专利名称：甜瓜抗白粉病基因Pm-AN紧密连锁的两个CAPs标记与使用方法
技术领域：
本发明涉及两个位于甜瓜抗白粉病基因Pm-AN两侧，并与Pm-AN紧密连锁的两个共显性CAPs分子标记及使用方法，属于生物技术领域。
背景技术：
广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。狭义的分子标记仅是指DNA标记，是DNA水平上遗传多态性的直接反映，一般所称的分子标记概念即被界定在这个范畴之内。生物在长期进化过程中产生的可遗传变异，都是由于DNA碱基序列变异所 致。同一物种内存在极为丰富的DNA碱基序列变异，为开发和利用分子标记奠定了坚实基础。DNA分子标记是指生物基因组DNA经限制性内切酶酶切、聚合酶链式反应(PCR)扩增或两者结合等措施处理后电泳，检测到的反映基因组某种变异特征的特异性DNA片段。分子标记与其他遗传标记相比，具有如下优点(I)直接以DNA的形式表现，不受发育时期、组织器官、环境条件的影响；(2)数量极多，几乎遍及整个基因组；(3)分子标记的等位位点变异水平比表型标记丰富得多，即多态性很高，以致无须专门创造特殊的遗传材料；(4)分子标记对生物体通常没有不良影响，也不影响生物性状的表现，即表现为“中性”；(5)许多分子标记为共显性标记，能鉴别出纯合基因型和杂合基因型，提供完整的遗传信息；(6)信息量大，分析效率高；(7)稳定遗传，可靠性强，重现性好；⑶速度快，操作简便。分子标记的这些优点，使它在生命科学的理论和应用研究中具有极其重要的应用价值。近年来，分子生物学发展异常迅速，与作物遗传育种密切相关的分子标记更是令人瞩目，使得植物育种中的“间接选择”已经成为可能，大大地提高了遗传分析的准确性和选育品种的有效性，在遗传育种领域愈来愈受到重视，将二者有机结合是今后育种工作的趋势。目前常用的分子标记技术主要有 RFLP、RAPD, AFLP, SSR、SNP、SCAR、SRAP, STS、EST 等。CAPs (cleaved amplification polymorphism sequence-tagged sites) CAPs 技术又称为PCR-RFLP。是用特异设计的PCR引物扩增目标材料时，由于特定位点的碱基突变、插入或缺失数很少，以至无多态出现，往往需要对相应PCR扩增片段进行酶切处理，以检测其多态性。CAPs标记在二倍体植物研究中可发挥巨大的作用。该标记的优点首先是共显性从而可以区分纯合体与杂合体基因型，其次是很高的稳定性与可靠性。甜瓜白粉病是甜瓜主要病害之一，培育抗白粉病甜瓜品种是甜瓜抗病育种的重要目标。新疆是厚皮甜瓜的次生起源中心，以哈密瓜为代表的我国厚皮甜瓜品种大多易感白粉病。传统育种的方法难以区分纯合与杂合基因型，难以实现不同抗白粉病基因的聚合，更无法选择在抗病基因附近发生重组的个体。本发明提供了引进抗病品种安农二号抗白粉病基因Pm-AN两侧各一个CAPs分子标记，通过这两个与抗白粉病基因Pm-AN紧密连锁的标记进行辅助育种克服了上述困难，可以大大提高甜瓜抗白粉病新品种的育种效率。
发明内容
本发明的目的在于发明一种甜瓜抗白粉病基因连锁的共显性分子标记及使用方法，通过本发明中的分子标记可以判断出甜瓜个体抗病或感病两种基因型，因此提高甜瓜抗白粉病个体的选择目的性与选择效率。用于甜瓜抗白粉病分子标记辅助育种。为实现该目的，本发明采取以下技术方案与抗白粉病基因Pm-AN紧密连锁的两个CAPs分子标记，其特征在于具有序列表中SEQ ID NO :1 8所述的DNA序列。序列表中SEQ ID NO 1是抗白粉病基因Pm-AN紧密连锁的CAPs标记RPW的上游引物RPWl的序列。 序列表中SEQ ID NO 2是抗白粉病基因Pm-AN紧密连锁的CAPs标记RPW的下游弓丨物RPW2的序列。序列表中SEQ ID NO 3是抗白粉病基因Pm-AN紧密连锁的CAPs标记RPW在抗病品种中的特异扩增片段的DNA序列。序列表中SEQ ID NO 4是抗白粉病基因Pm-AN紧密连锁的CAPs标记RPW在感病品种中的特异扩增片段的DNA序列。序列表中SEQ ID NO 5是抗白粉病基因Pm-AN紧密连锁的CAPs标记MRGH63B的上游弓I物MRGH63BI的序列。序列表中SEQ ID NO 6是抗白粉病基因Pm-AN紧密连锁的CAPs标记MRGH63B的上游引物MRGH63B2的序列。序列表中SEQ ID NO 7是抗白粉病基因Pm-AN紧密连锁的CAPs标记MRGH63B在抗病品种中的特异扩增片段的DNA序列。序列表中SEQ ID NO 8是抗白粉病基因Pm-AN紧密连锁的CAPs标记MRGH63B在感病品种中的特异扩增片段的DNA序列。与抗白粉病基因Pm-AN紧密连锁的两个CAPs分子标记，其使用方法包括以下步骤取甜瓜抗病与感病杂交分离后代个体组织材料，提取甜瓜基因组DNA，使用RPW和MRGH63B特异性扩增引物对甜瓜基因组DNA进行PCR扩增，抗病品种和感病品种中两个CAPs标记扩增片段经测序得到基因序列分别如序列表SEQ ID NO :3 4和SEQ ID N0:7 8所示，使用限制性内切酶Alu I和Msp I对扩增产物进行酶切，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，得到如附图I和附图2所示的高低不同的DNA条带。上述基因组DNA提取方法、PCR反应体系与条件,酶切反应体系与条件同实施例所述。抗病特异片段由于被内切酶切开，因此出现两条较小条带。感病特异片段不能被内切酶切开，因此出现一条较大条带。根据该结果可以判断甜瓜个体的感病或抗病基因型基因型，也可以判断出在抗病基因与CAPs标记RPW和MRGH63B之间是否发生重组。从而进行分子标记辅助选择育种。本发明的优点在于1.直接以DNA的形式表现，不受田间白粉病发病的影响。2.分子标记为共显性标记，能鉴别出纯合基因型和杂合基因型，提供完整的遗传信息。3.应用该标记辅助选择甜瓜抗白粉病品种可大大提高选择效率。4.可用该标记实现不同抗白粉病基因分子聚合。5.通过选择抗白粉病基因Pm-AN与两个紧密连锁的分子标记之间发生重组的个体，可以打破抗白粉病基因与不利基因的连锁，避免连锁累赘。6.通过琼脂糖凝胶电泳检测试验结果，无需操作复杂的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。
图I是标记PRW在两个亲本和F2不同个体进行检测的琼脂糖凝胶电泳图，图中箭头所指为电泳条带大小。图2是标记MRGH63B在两个亲本和F2不同个体进行检测的琼脂糖凝胶电泳图，图中箭头所指为电泳条带大小。
具体实施例方式实施例通过甜瓜抗白粉病基因Pm-AN连锁的分子标记选择纯合抗病株系I.实验材料甜瓜作图亲本材料安农二号和哈密瓜K413由新疆国家瓜类工程技术研究中心提供。安农二号由林德佩教授于1986年从日本引进,优质高产,抗白粉病、蔓割病、病毒病、霜霉病和枯萎病等多种病害，果实呈圆形，白皮白肉有网纹，小果型厚皮甜瓜(15CmX12Cm)。K413为典型的哈密瓜类型甜瓜植株抗病性差，果实椭圆形，黄皮黄肉，口感脆，瓜型大(30cmX 16cm)。2.实验方法2. I新疆甜瓜基因组DNA的提取(I)取50mg左右新鲜甜瓜叶片于EP管中，加入0. 4ml的2 X CTAB缓冲液，用研磨研磨，65°C水浴0. 5h，期间轻轻摇匀I次；
(2)取出离心管冷至室温，加入等体积的氯仿/异戊醇(24 I)，轻缓颠倒混匀；(3)室温下 12000r/min 离心 IOmin ；(4)将上清转入另一离心管中，加入等体积预冷的异丙醇，颠倒混匀；(5) 12000r/min 离心 IOmin,弃上清；(6)将沉淀溶于20 U I双蒸水中，-20°C保存。2. 2DNA模板的PCR扩增RPff标记和的MRGH63B标记弓丨物序列RPffl (引物 I) GCATTGGGTGTTCCGTTTARPW2 (引物 2) CAGTTGGGTAATCGGGAGMRGH63B1 (引物 I) GAACATCTCATCCCTCAAGTTMRGH63B2(引物 2) GGAAGAACAGAGCCAAAGAA反应总体积20 U I,体系如下。PCRBuffer(IOX)2|il
dNTP Mixture (各 IOmM)0.4卩1
引物 1(50_)0.2(^1
引物 2(50pM)0.2^1
酶(5U/V1)0.2^1
模板DNA1^1
ddH2011卩1预扩增PCR反应程序如下
Step I94 °C2min
Step 294 °C30s
Step 356 °C30s
Step 472 °Clmin
Step 5Goto Step 230 Cycles
Step 672 °C7min
Step 74°CooPCR反应结束后，取6 U I预扩增产物，I %琼脂糖凝胶电泳检测预扩增效果。预扩增产物经ddH20稀释后作为下面选择性扩增的模板。2. 3样品DNA的酶切分别用种限制性内切酶Alul，Msp I对RPW标记和的MRGH63B标记的PCR反应产物进行酶切，反应体积为10 U 1，混匀后37°C水浴4h。
PCR产物5pl
10 X Buffer'2卩1
内切酶0.15nl
ddH202.85^1反应结束后，I. 5%的琼脂糖凝胶电泳检测酶切是否完全。3.结果记录与分析含抗白粉病基因Pm-AN的安农二号的基因组DNA用RPWl和RPW2引物进行PCR扩增，产物经AluI酶切产生265bp和380bp的条带，而感病品种K413基因组PCR产物经AluI酶切后产生645bp的条带。含抗白粉病基因Pm-AN的安农二号的基因组DNA用MRGH63B1和MRGH63B2引物进行PCR扩增，产物经Msp I酶切产生139bp和103bp的条带，而K413基因组PCR产物经MspI酶切后产生242bp的条带。在安农二号和K413杂交143个F2个体中，发现2株在RPW标记与白粉病基因位点之间发生重组，一株RPW标记仅有645bp条带，即表现纯合感病亲本的基因型，植株为抗病，因此该植株具有抗白粉病基因，而且在抗白粉病基因一侧很近的距离内发生了重组，可以用于打破不利基因的连锁累赘；另一株表现RPW标记表现为杂合体基因型，植株表现出感病。其余141株RPW标记检测结果与抗病性表现一致。在安农二号和K413杂交143个F2个体中，发现2株在RPW标记与白粉病基因位点之间发生重组，一株RPW标记仅有240bp条带，即表现纯合感病亲本的基因型，植株为抗病，因此该植株具有抗白粉病基因，而且在抗白粉病基因一侧很近的距离内发生了重组，可以用于打破不利基因的连锁累赘；另一株表现RPW标记表现为杂合体基因型，植株表现出感病。其余141株RPW标记检测结果与抗病性表现一致。
该区域经遗传连锁作图分析表明，RPW标记和MRGH63B标记分别位于抗白粉病基因Pm-AN两侧I. 4cM和2cM。同时使用两个标记对分离后代基因型进行判断准确率为100%。安农二号和K413杂交143个F2个体中，使用两个共显性标记鉴别出纯合抗病个体共36株，自交后代不发生抗病分离，这些个体用于选育抗白粉病新种质和新品种。
权利要求
1.甜瓜抗白粉病的共显性CAPs分子标记RPW，其特征在于使用序列表中SEQID NO:I 2所述的DNA引物序列可扩增获得，包含SEQ ID NO :3 4的基因序列。
2.甜瓜抗白粉病的共显性CAPs分子标记MRGH63B，其特征在于使用序列表中SEQIDNO :5 6所述的DNA引物序列可扩增获得，包含SEQ ID NO :7 8的基因序列。
3.如权利要求I所述的分子标记，其特征在于通过引物SEQID NO :1 2进行PCR扩增的产物，经Alu I酶切在抗白粉病材料和感白粉材料产生多态。
4.如权利要求2所述的分子标记，其特征在于通过引物SEQID NO :5 6进行PCR扩增的产物，经MspI酶切在抗白粉病材料和感白粉材料产生多态。
5.如权利要求I和权利要求2所述的分子标记的使用方法，其特征在于通过提取甜瓜组织DNA，用SEQID NO :1 2和SEQ ID NO :5 6的引物序列进行PCR扩增，用限制性内切酶Alu I及Msp I酶切，琼脂糖凝胶电泳检测，判断植株是否含有抗白粉病基因Pm-AN，基因型是否纯合，以及该基因两侧的两个甜瓜CAPs分子标记之间是否发生重组。
全文摘要
本发明涉及两个位于甜瓜抗白粉病基因Pm-AN两侧，并与Pm-AN紧密连锁的两个共显性CAPs分子标记及使用方法，属于生物技术领域。将该标记用于甜瓜抗白粉病分子标记辅助育种，可大大提高甜瓜抗白粉病育种目的性与育种效率。该标记的适用不受田间发病因素影响，可以有效选择出纯合抗病基因型和杂合抗病基因型个体、在抗白粉病基因两侧发生重组的基因型个体，该标记可以用于抗病分子聚合育种，且不涉及转基因安全性问题。
文档编号C12Q1/68GK102747070SQ20111010150
公开日2012年10月24日 申请日期2011年4月22日 优先权日2011年4月22日
发明者宁雪飞, 李冠, 王贤磊, 马东建, 高兴旺 申请人:新疆大学