专利名称：抗脂肪酸合成酶多肽及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及多肽药物领域，具体涉及抗脂肪酸合成酶的多肽和编码此多肽的多核苷酸，以及它们的应用。
背景技术：
脂肪酸合成酶(Fatty acid syntheses, FAS)是生物体内源性脂肪酸合成过程中的关键酶，它通过催化乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A而生成长链脂肪酸。FAS包括乙酰基转移酶(AT)、丙二酰基转移酶(MT)、^ -酮脂酰合酶(KS)、^ -酮脂酰还原酶(KR)、^ -羟 脂酰脱水酶(HD)、烯脂酰还原酶(ER)及硫酯酶(TE)等7个功能域。FAS与肥胖密切相关，在脂肪组织中有较高的表达。同时，FAS在人的肝脏中甚至有更高的表达，肝脏的脂肪酸合成能力较脂肪组织高8 9倍，因此，FAS也与脂肪肝的形成密切相关。脂肪肝，是指由于各种原因引起的肝细胞内脂肪堆积过多的病变。此外，传统的理论认为脂肪酸合成代谢只是一个能量合成存储途径而已，但目前大量研究表明，乳腺癌、肝癌、前列腺癌、卵巢癌、结直肠癌和子宫内膜癌等肿瘤组织中FAS的表达水平远高于正常组织，而抑制FAS在上述肿瘤组织的活性可明显抑制肿瘤的生长。因此，FAS也正日益成为治疗上述疾病的药物新靶标。因此，研究FAS抑制剂对于抑制内源性脂肪酸生物合成，从而有效地控制肿瘤、月旨肪肝、肥胖及各种相关代谢综合症等疾病的发生、发展具有重要的意义。已有研究显示，FAS 的特异性小分子抑制剂可以通过抑制FAS，进而减少脂肪酸的合成。由于脂肪酸合成受阻，导致其底物丙二酰辅酶A浓度升高，可直接作用于下丘脑的进食中枢，抑制促进摄食的神经肽Y的分泌，从而导致进食抑制。此外，FAS抑制剂还可以改善非胰岛素依赖型糖尿病，降低高血压、冠状动脉栓塞及其他肥胖并发症的症状，降低其发病率。目前已知，硫内酯类C75结构类似物、丁内酯类及丁内酰胺类化合物、尿素类化合物、多酚类植物提取物和羟基喹啉类化合物等化学物质均可能具有抑制脂肪酸生物合成酶的作用。但这些化合物抑制剂作为药物均有较强的毒副作用，且有些化学性质不稳定，因此在临床应用中受到诸多限制。
发明内容
本发明涉及一种抗脂肪酸合成酶(FAS)的多肽，其具有抑制FAS转录和表达的作用，进而在体内外可抑制FAS的表达。该多肽和它的肽模拟物，包括它们的功能片段和功能变体，以及编码这些多肽、肽模拟物或它们的功能片段、功能变体的基因，可广泛用于防治肿瘤、脂肪肝和肥胖的发生和发展，包括抑制肝癌细胞的生长和发展。
一方面，本发明提供了分离的多肽或肽模拟物，其包含如SEQ IDNO :1所示的氨基酸序列、或其功能片段或功能变体，所述多肽或肽模拟物具有抑制FAS转录和表达的功能，可广泛用于防治肿瘤、脂肪肝和肥胖的发生和发展，包括抑制肝癌的发生和发展。在本发明的一些实施例中，上述多肽或肽模拟物可以包含与SEQID N0:1所示的氨基酸序列具有至少80 %，或者90 %，或者95 %，以及甚至更高的相同性的氨基酸序列。在本发明的另外一些实施例中，这些多肽或肽模拟物包含如在SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列的中间或端侧添加或缺失一个或数个氨基酸，或者对其序列中的一个或数个氨基酸残基进行置换后得到的氨基酸序列。较优选地，这些多肽或肽模拟物包含在SEQ IDNO 1所示的氨基酸序列的端侧添加或缺失一个氨基酸后得到的氨基酸，或者对其氨基酸序列中的一个氨基酸残基进行保守性置换后得到的氨基酸序列。更优选地，这些多肽或肽模拟物包含如SEQ ID NOs :1-6中所示的任一种氨基酸序列。另一方面，本发明提供分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码如SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列、其功能片段或功能变体的多核苷酸；或者是与包含编码如SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列、其功能片段或功能变体的多核苷酸互补或严格杂交的多核苷酸。优选地，所述如SEQ ID NO: I所示的氨基酸序列的功能片段或功能变体包含在如SEQ ID N01所示的氨基酸序列的中间或端侧添加或缺失一个或数个氨基酸，或者对其序列中的一个或数个氨基酸残基进行置换后得到的氨基酸序列。较优选地，所述如SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列的功能片段或功能变体包括在如SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列的中间或端侧添加或缺失一个氨基酸所得到的氨基酸序列，或者对上述SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列中的一个氨基酸残基进行保守性置换后得到的氨基酸序列。更优选地，上述如SEQ ID N01所示的氨基酸序列的功能片段或功能变体包括如SEQ ID NOs :2-6所示的氨基酸序列。·另一方面，本发明还提供含有外源多核苷酸的重组表达载体，其包含上述编码如SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列、其功能片段或功能变体的多核苷酸；或者是与包含上述编码如SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列、其功能片段或功能变体的多核苷酸互补或严格杂交的多核苷酸。此外，本发明也提供包括上述多肽或肽模拟物、核苷酸以及重组表达载体在制造用于预防和治疗肿瘤、脂肪肝和肥胖的药物中的应用。在一个具体实施例中，所述药物可应用于在体内外抑制肝癌细胞的生长，从而可应用于预防和治疗肝癌。所述药物也可以包含药物组合物,这些药物组合物可以包含任选的药物载体。本发明中，所述的多肽及其肽模拟物，包括它们的功能片段和功能变体，作为抗FAS的有效抑制因子，具有抑制FAS的转录和表达的能力，从而能用于预防和治疗肿瘤、月旨肪肝和肥胖的发生和发展，包括预防和治疗肝癌的发生和发展。值得强调的是，本发明提供的上述多肽，水溶性好，性质稳定，无免疫原性，且具有明显的药效学作用，因此可以成为治疗上述疾病的有效药物。
图I.应用高压液相色谱(HPLC)对纯化后人工合成多肽Anti-FAS_P18进行分析，显示所获得的多肽的纯度为98. 11%。图2.应用报告基因检测本发明的多肽基因质粒对肝癌细胞中SREBP-Ic和FAS启动子的影响。结果显示，p-Anti-FAS-P18对IfepG2细胞中SREBP-Ic和FAS启动子的活性具有抑制作用，且该抑制作用呈剂量依赖性，表明本发明的多肽基因表达产物具有抑制FAS基因转录表达的作用。*P < 0. 05, **P < 0. 01,进行Student’ s t test统计学分析。图3.检测本发明的多肽及其变异体在细胞水平对肝癌细胞HepG2中SREBP-Ic和FAS启动子活性的影响。结果显示，人工合成的多肽Anti-FAS-P18对肝癌HepG2细胞中SREBP-Ic和FAS启动子的活性具有抑制作用，且该抑制作用呈剂量依赖性，表明本发明的多肽具有抑制FAS基因转录活性的作用。而100 ii M的本发明多肽Anti-FAS-P18的变异体P18-1至P18-5对SREBP-Ic和FAS启动子的活性也有不同程度的抑制作用。*P < 0.05，**P < 0. 01,进行 Student’ s t test 统计学分析。图4.应用免疫印迹检测本发明的多肽基因质粒对肝癌细胞中FAS蛋白表达水平的影响。结果显示，p-Anti-FAS-P18对HepG2细胞中FAS蛋白表达水平具有抑制作用，且该抑制作用呈剂量依赖性。图5.应用免疫印迹检测本发明的多肽对肝癌细胞中FAS蛋白表达水平的影响。结果显示，人工合成的多肽Anti-FAS-P18对H印G2细胞中FAS蛋白表达水平具有抑制作用，且该抑制作用呈剂量依赖性。 图6.应用报告基因检测本发明的多肽基因质粒对肝癌细胞中NF-B启动子的影响。结果显示，P-Anti-FAS-P18对H印G2细胞中NF-B启动子的活性具有抑制作用，且该抑制作用呈剂量依赖性，表明肝癌细胞的增殖能力下降。*P < 0. 05，**P < 0. 01，进行Student’st test统计学分析。图7.应用报告基因检测本发明的多肽变异体及其对肝癌细胞中NF-B启动子的影响。结果显示，Anti-FAS-P18对HepG2细胞中NF-B启动子的活性具有抑制作用，且该抑制作用呈剂量依赖性，表明肝癌细胞的增殖能力下降。100 u M的本发明多肽Anti-FAS-P18的变异体P18-1至P18-5对NF-B的活性也有不同程度的抑制作用。*P < 0. 05，**P < 0. 01，进行Student’ s t test统计学分析。图8.应用MTT检测本发明的多肽基因质粒对肝癌细胞增殖的影响。结果显示，P-Anti-FAS-P18对H印G2细胞的增殖具有抑制作用，且该抑制作用呈剂量依赖性。*P< 0. 05, **P < 0. 01,进行 Student’ s t test 统计学分析。图9.应用MTT检测本发明的多肽及其变异体在细胞水平对肝癌细胞增殖的影响。结果显示，人工合成的多肽Anti-FAS-P18具有抑制HepG2细胞增殖的作用，且该抑制作用呈剂量依赖性。100 u M的本发明多肽Anti-FAS-P18的变异体P18-1至P18-5对肝癌H印G2细胞的增殖也有不同程度的抑制作用。*P<0. 05，**P< 0.01，进行Student’s t test统计学分析。图10.人工合成的多肽Anti-FAS-P18对H印G2细胞的作用。裸鼠接种实验结果显示，应用本发明人工合成的多肽Anti-FAS-P18对H印G2细胞的生长和增殖具有明显的抑制作用。林P < 0. 01, Student，s ttest统计学分析图11 :人工合成的多肽Anti-FAS_P18(P18)对裸鼠体重的影响。裸鼠接种实验中，应用人工合成的多肽Anti-FAS-P18对裸鼠的体重无明显影响。
图12.构建多肽真核表达载体的连接示意图
具体实施例方式本发明中，包括说明书和权利要求书，使用的下列术语除非特别说明，具有如下的含义“分离的” 一词是指将物质从它原始的环境(例如，若是自然产生的就指其天然环境)分离出来。比如说，一个自然产生的多核苷酸或多肽存在于活动物中就是没有被分离出来，而同样的多核苷酸或多肽同一些或全部在自然系统中与之共存的物质分开就是分离的。这样的多核苷酸或多肽可以是某ー载体的一部分，也可以是某ー组合物的一部分。既然载体和组合物不是它的天然环境的成分，它们仍然是分离的。“纯化的” ー词意指已经在纯度上提高的。“纯度”在这是相对术语，并不必要地解释为绝对纯度。例如，纯度可以是至少约50%，或可以是大于60%、70%、80%、90%、或可以是100%。如本发明中所用，分离的物质是从其原始环境中分离出来。活体细胞内的天然状态下的多核苷酸和多肽是没有分离的，但同样的多核苷酸和多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离的，同时纯度上得到了提高，也因此是纯化的。“核酸”、“核酸序列”或“碱基序列”是指核苷酸，寡核苷酸或多核苷酸及其片段或部分。本发明的核酸能够以RNA (例如，mRNA)的形态、或DNA的形态(例如，cDNA或基因组DNA)存在。DNA可以是双链，也可以是单链。单链DNA或RNA可以是编码链(有义链)、或非编码链(反义链)中任ー种。另外，本发明的多核苷酸也可以在其5’端或3’端融合编码标签标记(标签序列或标记物序列)的多核苷酸。它们可以是合成的或是从天然来源获 得的(例如，分离和/或纯化)，其可以包含天然的、非天然的或者修饰过的核苷酸，并且其可以包含天然的、非天然的或改变的核苷酸之间的键，诸如氨基磷酸酯键或硫代磷酸酯键，用来代替在未修饰的寡核苷酸中核苷酸之间存在的磷酸ニ酯键。所谓“氨基酸序列”或“多肽”是指肽、寡肽、多肽或蛋白质及其部分片段，其间以肽键相连接的氨基酸。当本发明中的“氨基酸序列”涉及ー种天然存在的蛋白质分子的氨基酸序列吋，这种“多肽”或“蛋白质”并不意味着将氨基酸序列限制为与所述蛋白质分子相关的完整的天然氨基酸序列。本发明的氨基酸序列可以含有附加的肽。作为附加的肽，如多组氨酸标签(His-tag)、或Myc、FLAG等表位标记的肽为例。“缺失”是指在氨基酸序列或核苷酸序列中一个或多个氨基酸或核苷酸的缺失。“插入”或“添加”是指在氨基酸序列或核苷酸序列中的改变导致与天然存在或改变前的分子相比，一个或多个氨基酸或核苷酸的增加。“置換”是指由不同的氨基酸或核苷酸替换ー个或多个氨基酸或核苷酸。“缺失、置换或添加一个或多个氨基酸或核苷酸”则是指，利用定位诱变法等公知的突变核酸或多肽的制作法缺失、置换或添加能够缺失、置换或添加的程度的数目的氨基酸或核苷酸。上述突变不限于利用已知的定点突变法而人为诱导的突变，也可以是对天然存在的核酸或蛋白质的突变进行分离纯化而得到的。对氨基酸的突变可以包含有一个或多个氨基酸残基为构象为D-型的氨基酸，自然界存在的稀有氨基酸或人工修饰的氨基酸，这些氨基酸可以是也可以不是由遗传密码子编码的。与此相类似的，诱导核酸发生突变，可以包括自然界天然存在的核苷酸，也可以包括具有修饰的核苷酸。多肽的“功能片段”是指所述多肽的任何部分，该部分保留其作为一部分的多肽(即“亲本”多肽)的基本相似或相同的生物学活性和功能。多肽的“功能变体”是指基本上保持如所述多肽或氨基酸序列相同或相似的生物学功能或活性的氨基酸序列，它们可以包括，例如，D原氨基酸序列中一个或多个氨基酸残基有缺失和/或一个或多个氨基酸残基被添加；或者2)原氨基酸序列中一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基取代；或者3)原氨基酸序列中一个或多个氨基酸残基上的某个基团被其它基团取代；或者4)原氨基酸序列和另外的分子或化合物(比如糖、脂类、聚こニ醇等)的融合；或者5)原有的氨基酸序列与添加的氨基酸序列融合进而形成的多肽序列(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列等)；或者6)原氨基酸序列的逆反类似物；或者7)以上各种情况的混合。本发明中，氨基酸序列的功能变体，可以包含有一个或多个氨基酸残基为构象为D-型的氨基酸，自然界存在的稀有氨基酸或人工修饰的氨基酸，这些氨基酸可以是也可以不是由遗传密码子编码的。多肽的“逆反类似物”是指包括反转的亲本多肽氨基酸序列的多肽，以致所述逆反类似物的氨基酸序列(当从N端向C端读取时)与当从C端向N端读取时的亲本多肽的氨基酸序列相同；此外，逆反类似物中每ー个氨基酸是该氨基酸的D异构体，D异构体与L异构体相反。例如，三肽Val-Ala-Gly的逆反类似物具有氨基酸序列Gly-Ala-Val，其中每个氨基酸是D异构体。本发明中，“肽模拟物”是指具有与相对应多肽基本相同的通用结构且具有，例如，能増加其稳定性或生物学功能的修饰的化合物。肽模拟物包括，例如，包含与相对应多肽的相同氨基酸序列的那些化合物，但在其中两个或更多个氨基酸之间，肽模拟物具有改变的 主链。所述肽模拟物可以包括合成的或非天然存在的氨基酸来代替天然存在的氨基酸。本发明中，核苷酸序列的“简并变异体”是这样的多核苷酸序列，其与亲本核苷酸序列有区別，但编码的蛋白质和多肽和亲本核苷酸序列所编码的蛋白质或多肽一祥。“核酸杂交”在本领域已公知(參见,例如，Sambrook等，Molecular Cloning ALaboratory Manual, 3rd Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory, 2001)。通常，温度越高，盐浓度越低，则严谨性变得越高(难以杂交)，从而能够取得更加相同的多核苷酸。适合的杂交温度根据碱基序列或其碱基序列的长度而异。另外，本发明还涉及在“严格条件”下杂交。本发明中，“严格条件”是指，在较低离子強度和较高温度下的杂交和洗脱。例如，42°C的条件下、在杂交溶液(含50%甲酰胺、5 X SSC(150mM氯化钠+15mM柠檬酸三钠)、50mM的磷酸钠(PH7. 6)、5X邓哈特溶液、10%硫酸葡聚糖和20μ g/ml的变性剪切鲑鱼精子DNA)中孵育过夜，然后在65°C条件下用O. IXSSC洗脱。“同源性”是指互补的程度，可以是部分同源，也可以是完全同源。“部分同源”是指ー种部分互补的序列，其可部分抑制完全互补的序列与靶核酸的杂交。这种抑制可通过在严格性程度降低的条件下进行杂交(Southern印迹或Northern印迹等)来检测。基本同源的序列或杂交探针可竞争和抑制完全互补的序列与靶序列在严格性程度降低的条件下的结合。当然，严格性降低的条件并非允许非特异性的结合，两条序列相互结合，仍然需要特异性或选择性的相互作用。氨基酸序列或核苷酸序列的“相同性”或“同一性”百分率是指在两种或多种氨基酸或核苷酸序列比较中，序列相同或相似的百分率。有很多本领域技术人员熟知的方法测定相同性百分率，如通过 MEGALIGN 程序(Lasergene software package, DNASTA, Inc.,Madison, WI)。MEGALIGN程序可根据不同的方法如Cluster法比较两种或多种序列(參见Higgins & Sharp7Gene 73 :237_244，(1988))，Gluster法通过检查所有配对之间的距离将各组序列排列成簇，然后将簇以成对或成组分配。两个氨基酸序列如序列A和序列B之间的相同性百分率可以通过下式计算[(序列A与序列B之间匹配的残基个数)/(序列A的残基数-序列A中间隔残基数-序列B中间隔残基数)]X 100%
同理,也可以通过Gluster法或其他本领域已知的方法(參见Hein J. , Methodsin Emzumology 183 :625-645,1990),测定核酸序列的相同性百分率。“重组表达载体”是指遗传修饰的寡核苷酸或多核苷酸重组体，该重组体克隆有编码mRNA、蛋白、多肽、或肽的核苷酸序列，当该表达载体进入宿主细胞后可表达相应的mRNA、蛋白、多肽、或肽。本发明中，重组表达载体可以包含任意类型的核苷酸序列，但不仅限于是DNA或RNA，可为单链或双链、人工合成或来自天然，也可为非天然的或改变的核苷酸。核苷酸之间的键可以是天然存在的、也可以是非天然存在的或修饰的。本发明中，“治疗”和“预防”以及由它们派生的词语，但并不意味是100%的或完全的治疗或预防，可以认定为本领域技术人员所认同的治疗或预防程度。本发明中的“预防”可理解为延迟疾病、或其症状或病症的发作。多肽本发明提供分离或纯化的多肽，本发明涉及的多肽可以是包含、基本由、或由氨基·酸序列 Gly-Gly-Cys-Arg-His-Lys-Leu-Val-Cys-Ala-Pro-Ala-Pro-Cys-Asn-Phe-Phe-Thr(SEQ ID NO 1)所组成的多肽。FAS基因的表达受其上游调控因子固醇类调节元件结合蛋白Ic(Steix)Iregulatory element binding protein lc, SERBP-1c)的调控。当 SERBP-lc 转录活性受到抑制吋，FAS基因的表达水平下调。因此，调控SERBP-Ic启动子的活性，可间接调节FAS基因的表达。上述本发明的多肽，可以通过抑制SERBP-Ic的转录，进而发挥抑制FAS转录和表达的作用，因此可以用于防治肿瘤、脂肪肝和肥胖的发生和发展，包括抑制肝癌细胞的发生和发展。所述抑制作用在分子水平、细胞水平和动物水平均有体现。如，所述多肽在分子水平上可以抑制SREBP-Ic和FAS启动子的活性，并下调FAS蛋白的表达水平，从而构成对FAS的有效抑制，且其抑制效果呈量效关系；所述多肽的上述抑制作用在细胞水平也体现出来，如所述多肽通过抗FAS的作用能抑制体外肿瘤细胞的生长和増殖，且其抑制效果也呈量效关系；通过裸鼠接种方法显示，所述多肽在动物水平也能有效抑制肿瘤细胞的成瘤能力，而同吋，所述多肽对裸鼠体重无影响。本发明还提供所述本发明多肽的各种功能片段。所述功能片段可以为本发明的多肽的连续氨基酸序列的任何片段，条件是其与亲本多肽相比，能以相似程度、相同程度、或更高程度保留亲本多肽的生物活性，例如，抑制FAS的转录和表达的活性。參照亲本多肽，所述功能片段可以具有，例如，亲本多肽的约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、100%、105%、110%、120%、150%、200%或更高的活性。本发明的多肽的功能片段，优选包括与所述亲本多肽具有至少70%的序列同一性的氨基酸序列。另外，本发明的多肽及其功能片段的功能变体也包括在本发明范围之内。所述本发明的多肽及其功能片段的功能变体保留与所述亲本多肽或亲本功能片段基本相似、相同、甚至是增强的生物活性，例如，抑制FAS的转录和表达，以及有效地抑制肿瘤细胞的生长和増殖。參照所述亲本多肽或其功能片段，所述功能变体可以与所述亲本多肽或其功能片段的氨基酸序列至少有约50%、60%、70%、80%、90%、95%或100%的同一性。优选地，本发明的多肽及其功能片段的功能变体包含与所述亲本多肽或其功能片段具有至少80%，或90%，或95%，甚至更高的序列同一性。更优选的，本发明的多肽及其功能片段的功能变体包含与所述亲本多肽及其功能片段只有一个或数个氨基酸的区別。最优选地，本发明的多肽及其功能片段的功能变体包含与所述亲本多肽或亲本功能片段只有一个氨基酸的区别。所述本发明的多肽及其功能片段的功能变体可以包括由亲本多肽或亲本功能片段氨基酸通过置换得到的氨基酸序列。例如，它们可以包含具有至少ー个保守氨基酸置換的亲本多肽或亲本功能片段氨基酸序列。具体来说，所述本发明的多肽及其功能片段的功能变体可以包含具有I个、2个、3个、4个、5个、或更多个保守氨基酸置换的亲本多肽或亲本功能片段的氨基酸序列。另外，所述本 发明的多肽及其功能片段的功能变体也可以包含具有至少ー个非保守氨基酸置换的亲本多肽或亲本功能片段的氨基酸序列。具体来说，可以包括具有I个、2个、3个、4个、5个、或更多个非保守氨基酸置换的亲本多肽或亲本功能片段的氨基酸序列。在这些情形中，对于所述的氨基酸置換，优选的是不妨碍或抑制所述功能变体的生物学功能或活性。更优选地，所述氨基酸置换提高本发明的多肽及其功能片段的功能变体的生物学功能或活性，以致当与所述亲本多肽或亲本功能片段相比较时，所述功能变体的生物学功能或活性提高。优选地，本发明的多肽及其功能片段的功能变体包括ー个或数个保守氨基酸置换。在本领域内，保守氨基酸置换是公知的，它指的是这样的氨基酸置換，即，其中ー个具有某种物理和/或化学特性的氨基酸被换为另ー个具有相同化学或物理特性的氨基酸。本领域技术人员了解，保守性的氨基酸置換可以不造成蛋白质的结构或功能的显著改变。典型的保守性置换包括，例如，用酸性氨基酸置换另ー个酸性氨基酸(例如，Asp或Glu)，用具有非极性侧链的氨基酸置換另ー个具有非极性侧链的氨基酸(例如，Ala，Gly, Val, He, Leu,Met, Phe, Pro, Trp，Val，等)，用碱性氨基酸置換另ー个碱性氨基酸(Lys，Arg,等)，用具有极性侧链的氨基酸置换另ー个具有极性侧链的氨基酸(Asn, Cys, Gin, Ser, Thr, Tyr,等),用芳香氨基酸(Trp，Phe，Tyr，等)置換另ー个芳香氨基酸，等。所述功能变体还可以通过在所述多肽及其功能片段的中间、其氨基或羧基端、和/或其氨基以及羧基两端，添加和/或缺失ー个或多个氨基酸而得到。优选地，所述添加或缺失的氨基酸不妨碍所述多肽或功能片段的生物学功能和活性，例如，抑制FAS的转录和表达，并有效地抑制肿瘤细胞，包括肝癌细胞的生长和増殖。更优选地，当与所述亲本多肽的生物学活性相比较时，所述额外的氨基酸能够导致增强的生物学活性。另外，本发明的多肽及其功能片段的功能变体还可以包括本发明的多肽或其功能片段的逆反类似物。本发明中，“逆反类似物”是指包括反转的亲本多肽氨基酸序列的多肽，以致所述逆反类似物的氨基酸序列(当从N端向C端读取时)与当从C端向N端读取时的亲本多肽的氨基酸序列相同。此外，关于逆反类似物，每ー个氨基酸是该氨基酸的D异构体，D异构体与L异构体相反。例如，三肽Val-Ala -Gly的逆反类似物具有氨基酸序列Gly-Ala-Val，其中每个氨基酸是D异构体。本发明中，所述功能变体优选包括SEQ ID NOI的逆反类似物。本发明的多肽、其功能片段或功能变体可以是任意长度的，S卩，可以包括任意数目的氨基酸，条件是所述多肽(包括功能片段)及其功能变体保留必要的生物学活性，例如，抑制FAS的转录和表达，以及有效地抑制癌细胞，优选是肝癌细胞。举例来说，本发明的多肽(包括功能片段和功能变体)可以是4-2000个氨基酸长，如长度为5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，18，20，25，30，40，50，60，70，80，90，100，125，150，175，200，300，400，500，700，800，1000或更多。优选地，本发明的多肽长度在30个氨基酸以内，且能满足作为多肽药物的药效学和半衰期的要求。在本发明的ー些具体实施例中，本发明提供的多肽具有与如SEQID N0:1所示的氨基酸序列具有一个或数个氨基酸不同的氨基酸序列，包括，例如，I个、2个、3个、4个、5个氨基酸的区別。这些氨基酸序列可以通过，例如，在SEQ ID NO :1的端侧或中间添加或缺失一个或数个氨基酸残基，或者将SEQ ID NO :1中的某个或某数个氨基酸残基进行替换等方法获得。这样所获得的功能变体具有与亲本多肽SEQ ID NO: I相似的生物学活性和功能，例如，抑制FAS的转录和表达，以及有效地抑制肿瘤细胞，包括肝癌细胞。优选地，这些功能变体可以通过在亲本多肽SEQ ID NO : I的端侧添加一个氨基酸，或将亲本多肽SEQID N01中的某个氨基酸进行保守置換得到。在本发明的ー个特定的实施例中，本发明提供的多肽包括如SEQ ID NOs :1-6所示的氨基酸序列中的任一种氨基酸序列。本发明还提供所述多肽(包括其功能片段和功能变体)的模拟物。在一个优选的 实施方案中，所述肽模拟物是拟肽。拟肽是指这样的肽模拟物，其中每个氨基酸的侧链粘附在氨基酸的氮原子上而不是α碳上。例如，拟肽可以被视为N-置換的甘氨酸，其具有NRCH2C0通用结构的重复单位，并且其具有与相对应的多肽相同或基本相同的氨基酸序列。在另ー个优选的实施方案中，所述肽模拟物包括改变的主链，其中在每个氨基酸之间的键是甲基化的。在这一点上，所述肽模拟物可以包括下述结构的甲基化肽主链
...NCH3 - Ca- CO - NCH3 - Ca- CO...
II
侧链侧链本发明的多肽(包括其功能片段和功能变体)以及肽模拟物中，可以包括用合成的氨基酸来置换天然存在的氨基酸。所述合成的氨基酸在本领域内是已知的，包括，例如，氨基环己烷羧酸、正亮氨酸、a-氨基正癸酸、高丝氨酸、S-こ酰氨基甲基-半胱氨酸、反式-3-羟脯氨酸、反式-4-羟脯氨酸、4-氨基苯丙氨酸、4-苯甲酰苯丙氨酸、4-硝基苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、4-羧基苯丙氨酸、苯基丝氨酸、羟基苯丙氨酸、苯基甘氨酸、a -萘基丙氨酸、环己基丙氨酸、环己基甘氨酸、ニ氢吲哚-2-羧酸、1，2，3,4-四氢异哇琳-3-羧酸、氨基丙ニ酸、氨基丙ニ酸单酞胺、N’ -苄基-N’ -甲基-赖氨酸、N'，N' - ニ苄基-赖氨酸、6_羟基赖氨酸、鸟氨酸、a-氨基环戊烷羧酸、a-氨基环己烷羧酸、a-氨基环庚烧羧酸、a-(2_氨基-2-降冰片烧)-羧酸、a, Y - ニ氨基丁酸、α, β - ニ氨基丙酸、高苯丙氨酸、和a-叔-丁基甘氨酸。本发明的多肽(包括其功能片段和功能变体)以及肽模拟物还可以，例如，被脂化(例如，脂肪酸化)、糖基化、酰胺化、羧酸化、磷酸化、酷化、N-酰化、通过ニ硫键环化、转化成酸加成盐、ニ聚体化或多聚体化，和/或缀合化。举例来说，本发明所述多肽(包括其功能片段和功能变体)以及肽模拟物可以是脂化衍生物。所含的脂质分子可以包括本领域已知的任何脂质，例如，脂肪酸，磷脂基团，糖磷脂酰肌醇，磷脂酰丝氨酸，磷脂酰こ醇胺，鞘磷脂，磷脂酰胆碱，心磷脂，磷脂酰肌醇，磷脂酸，溶血磷酸甘油酷，和胆固醇基团。优选地，所述脂化衍生物是脂肪酸衍生物，所述脂肪酸分子可以是任何C8-C20脂肪酸，例如，月桂酸、棕榈酸、肉豆蘧酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、芥酸、或花生酸等。所述脂肪酸还可以在任意碳原子上任选地包含其他官能团，例如，一个或多个氨基。所述脂肪酸分子可以附着在本发明多肽(包括功能片段和功能变体)以及肽模拟物的任何适当的部分。例如，在本发明的多肽氨基端、羧基端、或氨基和羧基两端包括脂肪酸分子。脂肪酸分子可以直接或通过连接体附着到本发明的多肽(包括功能片段和功能变体)以及肽模拟物上。本发明的多肽(包括功能片段和功能变体)以及肽模拟物，包括其衍生物例如脂肪酸衍生物，还可以是单体肽、二聚肽或多聚体肽。本发明的多肽(包括功能片段和功能变体)以及肽模拟物可以通过本领域技术人员已知的方法获得(参见，例如，Chan等,Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis,牛津大学出版社，牛津，英国，2005 ;Reid, R. , Peptide and Protei n Drug Analysis, Marcel DekkerCompany, 2000 ；以及美国专利号5，449，752)。此外，也可由核酸重组方法生产多肽而得到(参见，例如，Sambrook等，分子克隆实验室手册(Molecular Cloning A LaboratoryManual),第3版,冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press),冷泉港,纽约,2001)。此外，本发明的一些多肽(包括其功能片段以及功能变体)可以从如植物、细菌、昆虫、哺乳动物如大鼠、人等分离和/或纯化。分离和纯化的方法在本领域内也是公知的。备选地，本文所述的多肽(包括其功能片段以及功能变体)可以从商业公司合成后购买获得。多核苷酸本发明还提供编码任一种所述的本发明多肽(包括其功能片段和功能变体)的分离的多核苷酸。所述多核苷酸包含编码任一种本发明多肽(包括其功能片段和功能变体)编码序列。例如，本发明提供编码SEQ ID NO :1的核苷酸序列SEQ ID NO :7，以及这些编码序列的任一种简并变异体；备选地，所述多核苷酸还可以包含附加编码序列和/或非编码序列。同样，本发明也提供编码如SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列的功能片段或功能变体的多核苷酸，这些多核苷酸也还可以包含附加编码序列和/或非编码序列。另一方面，本发明还提供这样的分离的多核苷酸或其片段，其所包含的核苷酸序列与前述的任一种多核苷酸的核苷酸序列互补或能在严格条件下与其杂交。本发明还提供上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明多肽(包括功能片段和功能变体)有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的功能片断、功能变体。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功倉泛。本发明的多核苷酸可以是天然存在通过纯化而得到，也可以通过重组产生，或者可以基于化学合成/或酶连接反应，使用本领域已知的方法而构建。本发明的多核苷酸可以含有天然存在的核苷酸，也可以包含具有修饰的核苷酸。所述具有修饰的核苷酸设计成增加分子的生物学稳定性或增加在杂交时形成的双链体的物理稳定性(例如，硫代磷酸衍生物和吖啶置换的核苷酸)，包括，例如，5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、尿嘧啶-5-羟基乙酸、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫胞嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-羟基乙酸甲基酯、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、和2，6-二氨基嘌呤等。并且，其可以包含天然的或改变的核苷酸之间的键，诸如氨基磷酸酯键或硫代磷酸酯键，用来代替天然存在的磷酸二酯键。优选的，本发明的核酸是重组产生的。重组表达载体本发明还提供包括任一种本发明多核苷酸的重组表达载体。所述重组表达载体可以是任何适当的重组表达载体，并且可以用于转化或转染任何适当的宿主细胞。适当的载体包括设计用于繁殖和扩增或用于表达，或同时用于二者，如质粒或病毒。所述载体可以通过下列自由组合pUC系列、pcDNA系列，pBluescript、pET系列、pGEX系列和pEX系列。还可以使用噬菌体载体，诸如AGT10、AGTlU AZaPII, AEMBL4等。植物表达载体可以包括pBIOl、pBIlOl. 2、pBIlOl. 3、pBI121 和 pBIN19。动物表达载体可以包括 pEUK-Cl、pMAM 和pMAMneo。优选地,本发明提供pcDNA系列的质粒。可以使用标准重组DNA技术制备本发明的重组表达载体。可以制备环形的或线性的表达载体构建体，以包含在原核或真核宿主细胞中起作用的复制系统。理想地，所述重组·表达载体包括调控序列，诸如转录和翻译起始与终止密码子。所述调控序列对于所述载体所引入的宿主类型(例如，细菌、真菌、植物、或动物)是特异性的。所述重组表达载体可以包括一种或多种标记基因，其允许选择转化的或转染的宿主。标记基因包括对杀生物剂的抗性，例如，对抗生素、重金属等的抗性，在营养缺陷型宿主中互补以提供原养型，以及催化生物荧光等等。对于本发明表达载体合适的标记基因包括，例如，新霉素/G418抗性基因、荧光酶素报告基因、潮霉素抗性基因、组氨醇抗性基因、四环素抗性基因、和氨苄青霉素抗性基因。所述重组表达载体可以包括天然的或非天然的启动子。启动子的选择，例如，强、弱、诱导型、组织特异型和发育特异型的，在技术人员的普通技能之内。相似地，核苷酸序列与启动子的组合也在技术人员的技能之内。启动子可以是非病毒启动子或病毒启动子，例如，巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40启动子、RSV启动子、以及在鼠干细胞病毒长末端重复中存在的启动子。本发明的重组表达载体可以设计用于瞬时表达、用于稳定表达、或用于二者。此外，所述重组表达载体可以制备成用于组成型表达或用于诱导型表达。此外，所述重组表达载体可以包括自杀基因。“自杀基因”是指在细胞中表达后导致细胞死亡的基因。自杀基因表达后可影响细胞对某种试剂如药物的敏感性，进而引起细胞死亡。自杀基因在本领域内是已知的(参见，例如，自杀基因治疗方法和综述(SuicideGene Therapy Methods and Reviews), Springer, Caroline J. (Cancer Research UKCentre for Cancer Therapeutics at the Institute of Cancer Research. Sutton,Surrey, UK), Humana Press，2004)，例如单纯疤疹病毒(HSV)胸苷激酶(TK)基因和嘌呤核苷磷酸酶，以及硝基还原酶等。宿主细胞本发明还提供包括本文所述的任何一种重组表达载体的宿主细胞。宿主细胞是包含本发明重组表达载体的任何类型的细胞。宿主细胞可以是真核细胞，例如，植物、动物、真菌、或藻类，或者可以是原核细胞，例如，细菌或原生动物。宿主细胞可以是培养的细胞或原代细胞，即，直接从生物体如人分离的原代细胞。宿主细胞可以是贴壁细胞或悬浮的细胞，SP，在混悬液中生长的细胞。适当的宿主细胞在本领域内是已知的，包括，例如，DH5a大肠杆菌细胞、中国仓鼠卵巢细胞、猴VERO细胞、COS细胞、HEK293细胞，等等。为了扩增或复制所述重组表达载体的目的，所述宿主细胞优选是原核细胞。为了产生重组修饰的多肽或蛋白的目的，宿主细胞优选是哺乳动物细胞。人源细胞为优选的宿主细胞。宿主细胞可以是任何细胞类型，可以来自任何类型的组织，并且可以是任何发育阶段的。本发明还提供包括至少一种本文所述的宿主细胞的细胞群体。所述细胞群体可以是异种群体，包括包含任一种所述重组表达载体的宿主细胞，以及至少一种其它细胞，例如，不包含任何所述重组表达载体的宿主细胞(例如，T细胞)，或除T细胞之外的细胞，例如，B细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、红细胞、肝细胞、内皮细胞、上皮细胞、肌细胞、脑细胞，等等。备选地，所述细胞群体可以是基本同种群体，其中所述群体主要包括包含所述重组表达载体的宿主细胞(例如，主要由包含所述重组表达载体的宿主细胞组成)。所述群体还可以是细胞的克隆群体，其中所述群体的所有细胞是包含重组表达载体的单一宿主细胞的克隆，以致该群体的所有细胞包含所述重组表达载体。在本发明的一个实施方案中，所述细胞群体是包括包含本文所述的重组表达载体的宿主细胞的克隆群体。 缀合物本发明还包括缀合物，例如，生物缀合物，其包括本发明的多肽(包括其功能片段和功能变体)以及肽模拟物、多核苷酸、重组表达载体、或宿主细胞中的任一种。缀合物，以及通常合成缀合物的方法在本领域内也是已知的(参见，例如，Hudecz, F.，分子生物学方法(Methods Mol. Biol. )298 :209-223 (2005)和 Kirin 等，无机化学(Inorg. Chem.) 44 (15)5405-5415(2005))。药物组合物本发明所提供的上述各种物质，包括多肽(包括其功能片段和功能变体)以及肽模拟物、脂肪酸衍生物、多核苷酸、重组表达载体、以及宿主细胞(包括其群体)、缀合物等(笼统称为“本发明物质”)可以是分离的、纯化的、合成的、和/或重组的。本发明物质还可以配制成组合物，诸如药物组合物。在这一点上，本发明提供包括任意所述多肽(包括功能片段和功能变体)以及肽模拟物、脂肪酸衍生物、缀合物、核酸、重组表达载体和宿主细胞(包括其群体)，以及药用载体的药物组合物。包含任意本发明物质的本发明药物组合物可以包括多于一种本发明物质，例如多肽和核酸，或两种或更多不同的多肽。备选地，所述药物组合物可以包括与另一种或多种药物活性试剂或药物的组合。所述另一种或多种药物活性试剂或药物优选可以包括诸如化疗剂，例如，天冬酰胺酶，白消安，卡钼，顺钼，柔红霉素，多柔比星，氟尿嘧啶，吉西他滨，羟基脲，甲氨蝶呤，紫杉醇，利妥昔单抗，长春喊，长春新喊，等等。关于药物组合物，药用载体可以是任意常规所用的那些，它们可以仅通过化学物理因素，诸如溶解性和缺乏与活性化合物的反应性，以及通过施用的途径，并进行限定。本发明所述的药用载体，例如，媒介物、佐剂、赋形剂和稀释剂等，是本领域技术人员公知的，并且容易为公众所获得。优选地，所述药用载体对活性试剂是化学惰性的，在使用条件下不具有有害副作用或毒性。为了达到本发明的目的，施用的本发明物质的量或剂量应该在合理时间范围内在受试者或动物内产生例如治疗或预防响应。例如，本发明物质的剂量应该足以在从施用时亥Ij起约I小时以上如12-24小时或更长的时间期间内，抑制患病细胞的增殖，起到治疗或预防疾病(例如肿瘤等)的作用。在某些实施方案中，所述时间期间甚至可以更长。剂量应该由特定的本发明物质的功效和待治疗的动物(例如，人)的状况，以及动物(例如，人)的体重所确定。确定施用剂量的许多测定方法是本领域内已知的。本领域普通技术人员应该容易理解，本发明物质可以以任何方式修饰，以提高本发明物质的治疗或预防功效。例如，本发明物质可以直接或通过连接体间接与靶向的部分缀合。使化合物，例如，本发明物质，与靶向部分缀合的实践，在本领域内是公知的(参见，例如，美国专利号5，087，616)。在另一个实施方案中，本发明物质可以被修饰成贮存库形式，以便使本发明物质释放到其所施用的体内的方式在时间和体内部位方面受到控制(参见，例如，美国专利号4，450，150)。本发明物质的贮存库形式可以是，例如，包括本发明物质和多孔或非多孔物质如聚合物的可植入组合物，其中本发明物质通过所述物质和/或所述非多孔物质的降解而扩散。然后，将贮存库植入体内的理想部位，并且本发明物质以预先确定的速率从所述植入物释放。本领域技术人员应该理解，本发明提供的防治肿瘤，脂肪肝或肥胖的方法，包括使患病细胞与具有有效抑制量的本发明所述的任意药物组合物接触。可以采用任意常规的方 法将本发明所述药物组合物传递给患病细胞。在本发明方法的一个优选的实施方案中，将所述药物组合物通过局部施用给宿主。在另一个优选的实施方案中，所述药物组合物直接施用到患病细胞，例如，对于肿瘤细胞采取肿瘤内递送。本发明的药物组合物，包含多肽(包括功能片段和功能变体)以及肽模拟物、核酸、重组表达载体、和/或宿主细胞，可以用在防治肿瘤，脂肪肝和肥胖等病症的方法中。本领域普通技术人员应该容易理解，本发明所述的上述病症可以存在于任何宿主中。优选地，所述宿主是哺乳动物。特别优选地，所述宿主是人。下面结合具体实施例，对本发明作进一步的阐述说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不在于限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。实施例一多肽的设计和制备人工合成多肽功能片段Anti-FAS_P18 本发明用人工合成的方法合成了氨基酸序列为Gly-Gly-Cys-Arg-His-Lys-Leu-Val-Cy s-Ala-Pro-Ala-Pro-Cy s-Asn-Phe-Phe-Thr (SEQ ID NO :1)的多妝(以下称Anti-FAS-P18)。该多肽的制备采用固相合成方法，如应用AAPPTECApex396型多肽合成仪器(购自香港环球分析测试仪器有限公司)，在密闭的防爆玻璃反应器中使氨基酸按SEQID NO 1所示的序列，从C端-羧基端向N端-氨基端，这是指第一个被加入到该氨基酸序列 Gly-Gly-Cys-Arg-His-Lys-Leu-Val-Cys-Ala-Pro-Ala-Pro-Cys-Asn-Phe-Ph e_Thr 的氨基酸单体是C末端的Thr，然后再是Phe，再是Phe，一直到最后的Gly以及N末端的Gly，不断添加、反应、合成、操作，最终得到所要的氨基酸序列。固相合成法，大大的减轻了每步产品提纯的难度。为了防止副反应的发生，参加反应的氨基酸的侧链都是受保护的。羧基端是游离的，并且在反应之前必须活化。具体合成由下列几个循环组成I)去保护Fmoc保护的柱子和单体必须用一种碱性溶剂(piperidine)去除氨基的保护基团。2)激活和交联下一个氨基酸的羧基被一种活化剂所活化。活化的单体与游离的氨基反应交联，形成肽键。在此步骤使用大量的超浓度试剂驱使反应完成。循环这两步反应反复循环直到合成完成。3)洗脱和脱保护多肽从柱上洗脱下来，其保护基团被一种脱保护剂(TFA)洗脱和脱保护。从C端(羧基端)向N端(氨基端)合成,把C端的第一个氨基酸Gly固定在树脂上，脱去Gly氨基酸的保护基团，并活化下一个氨基酸Arg的羧基端，使之发生缩和反应，以此类推到合成完最后一个氨基酸后，从树脂上切割下来，粗肽经HPLC纯化，获得98%纯度的Anti-FAS-P18，最后通过质谱做进一步的鉴定，其分子量为1921. 6Kd。在固相合成中，肽链的延长是在不溶性的聚苯乙烯树脂载体上进行的。合成多肽的C-末端先和氯甲基聚苯乙烯树脂(氯化苄酯树脂)反应形成苄酯，然后按肽链一级结构的顺序将氨基端已被保护的氨基酸逐个加上去，使肽链延长。人工合成多肽Anti-FAS_P18用高压液相色谱(HPLC)(应用PLCAgela C18柱)分析，显示所获得的纯度为98. 11% (图I)。 实施例二 离体(in vitro)多肽的抗FAS活性采用两种方法检测离体情况下实施例一中的多肽的抗FAS的活性第一种方法是采用分子克隆技术，将表达实施例一中的多肽的cDNA克隆进真核表达载体pcDNA3. 1(+)上，通过基因转染，在肝癌细胞内实现表达所研究多肽的目的，进而观察所研究的多肽抑制FAS的效果；第二种方法是采用人工合成的多肽，直接加入到培养肝癌细胞的培养液中，观察多肽抑制FAS的效果。实验中采用的细胞为肝癌H印G2细胞。由于SREBP-Ic为FAS的上游转录调控因子，通过荧光素酶报告基因检测方法，在分子水平检测SREBP-Ic的启动子活性是否受到抑制，可反映FAS的基因转录情况。同时，检测FAS启动子活性，可直接反映FAS的转录是否受到抑制；核因子B(nuclear factor B，NF_B)是一个重要的转录因子。NF-B启动子活性增强意味着细胞增殖加快。因此，检测NF-B启动子的活性，可反映细胞增殖情况。因此，通过NF-B启动子活性检测和3-(4，5-二甲基-2-噻唑)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)检测实施例一中的多肽对上述HepG2细胞增殖的影响。A.多肽真核表达载体的构建I.主要材料I)菌株E. coli DH5a (购自原平皓(天津)生物技术有限公司)质粒pcDNA3.I (+)(购自 Invitrogen), pEGFP_C2 (购自 Invitrogen)2.主要试剂试剂名称来源(公司名称，地址)琼脂糖Solarbio，中国北京质粒小提试剂盒Transgen,中国北京氨苄青霉素BBI，美国波士顿生物技术公司胰蛋白酶BBI，美国波士顿生物技术公司胰蛋白胨Promega，美国酵母提取物Promega，美国EcoRI内切酶Takara，中国大连XhoI内切酶Takara，中国大连rTaq酶Takara,中国大连T4DNA连接酶Takara,中国大连_^_BBI,美国波士顿生物技术公司3.主要溶液配制I) LB液体培养基·
胰化蛋白胨2.0g
酵母提取物l.Og
NaCl2.0g
加双蒸水溶解定容至200mlI. 03 X IO5Pa 蒸汽灭菌 20min。2) LB固体培养基
胰化蛋白胨2.0g
酵母提取物l.Og
NaCl2.0g
琼脂粉3.0g
双蒸水溶解定容至200mlI. 03 X IO5Pa 蒸汽灭菌 20min。3) 10mg/ml 溴化乙锭溴化乙锭 0.2g双蒸水20ml工作液0.5ug/ml4) TBE电泳缓冲液5 X贮存液Tris 碱54 g
硼酸27.5 g
0.5 mol/L EDTA (pH 8.0)20 ml
加双蒸水定容至1000 ml4.退火体系
权利要求
1.分离的多肽或肽模拟物，其包含如SEQID NO :1所示的氨基酸序列、或其功能片段或功能变体，所述多肽或肽模拟物具有抑制脂肪酸合成酶的功能，并能抑制肿瘤、脂肪肝和肥胖的发生和发展。
2.权利要求I所述的多肽或肽模拟物，所述肿瘤包括肝癌。
3.权利要求I所述的多肽或肽模拟物，其包含与SEQID NO: I所示的氨基酸序列具有至少80 %的相同性的氨基酸序列。
4.权利要求I所述的多肽或肽模拟物，其包含与SEQID NO :1所示的氨基酸序列具有至少90 %的相同性的氨基酸序列。
5.权利要求I所述的多肽或肽模拟物，其包含与SEQID NO :I所示的氨基酸序列具有至少95 %的相同性的氨基酸序列。
6.权利要求I所述的多肽或肽模拟物，其包含由SEQID NO: I所示的氨基酸序列经过一个氨基酸的保守置换或在其端侧添加或缺失一个氨基酸而得到的氨基酸序列。
7.权利要求I所述的多肽或肽模拟物，其包含如SEQID NOs :1-6中所示的任一种氨基酸序列。
8.分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含选自下组中的一种 a)编码SEQID NO 1所示的氨基酸序列、或其功能片段或功能变体的多核苷酸；或者 b)与多核苷酸a)互补或严格杂交的多核苷酸。
9.权利要求8的多核苷酸,所述多核苷酸包含选自下组中的一种 a)编码SEQID NOs :1_6所示的任一种氨基酸序列的多核苷酸；或者 b)与多核苷酸a)互补或严格杂交的多核苷酸。
10.重组表达载体,其包含权利要求8或9所述的多核苷酸。
11.包括如权利要求10所述的重组表达载体的宿主细胞。
12.权利要求1-7中任一所述多肽在制造抗肿瘤、脂肪肝和肥胖的药物中的应用。
13.权利要求8-9中任一所述核苷酸在制造抗肿瘤、脂肪肝和肥胖的药物中的应用。
14.权利要求10中所述重组表达载体在制造抗肿瘤、脂肪肝和肥胖的药物中的应用。
15.药物组合物，其包含权利要求1-7中任一所述的多肽或肽模拟物，以及任选的药物载体。
16.药物组合物，其包含权利要求8-9中任一所述的多核苷酸，以及任选的药物载体。
17.药物组合物，其包含权利要求10中所述的重组表达载体，以及任选的药物载体。
全文摘要
本发明涉及多肽药物领域，具体涉及抗脂肪酸合成酶(FAS)的多肽和编码此多肽的多核苷酸，以及它们的应用。具体来说，本发明涉及一种具有抑制脂肪酸合成酶转录和表达的多肽，其在分子水平、细胞水平和动物整体水平上具有抑制脂肪酸合成酶转录和表达的作用，因而能抑制脂肪酸合成酶的过表达。该多肽和它的肽模拟物，包括它们的功能片段和功能变体，以及编码这些多肽、肽模拟物或它们的功能片段、功能变体的基因，可广泛用于防治肿瘤例如肝癌和脂肪肝及肥胖等与脂肪酸合成酶代谢密切相关的疾病。
文档编号C12N1/19GK102746378SQ201110102020
公开日2012年10月24日 申请日期2011年4月22日 优先权日2011年4月22日
发明者叶丽虹, 张晓东 申请人:天津托普泰克生物科技有限公司