀中加入的腐殖酸络合剂为钙离子水溶液。
3.如权利要求2所述的提取方法，其特征在于所述的钙离子水溶液为氯化钙溶液。
4.如权利要求2所述的提取方法，其特征在于所述的待提取样品和添加的钙离子的比例为 1. 5g :lmmol/L0
5.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于所述的步骤3)的漩涡振荡释放时间为 10 lanin。
6.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于所述的步骤4)中的上清溶液和加入的酸碱调节剂的体积比不小于6. 5。
7.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于所述的步骤5)的高盐溶剂为3.0 6. Omol/L 盐酸胍，pH 5. 0 8. 0。
8.一种土壤和沉积物总DNA提取试剂盒，包括如下组分1)高效DNA分离柱包含腐殖酸溶解液和海砂；2)腐殖酸络合剂0.20mol/L氯化钙溶液，pH 5. 5 7. 5 ；3)细胞裂解液50 100mmol/L Tris-HCl, 1. 5 3. 5mol/L NaCl, 3% CTAB，pH 8· 0 10. 0 ；4)变性剂20%SDS，pH 9. 0 ；5)酸碱调节剂0.5 1. 5mol/L醋酸钾，pH 4. 8 6. 0 ；6)高盐溶剂3.0 6. Omol/L盐酸胍，pH 5. 0 8. 0 ；7)清洗液70%乙醇；8)洗脱液2 IOmmol/L Tris-HCl，pH 8. 0 9. 0 ；9)基因组DNA吸附柱包含硅胶吸附膜内柱的2mL离心管套装。
9.如权利要求8所述的DNA提取试剂盒，其特征在于所述的高效DNA分离柱中海砂和腐殖酸溶解液的质量体积比g/mL为0. 2 0. 3。
10.如权利要求8所述的DNA提取试剂盒，其特征在于所述的高效DNA分离柱为2mL可立冻存管。
全文摘要
本发明涉及一种土壤和沉积物总DNA提取方法及提取试剂盒，即首先应用腐殖酸溶解液，最大程度地溶解和去除土壤和沉积物中的腐殖酸，再将剩余腐殖酸进行络合沉淀，然后无选择地裂解释放细菌体内的基因组DNA，离心后去除溶液中的络合腐殖酸和蛋白质，而含DNA的上清溶液则通过酸碱调节试剂和高盐溶液调节后，以硅胶吸附膜特异吸附而使基因组DNA得以纯化回收。本发明的方法可以在较短时间内同时提取多个样品，正常操作时间小于70min，可以获得高纯度、适合下游分析的大量DNA样品。依据本发明方法建立的试剂盒获得的DNA样品纯度高，无降解，可直接用于后续分子生物学分析，同时避免了传统DNA提取方法需要酚/氯仿等毒性试剂纯化DNA的步骤，具有广阔的应用前景。
文档编号C12N15/10GK102206630SQ20111009036
公开日2011年10月5日 申请日期2011年4月12日 优先权日2011年4月12日
发明者刘茹, 李新伟, 王俊彩, 田伟君, 白洁, 赵阳国 申请人:中国海洋大学