专利名称：在植物腺毛特异表达的dbr2基因启动子的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基因工程技术领域的基因启动子，具体是一种在植物腺毛特异表达的DBR2基因启动子。
背景技术：
青蒿(Artemisia annua L.)是菊科蒿属的一年生草本植物。青蒿素是从其地上部分分离出的一种含有过氧桥结构的倍半萜内酯化合物，是目前世界上公认的最有效的治疗疟疾药物，特别是对脑型疟疾和抗氯喹疟疾更加有效。目前，世界卫生组织推荐的最有效的治疗疟疾的方法就是青蒿素联合疗法(ACTs)。另外，随着对青蒿素药理研究的逐步深入，科学家发现青蒿素及其衍生物还具有抗炎、抗血吸虫、抗肿瘤以及免疫调节的功能，可见青蒿素是一种极具潜力的天然药物。目前青蒿素的主要来源是从青蒿植株的地上部分提取，然而青蒿中青蒿素的含量非常低，为O. 01 % -I %，低含量使得青蒿素的大规模商业化生产受到了限制。由于青蒿素结构复杂，人工合成难度大、产量低、成本高，因此人工生产缺乏可行性。也有人尝试用组织培养和细胞工程的方法来生产青蒿素，然而青蒿素在愈伤组织中的含量低于干重的O. 1%，在芽中含量最高也只有干重的O. 16%，大多数研究没有检测到青蒿素。因此，利用组织培养及细胞工程来生产青蒿素的也不具备可行性。Dahua Chen等在《PlantScience))(植物科学)2000 年 155 期 179-185 页发表了题为 “Expression of a chimericfarnesyl diphosphate synthase gene in Artemisia annua L. transgenic plants viaAgrobacterium tumefaciens-mediated transformation，，(通过农杆菌介导转化在青蒿植株中表达法尼基焦磷酸合酶基因)的论文，文中评述，通过过量表达法尼基焦磷酸合酶(farnesyl diphosphate synthase,FPS)可在原有基础上提高青蒿素含量2倍_3倍,达到1%左右。DBR2是从青蒿腺毛特异cDNA文库中分离出的一个编码DBR2酶的基因。随着青蒿素生物合成途径的逐渐清晰，采用基因工程手段提高青蒿中青蒿素含量具有非常大的潜力，例如过量表达代谢途径中的青蒿素合成途径关键酶编码基因被证实是一种提高青蒿素含量的有效方法。在青蒿基因工程研究中，目前所采用的启动子大多数是组成性的启动子，例如烟草花叶病毒35S启动子(CaMV35)。这种启动子能够驱动外源基因在所有的组织和器官中表达，可能会对植物的正常生长造成一定的负担和危害。由于腺毛不是植物生长所必需的，利用腺毛特异表达的启动子对植物的腺毛系统进行遗传操作不会对植物的生长发育造成危害。先前的研究表明DBR2基因在青蒿腺毛中大量表达，而在其它组织中表达量很低，这暗示DBR2的启动子很可能是腺毛特异表达的启动子。因此，克隆DBR2基因的启动子对利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种具有重要意义。克隆其启动子将为研究DBR2基因的表达调控、分析启动子上的顺式作用元件奠定基础
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种在植物腺毛特异表达的DBR2基因启动子。本发明的基因启动子能引导基因在转基因植物腺毛中特异表达。本发明是通过以下技术方案实现的本发明涉及在植物腺毛特异表达的DBR2基因启动子，该启动子具有序列表中SEQID NO. I的1520bp的核苷酸序列。所述DBR2基因启动子能引导基因在植物腺毛中特异表达。所述DBR2基因启动子能在利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种中应用。所述的在植物腺毛特异表达的DBR2基因启动子，其制备方法如下 步骤一，培养青蒿无菌苗；步骤二，采用CTAB法提取青蒿总DNA ；步骤三，Genomic DNA Walking法克隆启动子基因组序列；步骤四，分析启动子上的顺式作用元件；步骤五，DBR2基因启动子的载体构建；步骤六，根癌农杆菌介导DBR2基因启动子转化青蒿；步骤七，启动子所引导的gus报告基因在植株中的表达部位的确定。本发明的有益效果本发明克隆得到的DBR2基因启动子，可以特异性地在腺毛组织启动并高效表达外源基因，能应用于利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种中。本发明涉及的根癌农杆菌EHA105已在《黄亚丽，蒋细良，田云龙，郭萍，朱昌雄；根癌农杆菌介导的哈茨木霉菌遗传转化的研究，中国生物工程杂志，2008，28 (3) :38-43》文献中公开。根癌农杆菌EHA105可通过公开市售的商业渠道取得，如可以从澳大利亚CAMBIA公司购得，菌株编号为Gambarl。
图I为Genomic DNA Walking法克隆启动子基因组序列时的凝胶电泳结果。图2为5’端启动子与gus基因融合的植物双元表达载体示意图。图3为启动子所引导的gus报告基因在植株中的表达部位的确定；图中A为没有进行GUS组织染色得青蒿叶片出为非转基因的青蒿植株的对照组，取其叶片进行GUS组织染色；C为利用DBR2基因启动子同gus基因融合的载体转化青蒿后，PCR检测为阳性的青蒿植株，所获得的转基因青蒿中的⑶S组织染色。A、B、C图中黑色箭头所指示的为腺毛。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如 Sambrook 等分子克隆实验室手册见 New York Cold Spring Harbor LaboratoryPress的1989年版中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。实施例
步骤一，培养青蒿无菌苗青蒿种子用75% (v/v)乙醇浸泡lmin,再用20% (w/v)NaC10浸泡20min后，无菌水冲洗3次-4次，用无菌吸水纸吸干表面水分，接种于无激素的MS固体培养基上，250C、16h/8h(light/dark)光照培养(14天)，即可获得青蒿无菌苗。步骤二，CTAB法小量抽提青蒿叶片总DNA取约IOOmg 叶片于 I. 5mT,FP 管中，加入预热的 CTAB buffer 600 μ L, buffer 中含2% (v/v)的β-巯基乙醇，用研磨棒将叶片研磨至无明显颗粒；将EP管置于65°C水浴45min，使细胞充分裂解。待溶液冷却后，加入等体积￠00 μ L) 24 I (v/v)的氯仿异戊醇，混勻，静置5min,25°C、13000rpm离心IOmin ;吸取上清液约500 μ L于新的干净的离心管中，加入等体积24 I (v/v)的氯仿异戍醇,混勻，静置5111；[11,251€、13000印1]1离心10111；[11;吸取上清液约400 μ L于新的干净的离心管中，加入一滴3Μ醋酸钠溶液，然后加入等体积预冷的异丙醇混匀，_20°C静置约30min后，25°C、13000rpm离心IOmin ;弃上清液，用75% (v/V)乙醇冲洗沉淀所得DNA—次，离心后，吸干上清，通风橱中晾干。将DNA溶解在40μ L水 中，-20°C保存。步骤三，Genomic DNA Walking法克隆启动子基因组序列由于TAIL-PCR只扩增出较小片段，本研究采用Genomic DNA Walking进一步分离DBR2基因5’侧翼序列。Genomic DNA Walking的方法参照基因组WalkerTM UniversalKit (Clontech, 638904)的说明书。具体步骤如下①基因组酶切采用3种平末端的限制性内切酶DraI、EcoRV和StuI分别对青蒿基因组DNA进行酶切。反应体系如表I :表I限制性内切酶体系
Genomic DNA(O. I μ g/μ L)25 μ L
限制性内切酶(10units/uL)8μΙ~
限制性内切酶buffer10 μ L
ddH2057 μ L
总体积IOOuL将反应体系轻轻地混匀，于37°C水浴中反应过夜。②加接头三种酶切产物分别进行纯化，用20yL水溶解酶切并纯化的DNA于新的EP管中，分别加入如下反应物25μΜ的基因组Walker Adaptor 1.9yL,1.6yLIOXLigation Buffer, 6units/μ L 的 T4DNALigase 0· 5μ L。混匀后于 16°C PCR 仪中反应过夜；70°C水浴5min终止反应；加入72 μ L水后可用于PCR扩增。③PCR扩增为了提高产物的特异性，采用两轮巢式PCR扩增，Genomic DNAWalking中使用的引物列于表2。其中API和AP2是试剂盒中附带的引物，DBR2PR1和DBR2PR2是根据DBR2基因一段启动子的序列设计的特异引物。首轮PCR反应体系见表3，PCR反应条件为94°C预变性 3min ；94°C 25s，72。。3min，7 个循环；94°C 25s，67。。3min，32 个循环;67°C延伸 7min。凝胶电泳结果见图I。表2Genomic DNA Walking 引物
引物名称引物序列(5’一 3’)
APIGTAATACGACTCACTATAGGGC
权利要求
1.一种在植物腺毛特异表达的DBR2基因启动子，其特征在于，该启动子如SEQ IDNO. I所示。
2.根据权利要求I所述的在植物腺毛特异表达的DBR2基因启动子，其特征是，该启动子能引导基因在植物腺毛中特异表达。
3.一种根据权利要求I所述DBR2基因启动子的应用，其特征在于，该启动子基因工程育种中应用。
4.根据权利要求3所述的DBR2基因启动子的应用，其特征是，所述的基因工程育种中应用是指利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物。
全文摘要
一种基因工程技术领域的DBR2基因启动子，该启动子序列具有序列表中SEQ ID NO.1的1520bp的核苷酸序列；该启动子能引导基因在植物腺毛中特异表达，能在利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种中应用。本发明得到的DBR2基因启动子能引导基因在植物腺毛中特异表达，对利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种具有重要意义。
文档编号C12N15/113GK102757962SQ20111010797
公开日2012年10月31日 申请日期2011年4月28日 优先权日2011年4月28日
发明者唐克轩, 张凯思, 王博石, 陈韵斐 申请人:上海交通大学