专利名称：一种水葫芦的预处理方法
技术领域：
本发明属于微生物发酵工程领域，具体涉及一种预处理水葫芦以利于微生物及其酶的降解和转化水葫芦生产乙醇的方法。
背景技术：
水葫芦，又名凤眼莲，为多年生漂浮性草本植物。其原产于巴西，因其具有很强的适应能力、能起到美化环境、净化水质的作用，曾经一度被全世界范围内引种。但其因繁殖能力强，能迅速的封锁水面，导致水中其他植物、动物物种消失，极大的破坏入侵地生态系统，被世界各国公认为重要的入侵生物物种。就我国而言，至从1901年引入以来，已成为危害严重的外侵植物，目前，水葫芦能见于我国华北、华东、华中和华南的19个省(自治区、直辖市)，我国主要城市湖泊如太湖、滇池也都倍受水葫芦蔓延成灾的困扰。截止目前，并没有有效的环保途径控制和减少水葫芦的蔓延，也考虑到尽可能不产生次生污染物的原则，目前水葫芦的治理主要是以打捞为主。目前，针对打捞出的水葫芦生物量，利用的方式主要有饲料化、肥料化、用于造纸、制作手工艺品和家具、用做食用菌培养的基质等。近年来，随着世界石化能源危机加剧， 对替代能源技术的研发，特别是生物能源技术的研究倍受关注。因水葫芦生长快、生物量大，不存在与人争粮和与粮争地的问题，且能减少水葫芦及其打捞出废弃生物量对湖泊生态和环境的影响，因此，水葫芦的能源化研究可以追溯到20世纪70年代。早期关于水葫芦能源化的研究主要其产甲烷特性及其发酵工艺的研究，如水葫芦新鲜或者简单干燥处理和粉碎的材料，与猪粪等混合后，自然发酵，产生甲烷等可燃性气体。随着对乙醇能源的需求，近年的研究转向利用纤维素酶或者纤维素酶产生菌联合酵母等微生物转化水葫芦木质纤维素成分生产乙醇。但是，由于木质素和半纤维素对纤维素的保护作用以及纤维素本身的结晶结构，导致了其难分解性的化学性质，微生物降解和转化水葫芦等木质纤维素的能力受到极大的限制。对天然木质纤维素原料直接进行纤维素酶水解时，其水解程度非常低。未经预处理的原料，其水解率低于理论值的20%，而经预处理后的水解率可达理论值的90%。因此，水葫芦等木质纤维素原料在进行微生物发酵前必需进行适当的预处理，改变其天然化学结构脱去木质素，增加原料的疏松性以增加纤维素酶或微生物对纤维素的有效接触，以提高纤维素的酶解转化率才能有效地将木质纤维素原料发酵转化为乙醇。目前，木质纤维素预处理方法主要有物理法、化学法、生物法和综合法。就水葫芦预处理而言，目前经常采用的粉碎、干燥等比较简单的预处理，并不能满足能源微生物发酵转化乙醇对木质纤维素原料的要求，也不利于大量废弃水葫芦生物量的变废为宝。
发明内容
本发明是利用低浓度的酸、碱在高温条件下、对经过干燥粉碎处理的水葫芦进行预处理，从而改变水葫芦木质纤维素的天然化学结构、降低木质素和半纤维素对纤维素的保护作用，改善水葫芦木质纤维素难分解的化学性质、增加原料的疏松性以增加纤维素酶或微生物对纤维素的有效接触。本发明该方法处理得到的水葫芦木质纤维素原料可以用于提高纤维素酶或纤维素利用微生物(厌氧细菌、真菌、酵母)发酵转化水葫芦木质纤维素原料为乙醇等。本发明通过以下步骤实现(1)水葫芦材料的收集，打捞新鲜水葫芦，洗净、干燥后，茎部和根部分开粉碎；( 以范式纤维素测定法测定水葫芦中半纤维素、纤维素和木质素含量；(3)在100°C下，用0. 5%、1%、2% &S04(w/V)预处理水葫芦Ih ； (4)在100°C下， 用0. 5%U%>2% NaOH(w/v)预处理水葫芦Ih ； (5)预处理水葫芦发酵相关品质评价，包括不同预处理后水葫芦中半纤维素、纤维素和木质素含量、商业纤维素酶RlO对不同预处理后水葫芦样品的酶解效率等。本发明使用的水葫芦材料采用新鲜打捞的滇池水葫芦，洗净，晾干，80°C烘干，叶片、根部分别粉碎，叶片40目筛组分用于预处理。水葫芦的酸预处理方法将上述过40目筛水葫芦组分，以固液比1 10(v/v)加入装有200mL 0. 5%U%>2% H2SO4(w/v)溶液的三角瓶中，100°C保温lh。待冷却，6层纱布过滤，滤渣水洗至中性，置于60°C烘干。水葫芦的碱预处理方法将上述过40目筛水葫芦组分，以固液比1 10(v/v)加入装有200mL 0. 5% U % >2% NaOH(w/v)溶液的三角瓶中，100°C保温lh。待冷却，6层纱布过滤，滤渣水洗至中性，置于60°C烘干。半纤维素、纤维素和木质素含量测定方法范氏测定纤维素含量法(1)原理植物性饲料经中性洗涤剂煮沸处理，不溶解的残渣为中性洗涤纤维，主要为细胞壁成分，其中包括半纤维素、纤维素、木质素和硅酸盐。植物性饲料经酸性洗涤剂处理，剩余的残渣为酸性洗涤纤维，其中包括纤维素、木质素和硅酸盐。酸性洗涤纤维经 72%硫酸处理后的残渣为木质素和硅酸盐，从酸性洗涤纤维值中减去72%硫酸处理后的残渣为饲料的纤维素含量。将72%硫酸处理后的残渣灰化，在灰化过程中逸出的部分为酸性洗涤木质素(ADL)的含量。(2)试剂中性洗涤剂(30g/L十二烷基硫酸钠)准确称取18. 6g乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA. 2H20,分析纯)和6. 8g硼酸钠(Na2B407 · 10H20,分析纯)放入烧杯中，加入少量蒸馏水，加热溶解后，再加入30g十二烷基硫酸钠(C12H25Na04S，分析纯)和IOml乙二醇乙醚(C4H1002，分析纯)；再称取4. 56g无水磷酸氢二钠(Na2HP04，分析纯)置于另一烧杯中，加入少量蒸馏水微微加热溶解后，倒入前一个烧杯中，在容量瓶中稀释至1000ml，其中PH值约为6. 9 7. 1 (pH值一般勿需调整)；IN硫酸量取约27.87ml浓硫酸(分析纯，比重1. 84，98 ，徐徐加入已装有 500ml蒸馏水的烧杯中，冷却后注入IOOOml容量瓶定容，标定；酸性洗涤剂O0g/L十六烷三甲基溴化铵)称取20g十六烷三甲基溴化铵(CTAB， 分析纯)溶于IOOOmllN硫酸，必要时过滤；(3)操作步骤中性洗涤纤维测定准确称取l.OOOOg样品(通过40目筛)置于直筒烧杯中，加入IOOml中性洗涤剂和数滴十氢化萘及0. 5g无水亚硫酸钠。将烧杯套上冷凝装置于电炉上，在5 IOmin内煮沸，并持续保持微沸60min。煮沸完毕后，取下直筒烧杯，将烧杯中溶液倒入安装在抽滤瓶上的已知重量的玻璃坩埚中进行过滤，将烧杯中的残渣全部移入，并用沸水冲洗玻璃坩埚与残渣，直洗至滤液呈中性为止。用20ml丙酮冲洗二次，抽滤。将玻璃坩埚置于105°C烘箱中烘池后，在干燥器中冷却30min称重，直称至恒重。酸性洗涤纤维测定准确称取l.OOOOg样品(通过40目筛)置于直筒烧杯中，加入IOOml酸性洗涤剂和数滴十氢化萘及0. 5g无水亚硫酸钠。将烧杯套上冷凝装置于电炉上，在5 IOmin内煮沸，并持续保持微沸60min。趁热用已知重量的玻璃坩埚抽滤，并用沸水反复冲洗玻璃坩埚及残渣至滤液呈中性为止。用少量丙酮冲洗残渣至抽下的丙酮液呈无色为止，并抽净丙酮。将玻璃坩埚置于105°C烘箱中烘池后，在干燥器中冷却30min称重， 直称至恒重。酸性洗涤木质素和酸不溶灰分测定将酸性洗涤纤维加入72%酸，在20°C消化池后过滤，并冲洗至中性。消化过程中溶解部分为纤维素，不溶解的残渣为酸性洗涤木质素和酸不溶灰分，将残渣烘干并灼烧灰化后即可得出酸性洗涤木质素和酸不溶灰分的含量。(4)结果计算中性洗涤纤维含量的计算NDF(% ) = (ffl-W2)/WX100注W1_玻璃坩埚和NDF重(g)W2_玻璃坩埚重(g)W_试样重(g)酸性洗涤纤维含量的计算ADF(% ) = (G1-G2)/GX100注G1_玻璃坩埚和ADF重(g)G2_玻璃坩埚重(g)W_试样重(g)半纤维素含量的计算半纤维素(％ ) = NDF(% )-ADF(% )纤维素含量的计算纤维素=ADF(% )_经72%酸处理后的残渣(％ )酸性洗涤木质素(ADL)含量的计算ADL(% )=残渣(％ )_灰分(硅酸盐，％ )预处理水葫芦的纤维素酶水解方法每个反应体系中加入0. 05M柠檬酸缓冲液 (0. lmol/L柠檬酸A液准确称取C6H8O7 -H2O 21. 014g于500ml烧杯中，用少量蒸馏水溶解后移入IOOOml容量瓶定容。0. lmol/L柠檬酸钠B液准确称取Na3C6H5O7 · 2H20 29. 412g 于500ml烧杯中，用少量蒸馏水溶解后移入IOOOml容量瓶定容。取A液205ml，B液充分混勻于IOOOml容量瓶定容即为0. 05M pH4. 8的柠檬酸缓冲液)4. 8mL，0. 2mL纤维素酶(Yakult. Co 日本，Cellulase R-10，10mg/mL)，0. Ig 不同预处理的水葫芦样品。50°C, 130rpm,摇床温浴48h。反应结束，4°C，12000rpm, IOmin,取上清，用于总还原糖的测定。酶解液总还原糖测定方法取水解上清液0. 2ml加入20ml刻度试管中，同时加入 1. 8ml蒸馏水和aiil DNS溶液，充分摇勻后沸水浴5min，冷却后用蒸馏水定容至20ml，充分混勻。于MOnm处测定吸光值。通过标准曲线计算出相应的还原糖浓度(mg/ml)总还原糖含量(mg)=(还原糖浓度测定值X5)/0.2。目前，水葫芦乙醇发酵前预处理多采用常温长时间(Mh)处理或者自发酵条件。 本发明采用低酸、碱(0. S^U^dKw/v)浓度、高温(100°c，12rc )、短时间(Ih)条件对水葫芦样品进行预处理，具有产物酶解效率高、还原糖得率高和节约时间等优势。
图1葡萄糖标准曲线。图2预处理前水葫芦中纤维素，半纤维素、木质素含量测定。图3不同预处理后水葫芦中纤维素、半纤维素和木质素含量。
图4不同预处理条件对水葫芦中纤维素、半纤维素和木质素的相对去除率。图5纤维素酶RlO对不同预处理水葫芦材料的水解转化率。图6纤维素酶RlO处理对不同预处理水葫芦材料的纤维素水解率。图7不同预处理水葫芦材料经纤维素酶RlO处理后还原糖测定。
具体实施例方式(1)水葫芦材料的收集，打捞新鲜水葫芦，洗净、干燥后，茎部和根部分开粉碎； (2)以范式纤维素测定法测定水葫芦中半纤维素、纤维素和木质素含量；C3)在100°C下，用 0. 5%U%>2% H2SO4(w/v)预处理水葫芦 Ih ；⑷在 100°C下，用 0. 5%、1%、2% NaOH(w/v) 预处理水葫芦Ih ； 预处理水葫芦发酵相关品质评价，包括不同预处理后水葫芦中半纤维素、纤维素和木质素含量、商业纤维素酶RlO对不同预处理后水葫芦样品的酶解效率等。 本发明使用的水葫芦材料采用新鲜打捞的滇池水葫芦，洗净，晾干，80°C烘干，叶片、根部分别粉碎，叶片40目筛组分用于预处理。水葫芦的酸预处理方法将上述过40目筛水葫芦组分，以固液比1 10(v/v)加入装有200mL 0. 5%U%>2% H2SO4(w/v)溶液的三角瓶中，100°C保温lh。待冷却，6层纱布过滤，滤渣水洗至中性，置于60°C烘干。水葫芦的碱预处理方法将上述过40目筛水葫芦组分，以固液比1 10(v/v)加入装有200mL 0. 5% U % >2% NaOH(w/v)溶液的三角瓶中，100°C保温lh。待冷却，6层纱布过滤，滤渣水洗至中性，置于60°C烘干。实施例1 制作葡萄糖标准曲线葡萄糖是纤维素水解的主要产物。因此，通过测定不同预处理后水葫芦样品经纤维素酶解后，酶解液中葡萄糖的含量，可以比较不同预处理条件的优劣。样品中葡萄糖产量的测定，首先需要制备葡萄糖标准曲线，其基本过程如下(1) lmg/mL葡萄糖标准液准确称取80°C烘至恒重的分析纯葡萄糖lOOmg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到IOOmL容量瓶中，用蒸馏水定容至IOOmL,混勻，4°C冰箱中保存备用。(2) 3，5- 二硝基水杨酸(DNS)试剂将6. 3g DNS和2M NaOH溶液，加到500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至IOOOmL,贮于棕色瓶中备用。(3)制作葡萄糖标准曲线取11支20mL具塞刻度试管编号，按表1分别加入浓度为lmg/mL的葡萄糖标准液、 蒸馏水和3，5-二硝基水杨酸(DNS)试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。将各管摇勻，在沸水浴中准确加热5min，取出，冷却至室温，用蒸馏水定容至20mL，加塞后颠倒混勻，在分光光度计上进行比色。调波长MOnm，用0号管调零点，测出1-10号管的光密度值。以光密度值为纵坐标，葡萄糖含量(mg)为横坐标，绘制标准曲线。表1葡萄糖标准曲线制作lmg/mL葡萄糖标准液 GnL)蒸馏水 CmL)DNS (mL)葡萄糖《 (mg)
0022010. 21.820. 220.41.620.430.61.420.640.81. 220.851.01.021.061. 20.821. 271.40.621.481.60.421.691.80. 221.8102.0022.0 实施例2 预处理前水葫芦中纤维素、半纤维素和木质素含量测定新鲜打捞的水葫芦材料，洗净，晾干，80°C烘干，叶片、根部分别粉碎，叶片40目筛组分用于纤维素、半纤维素和木质素含量测定。准确称取l.OOOOg过40目筛样品，用范氏测定纤维素含量法测定各组分含量。预处理前，水葫芦干物质中纤维素、半纤维素和木质素含量分别为25. 8%，32. 4%和14. 2%。实施例3 水葫芦的预处理将过40目筛水葫芦组分，以固液比1 10 (ν/ν)加入装有200mL 0.5%U%>2% H2SO4(w/v) ^PO. 5%U%>2%Na0H(w/v)溶液的三角瓶中，100°C保温lh。待冷却，6层纱布过滤，滤渣水洗至中性，置于60°C烘干。水葫芦样品以固液比1 10(v/v)加入装有200mL 水的三角瓶，100°C保温lh，收集后作为对照。烘干后的样品用于发酵相关品质评价。实施例4 不同预处理条件对水葫芦发酵相关品质的影响高温条件下低浓度的酸、碱对水葫芦的预处理能能破坏水葫芦木质纤维素的天然化学结构、降低木质素和半纤维素对纤维素的保护作用，从而改善木质纤维素难分解的化学性质、增加原料的疏松性以增加纤维素酶或微生物对纤维素的有效接触。因此，本发明从以下几个方面对不同预处理后水葫芦的发酵相关品质进行评价以寻找优化的预处理条件， 包括不同预处理后水葫芦中半纤维素、纤维素和木质素含量、商业纤维素酶RlO对不同预处理后水葫芦样品的酶解效率等。1、不同条件预处理对水葫芦中纤维素、半纤维素和木质素含量的影响过40目筛水葫芦组分，以固液比1 10(v/v)加入装有200mL 0. 5%U%>2% H2SO4(w/v) ΡΟ. 5%U%>2%Na0H(w/v)溶液的三角瓶中，100°C保温lh。待冷却，6层纱布过滤，滤渣水洗至中性，置于60°C烘干。准确称取l.OOOOg不同处理的水葫芦样品，用范氏测定纤维素含量法测定其中纤维素、半纤维素和木质素等各组分的含量。从图3和图4可以看出使用碱预处理方法的材料中木质素含量比较低，木质素的相对去除率也比较高，而未处理样品和酸处理样品中木质素含量较高，相比于碱处理酸处理材料的木质素相对去除率相对较低，由此可以看出酸预处理对材料的木质素去除效果较差。图3可以看出碱处理材料比酸处理材料的半纤维素含量高，而酸处理材料的半纤维素含量非常少，在121°C时酸处理几乎将材料中全部的半纤维素去除。从两图中可以看出随着碱浓度的增加纤维素、半纤维素和木质素的去除率逐渐升高。0. 5% NaOH预处理材料的木质素含量高于其他碱处理方法，木质素的去除率低。1 % NaOH与2% NaOH预处理材料木质素的去除及材料中木质素含量相差不大，并且NaOH中半纤维素的保留量较2% NaOH 高，所以碱处理中NaOH是比较理想的预处理方法。酸预处理对材料的纤维素成分影响较低，对木质素和半纤维影响较大，尤其是半纤维素成分。与2% H2SO4处理的材料中半纤维素含量都低于1%。随着酸浓度的升高木质素的去除率逐渐增加，在2% H2SO4 时木质素含量最低，去除率最高。因此，该图显示酸预处理中2% 预处理为最佳预处理方法。处理前样品总质量为10g，图3中y轴代表各种处理条件下纤维素、半纤维素和木质素在剩余样品中的含量。2、不同条件预处理对水葫芦纤维素酶解特性的影响在生物乙醇的生产过程中经过预处理的木质纤维素材料还需要进行纤维素酶的水解，并将原料中的纤维素成分转化为可溶性糖才能被酵母等乙醇发酵菌利用生产乙醇。 因此，不同条件预处理过的水葫芦样品要进行纤维素酶的糖化水解，测定其糖化水解率、纤维素转化率和酶解的还原糖产量，以此来衡量适合于乙醇发酵的水葫芦预处理方法。预处理过的水葫芦按照25FPU/g水葫芦加入纤维素酶，按照固液比1 50加入pH 4. 8的柠檬酸缓冲溶液，50°C，130rpm，摇床温浴48h。反应结束，4°C，12000rpm，lOmin，取0. 2ml上清液，用于总还原糖的测定，分别得出水葫芦的糖化水解率、纤维素转化率和酶解的还原糖产量。水葫芦的酶解的还原糖产量是通过测定得到吸光度值，然后在葡糖糖标准曲线上得到其毫克数，反推水解液中的还原糖产量。总还原糖量=(测定值X5)/0.2。糖化水解率为转化为还原糖的纤维素占底物总质量的比率。糖化水解率=总还原糖量XO. 9。纤维素转化率为转化为可溶性糖的纤维素占底物中总纤维素的比率。纤维素转化率=糖化水解率/ 纤维素含量百分比。由图可以看出，对照样品的糖化水解率、纤维素转化率和酶解的还原糖产量都比预处理样品的低。随着碱浓度的升高碱预处理样品的糖化水解率、纤维素转化率和酶解的还原糖产量都逐渐增加。随着酸浓度的增加，糖化水解率和酶解的还原糖产量逐渐升高，但因高浓度的酸预处理材料中纤维素脱除率升高，所以纤维素转化率随着酸浓度是升高而降低。从图中可以看出在不同浓度不同条件的预处理方法中2% NaOH预处理的效果最好，所以对水葫芦的乙醇发酵来说2% NaOH是最佳的水葫芦预处理方法。
权利要求
1.一种水葫芦的预处理方法，其特征是含有以下工艺步骤(1)水葫芦材料的收集，打捞新鲜水葫芦，洗净、干燥后，叶片、茎部和根部分开粉碎；(2)以范式纤维素测定法测定水葫芦中半纤维素、纤维素和木质素含量；(3)在100°C下，用酸预处理水葫芦Ih；(4)在100°C下，用碱预处理水葫芦Ih；(5)预处理水葫芦发酵相关品质评价，包括不同预处理后水葫芦中半纤维素、纤维素和木质素含量、商业纤维素酶RlO对不同预处理后水葫芦样品的酶解效率。
2.根据权利要求1所述的一种水葫芦的预处理方法，其特征是所述干燥是在80°C烘干，叶片、茎部和根部分开粉碎时，过40目筛。
3.根据权利要求1所述的一种水葫芦的预处理方法，其特征是所述步骤(3)在100°C 下，用酸预处理水葫芦Ih是将过40目筛水葫芦组分，以固液比1 10(v/v)加入装有 200mL 0. 5%、1%或2% H2SO4(w/v)溶液的三角瓶中，100°C保温lh，待冷却，6层纱布过滤， 滤渣水洗至中性，置于60 V烘干。
4.根据权利要求1所述的一种水葫芦的预处理方法，其特征是所述步骤(4)在100°C 下，用碱预处理水葫芦Ih是将过40目筛水葫芦组分，以固液比1 10(v/v)加入装有 200mL 0. 5%、1%或2% NaOH(w/v)溶液的三角瓶中，100°C保温lh，待冷却，6层纱布过滤， 滤渣水洗至中性，置于600C烘干。
全文摘要
本发明公开了一种水葫芦的预处理方法，含有以下工艺步骤(1)水葫芦材料的收集，打捞新鲜水葫芦，洗净、干燥后，茎部和根部分开粉碎；(2)以范式纤维素测定法测定水葫芦中半纤维素、纤维素和木质素含量；(3)在100℃下，用0.5％、1％、2％H2SO4(w/v)预处理水葫芦1h；(4)在100℃下，用0.5％、1％、2％NaOH(w/v)预处理水葫芦1h；(5)预处理水葫芦发酵相关品质评价，包括不同预处理后水葫芦中半纤维素、纤维素和木质素含量、商业纤维素酶R10对不同预处理后水葫芦样品的酶解效率等。该方法处理得到的水葫芦木质纤维素原料可以用于提高纤维素酶或纤维素利用微生物(厌氧细菌、真菌、酵母)发酵转化水葫芦木质纤维素原料为乙醇等。
文档编号C12P19/14GK102199642SQ20111009271
公开日2011年9月28日 申请日期2011年4月13日 优先权日2011年4月13日
发明者严金平, 伊日布斯, 赵立峰 申请人:昆明理工大学