专利名称：一种优化的小麦转化方法
技术领域：
本发明属于小麦转基因领域，涉及一种优化的农杆菌介导的纵切幼苗叶基座转化小麦的方法。
背景技术：
小麦是总产量占第二位的粮食作物，在世界各地广泛种植。随着世界人口的增长和人们生活水平的提高，人们对小麦的需求量越来越大，对小麦品质的要求也越来越高。常规育种已不能满足人们对小麦品种和品质的要求。转基因技术的发展打破了常规育种的种族限制，许多作物比如玉米、油菜等利用转基因技术已经成功培育出了优质、高效的转基因新品种。与其他作物相比，小麦的转基因育种相对滞后，转基因成功的例子较少，这由于小麦组织培养植株的再生频率低，建立稳定高效的再生体系比较困难；另一方面，小麦是多倍体作物，基因组大，遗传背景复杂，遗传转化体系不完善。目前，小麦转基因的方法主要有花粉管通道法、基因枪法、PEG介导法以及农杆菌介导法。花粉管通道法是利用植物授粉后花粉萌发形成的花粉管，将外源DNA导入尚不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞中。该方法具有操作简单、耗费低廉、不需要经过繁琐的组织培养过程等优点，但是目前该方法尚不成熟，DNA的导入时间和部位往往会影响植株的结实率，最终很难得到转基因后代。基因枪法是小麦转基因育种的主要方法，在获得的小麦转基因植株的报道中，基因枪法占了绝大多数，这主要由于该方法不受作物基因型的限制、方法相对简单，目前基因枪介导的小麦转化体系已经比较完善。但是基因枪法需要经过复杂的组织培养和植株再生过程，成本花费高、周期长，不利于转基因小麦的产业化。 PEG法主要是以原生质体为受体的转化方法，由于小麦的原生质体再生困难，限制了该方法的使用。由于小麦不是农杆菌的天然宿主、谷物类作物对农杆菌没有伤感反应等原因，农杆菌介导的小麦转化一直是摆在分子生物学家和育种学家面前的一道难题。后来人们虽然实现了农杆菌介导的小麦转化，但是受到基因型、组织培养条件、外植体类型、农杆菌菌株等限制，目前农杆菌介导的小麦转化效率低，需要组织培养和植株再生阶段，周期比较长， 不利于产业化的发展。由于农杆菌转化方法具有易操作、低费用、高效率、插入片段的确定性好、拷贝数低等独特优点，因此通过研究来提高农杆菌的转化效率具有主要的意义。本发明提供了一种农杆菌介导的小麦活体转化方法，除了具有上述农杆菌转化的通用优点外， 还具有转化植株存活率高、不需经过复杂的组织培养等优越性，具有很高的实际操作性和市场推广价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种优化的纵切幼苗叶基座转化小麦的转基因方法，包括 首先浸泡小麦种子使之吸水饱和，长出下胚轴；将含有目的基因的农杆菌用渗透培养基悬浮；用11号手术刀在小麦的叶基座中间部位纵切致伤。
本发明人经过长时间的探索发现，下胚轴的长度是影响小麦分化的关键因素，本发明下胚轴的长度优选为1. 5cm。含有目的基因的农杆菌的获得，是将目的基因插入表达载体，再将该载体导入农杆菌中。常用的表达载体包括但不限于=PBin系列载体、pBI系列在、Gateway系列载体、 pCAMBIA系列载体；常用的农杆菌菌株包括但不限于AGL0、AGL1、GV3101、EHA105、LBA4404寸。小麦幼苗的致伤位置和方式是影响小麦转基因效率的另一个重要因素。本发明人经过长期艰苦的实验发现纵切部位为小麦幼苗的叶基座时转化效率最高，具体操作为用 11号手术刀的刀尖插入叶基座的中央部位，刀刃向基部方向轻轻斜拉出，纵切伤口长度优选为1.5mm。刀刃不能穿透叶基座。在整个致伤过程中，小麦的幼苗植株是完整的，所以本发明中小麦纵切转化后植株的生长状态良好，能够得到高转化效率的转基因后代。本发明所提供的纵切小苗幼苗叶基座转化小麦的转基因方法是一种优化的农杆菌介导的活体转化方法，操作简便、转化效率高、不需经过复杂而漫长的组织培养阶段、 转化后小麦生长状态良好，具有非常大的实际应用价值和市场推广前景。为了便于理解，下面将结合附图和实施例进一步诠释本发明。具体实例和附图仅是为了更好的阐述本发明， 并不构成对本发明范围的限制。显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。
附图 1 :pcambial300-bar 的质粒图谱。
具体实施例方式下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见 《Molecular Cloning: A Laboratory Manual》 (Sambrook， J. ， Russell, David W.， Molecular Cloning: A Laboratory Manual，3rd edition,2001,NY,Cold Spring Harbor)。 所用引物及DNA序列均由上海英骏生物技术有限公司合成。实施例一、纵切幼苗叶原基转化小麦
1.实验材料
质粒含有bar基因，带有潮霉素筛选标记基因的pCambial300-bar载体，具有抗草铵磷除草剂。PCR扩增bar基因连接到pcambial300 (购自hvitrogen公司)载体上得到 pcambial300-bar i^f 本。农杆菌菌株AGLO。供转化的小麦品种京麦9158
2.农杆菌的培养
挑取甘油冻存的含有目的基因的农杆菌，于YEB平板上画线，黑暗培养箱培养2 天。挑取单菌落接种于40ml抗性YEB液体培养基中黑暗摇床200rpm摇过夜，至 OD600 1。吸取上述培养物250 300 μ 1涂布于平板直径为15cm的YEB固体培养基上， 黑暗培养箱培养2天后，此备用的新鲜平板当天使用，约20°C室温黑暗待用，不要继续存留于黑暗培养箱或转存于4°C冰箱。
3.渗透培养基的制备
首先按照下述配方配制AA培养基。AA培养基配制(IL) MgSO40. 12209g KCl 2.95g NaH2PO4 2H20 0. 15g 肌醇 0. Ig 谷氨酸 0.876g
天门冬氨酸 0. 266g 精氨酸0. 174g
酪蛋白水解物 0. 3g 蔗糖20g
铁盐溶液5ml ① EDTA-2Na 7. 46g/L 调 pH=8. 0
②再加4. 5ml/L 5M NaCl
③FeSO4 7H20 5. 56g/L
CaCl2 溶液 4. 5ml25.06g/L
VB1 溶液IOmllg/L
VB6 溶液Imllg/L
畑酸溶液Iml0. lg/L
B5 微量ImlMnSO4 H2O 7. 58g/L
ZnSO4 7H20 2. Og/L H3BO33. Og/L
KI0. 75g/L
Na2MoO4 2H20 0. 25g/L
CuSO4 5H20 0. 025g/L
CoCl2 6H20 0. 025g/L
在IL AA培养基中添加下列成分
As (100 200 ii M )； KT (0. 2mg)； 2，4_D (Img)5DTT (ImM )； L-Cysteine (200 400mg) ；silwet-L77 (100 400 ぬ)。
将培养好的农杆菌用上述滲透培养基悬浮，使悬浮菌液的0D_值为0. 4 0. 7，pH至 5. 0 5. 5，转化渗透培养液制备完毕。4.植株选择准备
浸泡小麦种子使之吸水饱和后25 0C，14小时光照10小时黑暗，保湿条件下萌发3 4天，每天早晩各清洗一次，至胚轴长至1. 5cm。5.农杆菌菌液浸染小麦幼苗叶基座
(1)幼苗浸泡在上述滲透培养基中，用11号手木刀的刀尖插入叶基座的中央部位， 刀刃向基部方向轻轻斜拉出，纵切伤ロ长度为1. 5mm,不要穿透叶基座，使小麦植株是完整 的；
(2)致伤处理后的小麦幼苗浸没在滲透培养基中，28°C，24小时黑暗条件下140 170rpm 培养 15 30min ；
(3)侵染后的小麦幼苗在吸水纸上空干，随后种入湿润的蛭石+营养土(2 :1)混合土中，覆土，25 ^°C，M小时黑暗条件下培养2天，然后移栽到大棚中培养。
权利要求
1.一种优化的农杆菌介导的纵切幼苗叶基座转化小麦的转基因方法，包括首先浸泡小麦种子使之吸水饱和，长出下胚轴；将含有目的基因的农杆菌用渗透培养基悬浮；用11 号手术刀在小麦的叶基座中间部位纵切致伤。
2.权利要求1所述的小麦转基因方法，其特征在于浸泡小麦种子使之吸水饱和，长出下胚轴，下胚轴的长度为1. 5cm。
3.权利要求1所述的小麦转基因方法，其特征在于用11号手术刀在小麦的叶基座中间部位纵切致伤口长度为1. 5mm。
全文摘要
本发明提供了供一种优化的纵切幼苗叶基座转化小麦的转基因方法，包括首先浸泡小麦种子使之吸水饱和，长出下胚轴；将含有目的基因的农杆菌用渗透培养基悬浮；用11号手术刀在小麦的叶基座中间部位纵切致伤。
文档编号C12N15/82GK102329814SQ20111010025
公开日2012年1月25日 申请日期2011年4月21日 优先权日2010年12月14日
发明者何峰, 夏勉, 张建新, 张斌 申请人:北京未名凯拓作物设计中心有限公司