专利名称：一种利用组培技术快速培育细胞质不育系统中保持系的方法
技术领域：
本发明属于作物遗传育种技术领域，特别是一种利用组培技术快速培育细胞质不育系统中保持系的方法。
背景技术：
作物不育系的利用为杂种优势的推广做出了巨大的贡献。杂种优势利用的方法主要有细胞质雄性不育系、细胞核雄性不育系、自交不亲和系、基因工程雄性不育系和化学杀雄等方法。其中细胞质雄性不育也被称为是细胞质和细胞核互作雄性不育系，以下简称为细胞质雄性不育。有一种类型的细胞质雄性不育系为隐性细胞质雄性不育系，即几乎所有的材料都为其恢复系。育种家要想获得保持系，传统方法是采用洋葱公式人工合成。具体步骤为通常得到的不育系材料基因型为s (rfrf)，自然界中恢复系基因型为N(RfRf)或s (RfRf )，两者之间杂交Fl代基因型s (Rfrf)。取Fl花粉与恢复系回交后自交，将出现两种情况(1) 若后代出现不育单株，则对应的恢复系的细胞质为不育的，这种情况被淘汰。(2)若后代没有不育单株出现，则对应的恢复系的细胞质为可育，并且反交得到N(Rfrf)和N(RfRf)两种基因型。N(Rfrf)自交出现N(RfRf) N(Rfrf) N(rfrf) =1:2:1的分离比，另一种基因型 N(RfRf)自交仍然为N(RfRf)。然后将自交后代的株系与不育系s (rfrf)测交，若出现表型为不育单株，其对应的父本基因型应该为N(rfrf)，这就是我们所需要的保持系。这种方法称为洋葱公式人工合成法。在此过程中需要多代测交、杂交和自交，配制多个测交组合，并且需要大面积种植和多年测定，外加一定的机遇才能成功选育出保持系。在作物不育系统中，有一种不育类型为微量花粉性雄性不育，如甘蓝型油菜中的 Polima雄性不育系和Shan 2A雄性不育系，但在选育过程中会出现微量花粉的程度与保持系的核基因遗传背景有较大关系。在选育保持系时，不育系s (rfrf)要与保持系N(rfrf) 进行多年回交。较为彻底的不育系在与保持系回交时通常会出现较多的微量花粉而被淘汰掉。回交次数越多、组合越多越容易出现微量花粉。从数百个测交组合中能够筛选出的优良保持系寥寥无几。多年的测交和回交工作量大，种植面积广，费时费力和过程繁琐。在传统育种过程中，育种家通常从由不育系配制的优良的杂交组合中分离出优良单株作为育种材料。杂交组合Fl代材料基因型为s (Rfrf)，将基因型s (Rfrf)自交，F2代会产生s (RfRf) s (Rfrf) s (rfrf) =1 2 1分离，如果出现优良不育单株也望洋兴叹，只能在可育株及后代中继续选择，直至找到优良性状可育单株，但筛选出的可育单株一定具有 Rf基因，所以只能做恢复系，而不育株s(rfrf)会被筛选掉。但并不是每个材料都适合做恢复系，所以此方法育种造成育种材料较大浪费。嫁接作为一种营养繁殖为众人所知，但作为一种基因转移方法却很少被应用。植物细胞与细胞之间的通道胞间连丝，有助于植物每个细胞与邻近细胞之间进行有利的分子交换(Liu，2010)，研究证明植株在幼嫩未成熟组织的状态下，大分子交换的通道就更杂乱
3无章，植株越嫩，胞间连丝越大，发生大分子转移的可能性就越大(Rusk，2009) .Stegemann and Bock (science, 2009)研究表明细胞质遗传物质如质体DNA编码转基因可以在嫁接结合处相互转移，并且证明转移后的细胞中两种标记基因都会表达而且是可遗传的。嫁接转移质体基因74株嫁接小苗中有94次质体转移事件。通过嫁接转移线粒体研究在育种中较少利用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用组培技术快速培育细胞质不育系统中保持系的方法，该方法利用组织培养技术将不育系和具有正常细胞质的可育系材料进行嫁接，两者的愈伤组织细胞中的线粒体相互转移，使具有正常细胞质的可育系的线粒体转移到不育系的细胞质中，然后组培分化长根成苗，通过分子鉴定和表型确认，得到既有不育系细胞核遗传物质又有可育系的正常细胞质材料，此材料即可作为保持系，为育种提供保持系材料。本发明依次通过下列步骤实现
1)将细胞质雄性不育系和具有正常细胞质的可育系种子浸泡24h后，依次经清水冲洗 2次、质量比浓度为95%的乙醇处理Imin、无菌水清洗2_3次、质量比浓度为0. 1%升汞漂洗 15min，其间不时摇动、无菌水清洗4次后，接种于MS培养基，取培养8-lOd的幼苗备用；
MS培养基配方MS粉4. 4g /L+糖20g/L +冷凝胶2. 6g/L
2)待种子发芽下胚轴伸长到大约IOcm左右时，将不育系下胚轴切成5mm切段，具有正常细胞质的可育系切成IOmm切段，然后将两种切段切口处接触放于诱导脱分化培养基；
脱分化培养基配方MS&4.41g/L+2，4-D lmg/L+6-BA lmg/L +蔗糖30g/L +冷凝胶 2. 6g/L
3)伤口处出现愈伤组织的分化后，将其转移至分化培养基上；
分化培养基配方MS 盐 4. 41g/L +6-BA4mg/L+ZT 2mg/L+AgN03 5mg/L+ 蔗糖 30g/L + 冷凝胶2. 6g/L
4)伤口处产生绿色和白色致密的愈伤组织后，再转移到分化芽培养基上，此时两种切段的愈伤组织结合在一起生长；
分化芽培养基配方MS盐4.41g/L +6-BA 3mg/L+ZT 2mg/L +蔗糖30g/L +冷凝胶 2. 6g/L
5)培养基两周更换一次，组织分化出的类似嫩叶的组织达Icm左右高时转移至分化茎
培养基中；
分化茎培养基配方MS盐4.41g/L +6-BA 0. 005mg/L +蔗糖30g/L +冷凝胶2. 6g/L
6)分化茎培养基上外植体逐渐生长长成完整的小植株，待其长出4-5片叶、3-4条须根时，打开培养罐，使小植株慢慢适应外界环境，2-3天后，移出植株，清水将根部培养基洗净，移栽至盛有营养土的盆钵中常规培养；
7)取植株叶片提取细胞核DNA并用蔗糖沉淀差速离心法提取线粒体DNA，进行分子鉴定，具有不育系细胞核遗传物质又有可育系的正常细胞质材料即为保持系；
8)分子鉴定完成后进行田间性状观察进一步确认，可育且农艺性状与不育系相似的材料即为选育出的保持系；
上述方法步骤1-6都在组培条件下进行，外植体光照16h黑暗8h培养，培养基两周换
4一次。
图1为在细胞质雄性不育系统中利用传统的洋葱公式合成法合成人工保持系流程图2为本发明方法一种利用组培技术快速培育细胞质不育系统中保持系的方法流程图，细胞质不育系材料与细胞质可育的可育系材料嫁接过程中，对接处形成愈伤，细胞质交流，交流的细胞质分化成苗。本发明可以应用于以下三个方面
(1)可以替代洋葱公式人工合成法培育优良的保持系。有些作物的不育系材料基因型为s(rfrf)，自然界中恢复系基因型为N(RfRf)或S (RfRf)。通过本发明可以将不育系 s(rfrf)与恢复系N(RfRf)的细胞质遗传物质进行交换，后代出现具有N (rfrf)基因型的材料。具有不育系核遗传物质和恢复系的细胞质遗传物质的优良保持系，免去大面积种植、 多年连续测交和回交筛选优良保持系过程。(2)在含有微量花粉细胞质雄性不育系统中，保持系培育需要大量测交和回交， 并且在逐步回交过程中经常因为微量花粉问题而被淘汰掉。在回交过程中，若出现优良的不育系时，采用此发明将不育系与正常细胞质的可育系嫁接，可以直接得到具有不育系核遗传物质和恢复系的细胞质遗传物质的优良保持系，而不需要再次回交。减少育种年限，并且可以获得优良保持系。(3)传统育种过程中，育种家从由细胞质雄性不育系统中配制的杂交种中分离出的可育材料都只能做恢复系，而不育系被淘汰掉。利用本发明可以将优良不育系与正常细胞质的可育系嫁接，可以直接得到具有不育系核遗传物质和恢复系的细胞质遗传物质的优良保持系。可节约育种资源，大大提高育种效率。本发明具有以下优点
(1)洋葱公式合成法合成保持系最少需要5代(3-5年)，并且需要大面积种植和测交。 本发明人工合成保持系只需要1年，主要在实验室完成，不需要大面积种植和测交，可大大节约成本和劳力。(2)含有微量花粉细胞质不育系测交筛选保持系时，利用本发明可以获得更多的含微量花粉较少的不育系及对应的保持系，可大大提高成功选择保持系的概率。(3)在从含有细胞质雄性不育系配制的杂交种Fl中，可以获得优良的不育系及相对应的保持系。
具体实施例方式以油菜作物举例说明
1)将不育系和具有正常细胞质的可育系的种子浸泡24h，并从中踢出黄种皮的和腐烂的种子一清水清洗2次(H2O) — 95%乙醇Imin —无菌水清洗2_3次一0. 1%升汞漂洗 15min (其间不时摇动)一无菌水清洗4次一接种一培养(MSg培养基)取培养8_10d的幼苗备用；
MS培养基配方MS粉4. 4g /L+糖20g/L +冷凝胶2. 6g/L
52)待种子发芽下胚轴伸长到大约IOcm左右，将不育系下胚轴切成5mm切段，具有正常细胞质的可育系切成IOmm切段，然后将两种切段切口处接触放于诱导脱分化培养基；
诱导脱分化培养基配方MS盐4. 41g/L+2，4-D lmg/L+6-BA lmg/L +蔗糖30g/L +冷凝胶2. 6g/L
3)大约两个星期后，通过诱导分化及培养，伤口处会有愈伤组织的分化，将其转移至分化培养基上；
分化培养基配方MS 盐 4. 41g/L +6-BA4mg/L+ZT 2mg/L+AgN03 5mg/L+蔗糖 30g/L + 冷凝胶2. 6g/L
4)大约两个星期，开始分化且伤口处产生绿色和白色致密的愈伤组织后，再转移到分化芽培养基，此时两种切段的愈伤组织结合在一起生长；
分化芽培养基配方MS盐4.41g/L +6-BA 3mg/L+ZT 2mg/L +蔗糖30g/L +冷凝胶 2. 6g/L
5)培养基两周更换一次，在分化芽培养基培养时进行观察，组织会分化出类似嫩叶的组织，如果嫩叶没有长出则继续在分化芽培养基上培养，出现Icm左右高的嫩叶组织时将组织转移至分化茎培养基中；
分化茎培养基配方MS盐4. 41g/L +6-BA 0. 005mg/L +蔗糖30g/L +冷凝胶2. 6g/L
6)分化茎培养基上外植体逐渐生长长成完整的小植株，待其长出4-5片叶、3-4条须根时，打开培养罐，使小植株慢慢适应外界环境，2-3天后，移出植株，清水将根部培养基洗净， 移栽至盛有营养土的盆钵中自然生长，给予充足阳光，定期施肥；
7)取植株叶片提取细胞核DNA并用蔗糖沉淀差速离心法提取线粒体DNA，进行可育基因检测等分子鉴定，若具有不育系细胞核遗传物质又有可育系的正常细胞质材料即为保持系；
8)分子鉴定完成后进行田间性状观察进一步确认，可育且农艺性状同不育系相似的材料即为选育出的保持系。 上述方法步骤1-6都在组培条件下进行，外植体光照16h黑暗8h培养，培养基两周换一次，防止有毒物质积累。
权利要求
1. 一种利用组培技术快速培育细胞质不育系统中保持系的方法，其特征在于，依次通过下列步骤实现1)将细胞质雄性不育系和具有正常细胞质的可育系种子浸泡24h后，依次经清水冲洗 2次、质量比浓度为95%的乙醇处理Imin、无菌水清洗2_3次、质量比浓度为0. 1%升汞漂洗 15min，其间不时摇动、无菌水清洗4次后，接种于MS培养基，取培养8-lOd的幼苗备用；MS培养基配方MS粉4. 4g /L+糖20g/L +冷凝胶2. 6g/L2)待种子发芽下胚轴伸长到大约IOcm左右时，将不育系下胚轴切成5mm切段，具有正常细胞质的可育系切成IOmm切段，然后将两种切段切口处接触放于诱导脱分化培养基；脱分化培养基配方MS&4.41g/L+2，4-D lmg/L+6-BA lmg/L +蔗糖30g/L +冷凝胶 2. 6g/L3)伤口处出现愈伤组织的分化后，将其转移至分化培养基上；分化培养基配方MS 盐 4. 41g/L +6-BA4mg/L+ZT 2mg/L+AgN03 5mg/L+ 蔗糖 30g/L + 冷凝胶2. 6g/L4)伤口处产生绿色和白色致密的愈伤组织后，再转移到分化芽培养基上，此时两种切段的愈伤组织结合在一起生长；分化芽培养基配方MS盐4.41g/L +6-BA 3mg/L+ZT 2mg/L +蔗糖30g/L +冷凝胶 2. 6g/L5)培养基两周更换一次，组织分化出的类似嫩叶的组织达Icm左右高时转移至分化茎培养基中；分化茎培养基配方MS盐4.41g/L +6-BA 0. 005mg/L +蔗糖30g/L +冷凝胶2. 6g/L6)分化茎培养基上外植体逐渐生长长成完整的小植株，待其长出4-5片叶、3-4条须根时，打开培养罐，使小植株慢慢适应外界环境，2-3天后，移出植株，清水将根部培养基洗净，移栽至盛有营养土的盆钵中常规培养；7)取植株叶片提取细胞核DNA并用蔗糖沉淀差速离心法提取线粒体DNA，进行分子鉴定，具有不育系细胞核遗传物质又有可育系的正常细胞质材料即为保持系；8)分子鉴定完成后进行田间性状观察进一步确认，可育且农艺性状与不育系相似的材料即为选育出的保持系；上述方法步骤1-6都在组培条件下进行，外植体光照16h黑暗8h培养，培养基两周换一次。
全文摘要
本发明利用组织培养技术将不育系和具有正常细胞质的可育系材料进行嫁接，两者的愈伤组织细胞中的线粒体相互转移，得到既有不育系细胞核遗传物质又有可育系的正常细胞质材料，即为保持系。本发明可以应用在隐性细胞质雄性不育的人工保持系的合成上、具有微量花粉不育系的保持系的选育中和在含有细胞质雄性不育系的杂交中分离出新的不育系和保持系等方面，可大大丰富保持系选育的途径，提高育种效率。
文档编号C12Q1/68GK102217535SQ20111009902
公开日2011年10月19日 申请日期2011年4月20日 优先权日2011年4月20日
发明者付东辉, 李加纳, 申敏, 肖美丽 申请人:西南大学